不同溶劑對蒙早苦荬菜活性物質提取的影響

意如樂 格根圖 賈玉山 王志軍 郝俊峰 建 原

（1.內蒙古農業大學草原與資源環境學院 農業農村部飼草栽培、加工與高效利用重點實驗室 草地資源教育部重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010019；2.內蒙古自治區林業和草原監測規劃院，內蒙古 呼和浩特 010020）

苦荬菜又稱山萵苣、苦麻菜等，是菊科（Compositae）萵苣屬（Lactuca）草本植物?？噍げ酥泻写罅康拇值鞍住⒋种?、纖維素等[1]。研究表明，苦荬菜鮮嫩多汁，富含黃酮類、脂類、萜類等活性物質，具有清熱解毒、消炎止痛、抗氧化、抗衰老等功效[2-4]。近代醫學證實，苦荬菜對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌以及白血病細胞均具有不同程度的抑制效果[5]?？噍げ怂笠和夥髮Φ秱蜔齻哂幸欢ǖ寞熜?。苦荬菜中含有蠟醇、酒石酸、膽堿等多種成分，味略苦，但經過加工處理，食之別有風味。苦荬菜具有較好的藥理作用以及較高的飼用價值，其粗蛋白含量與紫花苜蓿相近[6]?？噍げ嘶钚晕镔|的提取方法有浸提法、索氏提取法和超聲波/微波輔助有機溶劑提取法等，提取溶劑主要為乙醇和水的混合溶劑。羅偉強等[7]、曾文輝等[8]比較了3種溶劑對苦荬菜莖黃酮類物質提取率，發現水提法提取率最低，而乙醇溶液提取率較高。袁文靜等[9]和石同同等[10]優化了超聲波提取總三萜和總黃酮的工藝條件。但目前對苦荬菜活性成分的提取鑒定以及藥理作用的研究多集中于全株，關于不同部位活性成分的分布特征及時空分布尚未見報道。本研究通過利用不同溶劑提取苦荬菜不同部位活性物質，為苦荬菜活性成分開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蒙早苦荬菜為內蒙古農業大學培育的飼草品種，于2019 年5 月15 日在內蒙古農業大學牧草基地播種，每隔2 d 澆1 次水。2019 年6 月5 日選取大小均勻、新鮮無病蟲害的植株，除根、莖后在陰暗處室溫陰干，粉碎，分別裝入3個自封袋。

1.2 試劑與儀器

Folin-Ciocalteu 試劑、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）、沒食子酸標準品以及蘆丁標準品均購自上海源葉科技有限公司，甲醇、乙酸乙酯、乙醇和六氰基亞鐵酸鉀均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

超聲波清洗器購自德國Elma公司，萬分之一天平購自瑞士Mettler-Toledo公司，粉碎機購自青島微納粉體機械有限公司，紫外分光光度計購自英國Biochrom公司。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 樣品提取

根據本課題組前期進行單因素和正交試驗得到的優化條件[1]，采用超聲波輔助提取技術研究不同溶劑對蒙早苦荬菜中抗氧化性成分的影響。準確稱取1.0 g蒙早苦荬菜不同部位（根、莖、葉）粉末于錐形瓶中，分別加入15 mL 蒸餾水、60%乙醇、乙醇（99.7%）、甲醇和乙酸乙酯混勻，于70 ℃超聲波清洗器中超聲提取30 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液，定容至60 mL，得到濾液于4 ℃保存，每個試驗平行3次。

1.3.2 主要活性物質

1.3.2.1 總黃酮

參照Yi 等[11]的方法測定，略作修改。采用AlCl3-NaOH-NaNO2法，取2.0 mL 不同濃度的蘆丁標準品溶液與0.4 mL 5% NaNO2溶液反應6 min，加入0.4 mL 10% AlCl3溶液搖勻，反應6 min，加入4 mL 4% NaOH溶液和3.2 mL 蒸餾水混勻，在室溫內反應25 min，于紫外分光光度計510 nm處測定吸光度值。

取不同溶劑提取液0.2 mL，加溶劑至2.0 mL，按標準曲線的方法測定不同溶劑樣品提取液中的總黃酮吸光度值為Ai，樣品溶劑代替樣品做空白，蒸餾水代替NaNO2溶液、AlCl3溶液和NaOH 溶液的吸光度值為Aj，3次重復，根據標準曲線得出不同溶劑提取物中的總黃酮質量濃度。標準曲線：y=0.011 5x-0.076 7，R2=0.999 0。

1.3.2.2 總酚

參照Naidu等[12]的方法測定，略作修改。采用Folin-Ciocalteu 法，分別取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 125 mg/L 沒食子酸標準品溶液于10 mL 試管中，加入甲醇至4 mL，分別加入0.5 mL Folin-Ciocalteu 試劑混勻，5 min 后加入1.5 mL 20% NaCO3溶液，蒸餾水定容至10 mL，室溫避光反應30 min，在765 nm處測定吸光度值。

取不同溶劑提取液0.1 mL，加入溶劑至2.0 mL，按標準曲線的方法測定不同溶劑樣品提取液中的總酚吸光度值Ai，樣品溶劑代替樣品做空白，蒸餾水代替Folin-Ciocalteu 試劑測定的吸光度值為Aj，根據標準曲線計算不同溶劑提取液中總酚濃度，3 次重復。標準曲線：y=0.032 6x-0.026 1，R2=0.999 2。

1.3.3 抗氧化性測定

1.3.3.1 DPPH自由基清除力

參照Huang 等[13]的方法測定，略作修改。準確稱取10 mg DPPH 標準品，溶于無水乙醇溶劑中，超聲5 min后充分振蕩，定容于100 mL 的容量瓶中配成0.1 g/L DPPH 儲備液，置于冰箱保存。取2 mL 不同質量濃度（1.0～4.0 g/L）的樣品提取液，分別加入0.1 g/L 的2 mL DPPH 溶液，搖勻，在黑暗處放置30 min，于517 nm 處測定其吸光度值，計算DPPH 自由基清除率，并用SPSS分析軟件計算其半抑制濃度（IC50）。

1.3.3.2 羥自由基消除能力

參照Aidi 等[14]的方法測定，略作修改。在試管中依次加入一定質量濃度的FeSO4溶液以及不同濃度的樣品提取液和過氧化氫溶液、水楊酸溶液，在波長510 nm處測定其吸光度，根據標準曲線計算羥自由基清除率。

1.3.3.3 還原能力

參照Juntachote 等[15]和Terpinc 等[16]的方法測定，略作修改。將不同質量濃度（1.0～4.0 g/L）的樣品提取液1 mL 與磷酸鹽緩沖液（0.5 mL，0.2 mol/L，pH 值6.8）和六氰基亞鐵酸鉀（2.5 mL，1%）混合。加入20%的2.5 mL 三氯乙酸溶液。25 min 后，在740 nm 處測定吸光度，吸光度值越大表示提取物的還原能力越強。

1.3.3.4 ABTS自由基消除能力

參照Chen 等[17]的方法測定，略作修改。以維生素C為陽性對照，采用分光光度計在734 nm處測定不同質量濃度（1.0～4.0 g/L）樣品提取液的吸光度。

1.4 數據統計與分析

試驗數據采用Excel 2016軟件進行整理，Origin 2021軟件作圖，SPSS 24 軟件進行方差分析，使用One-way ANOVA分析數據間的差異顯著性，LSD法多重比較，結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同溶劑提取下蒙早苦荬菜根、莖、葉中總黃酮和總酚含量分析（見表1～表3）

表1 不同溶劑提取下蒙早苦荬菜根部總黃酮、總酚提取含量 單位：mg/g

由表1可知，蒙早苦荬菜根部在5種不同提取溶劑的提取下，總黃酮提取量為6.98～7.65 mg/g，其中乙酸乙酯和乙醇的提取物中總黃酮含量較高，分別為7.58、7.65 mg/g；總酚提取量為2.67～3.92 mg/g，其中甲醇和60%乙醇提取物的總酚含量較高，分別為3.92、3.46 mg/g。

由表2可知，蒙早苦荬菜莖在5種不同提取溶劑的提取下，總黃酮提取含量為6.56～6.89 mg/g，其中乙酸乙酯和水提物的提取含量較高，分別為6.82、6.89 mg/g；總酚提取含量為1.88～3.36 mg/g，水提物和60%乙醇的提取含量較高，分別為3.23、3.36 mg/g。

表2 不同溶劑提取下蒙早苦荬菜莖中總黃酮、總酚提取含量 單位：mg/g

由表3可知，蒙早苦荬菜葉片在5種不同提取溶劑的提取下，總黃酮提取含量為8.35～10.22 mg/g，其中乙醇和60%乙醇總黃酮提取含量較高，分別為9.67、10.22 mg/g；總酚提取含量為2.14～10.69 mg/g，其中60%乙醇和水提物的提取含量較高，分別為10.69、6.28 mg/g。

研究表明，蒙早苦荬菜3個部位在5種不同提取溶劑的提取量比較中，使用甲醇提取莖中總黃酮含量最低，值為6.61 mg/g；使用乙醇提取莖中總酚含量為最低，為1.88 mg/g；使用60%乙醇提取葉片中總黃酮含量和總酚含量最高，分別為10.22、10.69 mg/g。蒙早苦荬菜各個部位的總黃酮和總酚含量依次為葉＞根＞莖。在各個部位中葉片的活性成分含量最高，可選擇葉片作為材料，研究不同溶劑提取物的抗氧化性。

2.2 蒙早苦荬菜在不同溶劑葉提取物的DPPH 自由基清除率（見圖1）

圖1 蒙早苦荬菜不同溶劑葉提取物的DPPH自由基清除率

由圖1可知，當樣品質量濃度在1.0～4.0 g/L之間，不同溶劑提取物對DPPH 自由基均具有不同程度的清除能力，且與DPPH 自由基清除能力呈量效關系。蒙早苦荬菜不同溶劑葉提取物清除DPPH 自由基的能力隨樣品濃度增加而增強，當質量濃度達3.0 g/L時，變化趨于平緩。60%乙醇提取物的消除能力最強，其次為乙醇提取物，水提物的DPPH 自由基清除率最低。在樣品質量濃度為1.0～4.0 g/L 范圍內，水提物的DPPH 自由基消除率僅為16.16%～59.11%，而60%乙醇提取物的DPPH 自由基清除率在42.98%～88.65%。根據IC50值對不同溶劑葉提取物的DPPH自由基清除能力排序為60%乙醇＞乙醇＞甲醇＞蒸餾水＞乙酸乙酯。60%乙醇和乙醇溶液對DPPH自由基的清除能力優于其他溶劑。

2.3 蒙早苦荬菜不同溶劑葉提取物羥自由基消除能力（見圖2）

圖2 蒙早苦荬菜不同溶劑葉提取物對羥自由基消除能力

由圖2可知，樣品質量濃度在1.0～4.0 g/L之間，羥自由基對所有溶劑均具有不同程度的消除能力，蒙早苦荬菜不同溶劑葉提取物消除羥基自由基的能力隨樣品濃度增加而增強，不同溶劑提取物濃度與羥自由基消除能力呈量效關系，當樣品質量濃度達2.5 g/L 時，變化趨于遲緩。依據IC50值對不同溶劑葉提取物對羥自由基消除能力排序為60%乙醇＞蒸餾水＞甲醇＞乙醇＞乙酸乙酯，表明60%乙醇溶液對羥自由基的消除能力最優。

2.4 蒙早苦荬菜不同溶劑葉提取物還原能力（見圖3、表4）

圖3 蒙早苦荬菜不同溶劑葉提取物的還原能力

表4 蒙早苦荬菜不同溶劑葉提取物的還原能力分析

由圖3 可知，蒙早苦荬菜不同溶劑提取物間的還原能力存在一定差異，但不同溶劑提取物的還原能力與樣品濃度存在較好的量效關系。樣品的質量濃度為1.0～4.0 g/L 時，60%乙醇提取物總還原能力最強（IC50值為2.58 g/L），而水提物還原能力最弱，在線性范圍內，水提物的吸光度值僅為0.07～0.23。依據IC50值對不同溶劑葉提取物的還原能力排序為60%乙醇＞乙醇＞乙酸乙酯＞甲醇＞蒸餾水。研究表明，乙醇水溶劑提取物還原能力強于蒸餾水溶劑，其中60%乙醇溶劑還原能力最佳。

由表4可知，在試驗濃度范圍內5種樣品吸光度值均與其質量濃度呈現正相關的線性關系，通過Excel擬合曲線得到回歸方程。研究表明，60%乙醇提取物及乙醇提取物均有較好的還原能力，蒸餾水提取物還原能力最弱；從線性關系分析，甲醇提取物的還原力則更加穩定。

2.5 蒙早苦荬菜不同溶劑葉提取物ABTS 自由基清除能力（見圖4）

圖4 蒙早苦荬菜不同溶劑葉提取物的ABTS自由基清除能力

由圖4可知，樣品質量濃度在1.0～4.0 g/L之間，60%乙醇提取物、乙醇提取物和甲醇提取物清除ABTS 自由基的能力隨樣品質量濃度增加而增強，其IC50值分別為1.84、2.46、4.19 g/L，水提物消除ABTS自由基的能力最弱，IC50值為6.68 g/L。不同溶劑提取物質量濃度與ABTS自由基消除能力呈較好的量效關系。依據IC50值發現，60%乙醇提取物對清除ABTS自由基的能力最強。

2.6 不同溶劑提取物的抗氧化活性與蒙早苦荬菜葉中活性成分含量的相關性分析（見表5）。

表5 不同溶劑提取物的抗氧化活性與蒙早苦荬菜葉中活性成分含量的相關性分析

由表5可知，蒙早苦荬菜不同溶劑提取物的DPPH自由基清除率與總黃酮含量呈顯著正相關（P＜0.05），羥自由基清除率與總酚含量呈顯著正相關（P＜0.05），還原能力與總黃酮含量呈極顯著正相關（P＜0.01），ABTS 自由基清除率與總黃酮呈極顯著正相關（P＜0.01）。

3 討論

吳奇等[18]、榮榮[19]研究表明，對植物提取物抗氧化性起主要作用的物質包括多酚類和黃酮類。本研究選取5種不同極性的溶劑對蒙早苦荬菜不同部位的活性物質進行提取，結果發現，與其他4種溶劑相比，60%乙醇提取莖中的總酚以及葉中的黃酮和總酚含量最高，原因可能是在相同條件下乙醇水溶液能夠更好地溶解酚類化合物[20]。趙玉紅等[21]研究比較了幾種不同溶劑對“魯赫”刺薔薇葉中活性成分的提取效果，得出最佳提取溶劑為60%乙醇，與本研究結果相似。張福娟等[22]以70%甲醇和70%丙酮作為溶劑提取綠豆皮中活性物質，結果發現，丙酮對綠豆皮黃酮類提取效果最佳。因此，不同植物材料需要不同極性提取溶劑才可最大限度地提取出活性物質，不同極性提取溶劑對不同植物酚類化合物的影響效果較大。

本研究發現，在一定質量濃度范圍內，不同溶劑葉提取物均具有較好的抗氧化能力，且抗氧化能力隨著溶劑濃度的增加而增強。研究表明，與只使用水提取相比，用乙醇、甲醇、丙酮、異丙醇或乙腈等有機溶劑與水混合提取可大幅提高植物活性成分的抗氧化性[23-26]。ABTS自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、鐵離子還原力及羥自由基清除能力等體外化學分析方法常被用于測定植物提取物中的抗氧化性。DPPH自由基是一種較好的比較抗氧化性的指標，其原理為DPPH 被抗氧化劑的氫原子還原之后，DPPH由紫變黃。研究表明，可以通過測量517 nm 處吸光度減少量，確定植物提取物的抗氧化能力[27]。本研究發現，60%乙醇提取物在濃度1.0～4.0 g/L范圍內，DPPH 自由基清除能力最強，其次是乙醇提取物，乙酸乙酯提取物清除能力最弱，與張露[28]研究結果一致。在本研究中，DPPH自由基清除能力與蒙早苦荬菜中的總黃酮和總酚含量的相關系數（r）分別為0.953、0.660，表明蒙早苦荬菜中主要的抗氧化劑為黃酮類，其次為酚類。

本研究發現，與其他溶劑相比，60%乙醇葉提取物褪色效果最明顯，乙酸乙酯提取物褪色效果最差，表明60%乙醇提取物具有更高的清除羥自由基能力。對活性物質含量與羥自由基消除能力作相關性分析，結果顯示，羥自由基與總酚含量的r值為0.916，而與總黃酮含量的r值僅為0.310，雖然不同溶劑葉提取物中總酚含量偏低，但具有高度的抗氧化性，從而顯示出較強的抗氧化能力。

4 結論

本研究結果表明，蒙早苦荬菜各個部位總黃酮與總酚含量排序為葉＞根＞莖，蒙早苦荬菜活性物質提取溶劑中最佳的是60%乙醇。蒙早苦荬菜中活性物質的含量與其抗氧化性之間呈良好的量效關系。