高效液相色譜法同時測定液體酸化劑中的有機酸含量

真 誠 譚 薇 趙梅仙 賈紅敏

（中牧實業股份有限公司，北京 100095）

酸化劑是目前市場上一種重要的替抗化合物，主要有固體和液體兩大類[1-2]。液體酸化劑主要應用于家禽、仔豬和反芻動物中。在規?；B殖場的封閉飲水線中存在大量的有害微生物，會影響畜禽健康生長[3]。在養殖過程中添加液體酸化劑[4]，可有效抑菌殺菌，提高機體抗應激、抗病能力，減少疾病發生[5-8]；改善水質，降低pH值，清理管道壁生物膜，降低飲水微生物傳播風險[9-12]；可促進有益菌生長，提高消化酶活性，改善腸道健康，達到促生長和提高飼料利用率的作用[13-15]。液體酸化劑產品在動物生產中的使用量和實際應用效果主要取決于產品中有機酸的種類和含量，所以產品在研發與生產過程中有必要通過精準檢測進行產品含量分析及質控。

目前，有機酸檢測的方法有高效液相色譜法[16-17]、氣質聯用法[18]、氣相色譜法[19-20]、離子色譜法[21]等。氣質聯用法和氣相色譜法雖具有較強的專屬性，但適用范圍小，僅能夠檢測低沸點有機酸含量，且檢測成本較高。離子色譜法多使用稀強酸，對設備具有一定不可逆的腐蝕作用，而且檢測時間較長，綜合檢測效率較低。高效液相色譜法是目前檢測有機酸含量的常用方法，此法特異性強、精確度高，可用于大多數有機酸的同時分離檢測?，F階段市場上的液體酸化劑產品主要以甲酸、乙酸、丙酸、丁酸中的1 種或幾種為主要成分，還未見有對這4種有機酸同時檢測的報道。本研究根據液體酸化劑產品的特點，在大量試驗基礎上進行色譜條件優化，為液體酸化劑的研發及生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器設備與試劑

主要儀器：1260 型高效液相色譜分析儀（美國Agilent 公司）、Atlantis T3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國Waters 公司）、UV-2100 型紫外可見分光光度儀（日本Shimadzu 公司）、MC204 型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、FE20型pH計（梅特勒-托利多儀器有限公司）、KD-600DV型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

主要試劑：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸（分析標準品，濃度＞99%，麥克林公司）；乙腈（色譜純，Fisher公司）；磷酸二氫鉀（分析純，西隴科學股份有限公司）；磷酸（分析純，北京化工廠）；試驗用水為超純水。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準儲備液制備

分別準確稱取0.400 0 g（精確至0.000 1 g）甲酸、

0.400 0 g乙酸、0.200 0 g丙酸、0.200 0 g丁酸標準品，使用流動相B 溶解超聲20 min，冷卻，于100 mL 容量瓶中定容，制備質量濃度分別為40、40、20、20 g/L 的有機酸標準儲備液，4 ℃保存，上機前用0.45 μm濾膜過濾。

1.2.2 樣品處理

準確稱取1 g 液體酸化劑產品于100 mL 容量瓶中，用流動相B稀釋，超聲20 min，冷卻，定容，0.45 μm濾膜過濾，于樣品瓶中待測。

1.2.3 色譜條件

使用Atlantis T3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫為30 ℃，乙腈為流動相A，20 mmol/L KH2PO4緩沖鹽溶液（pH值2.9）為流動相B，流速為1 mL/min，檢測波長220 nm，進樣量20 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 檢測波長的選擇

分別測定甲酸、乙酸、丙酸、丁酸4 種有機酸的紫外吸收譜圖，結果表明，4 種有機酸在220 nm 條件下均具有較大吸收，因此最終確定檢測波長為220 nm。

2.1.2 緩沖鹽濃度和pH值的選擇

緩沖鹽選擇常用的磷酸鹽，pH 值調整為小于4 種有機酸的酸度系數值，保證4 種有機酸以分子狀態存在。但pH值不能過低，過低會導致峰形拖尾嚴重，保留效果不好，所以最終選擇pH值為2.9。緩沖鹽水平篩選了10、20、30 mmol/L。結果發現，20 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液可以滿足4種有機酸均有合適的分離度。

2.1.3 色譜柱及洗脫濃度的選擇

采用美國Agilent 公司1260 型高效液相色譜分析儀，比較了普通C18柱和Atlantis T3柱對4種有機酸的分離效果。由于4種有機酸中甲酸極性很大，在普通的C18色譜柱中無保留，因此選擇Waters 公司更耐水的Atlantis T3色譜柱，使用100%流動相B 進行等度洗脫，等度洗脫（流動相A∶流動相B=0∶100）時，4種有機酸的色譜圖見圖1。

圖1 等度洗脫為流動相A∶流動相B=0∶100時4種有機酸的色譜圖

由圖1 可知，甲酸有合適的保留因子，但是乙酸、丙酸、丁酸出峰時間過長，而且峰形存在拖尾現象。因此，考慮改用90%流動相B進行等度洗脫。

等度洗脫（流動相A∶流動相B=10∶90）時，4 種有機酸的色譜圖見圖2。由圖2 可知，雖然乙酸、丙酸、丁酸分離效果較好，但甲酸與空白溶劑雜峰出峰重疊?？瞻兹軇┑纳V圖見圖3。

圖2 等度洗脫為流動相A∶流動相B=10∶90時4種有機酸的色譜圖

圖3 空白溶劑的色譜圖

因此綜合考慮，設置梯度洗脫，先使用100%的流動相B 進行洗脫，在甲酸出峰后調節流動相B 的比例，通過篩選，在15 min時將流動相B調整到20%，洗脫乙酸、丙酸和丁酸，最終同時檢測4種有機酸的效果良好。

2.1.4 流速與柱溫的選擇

本試驗分別比較了0.7、1.0、1.5 mL/min 3 種流速及20、30、40 ℃ 3 種柱溫條件下的檢測效果。結果表明，流速在0.7 mL/min時，出峰時間過長，降低了檢測效率；流速為1.5 mL/min 時，甲酸出峰時間過早，與空白溶劑雜峰部分交匯不能有效分離；流速為1.0 mL/min 時，分析時間短，峰形分離效果好。柱溫為40 ℃時，4 種有機酸的色譜圖見圖4。

圖4 柱溫為40 ℃時，4種有機酸的色譜圖

由圖4 可知，溫度過高空白溶劑中的雜質峰出峰時間后移，使丙酸與空白溶劑雜峰出峰重疊。而選用柱溫為30 ℃時，4 種有機酸都可有效分離，且峰形對稱性良好。

2.1.5 提取條件的選擇

有機酸均是弱酸，在水系流動相中易發生解離，不被非極性鍵合相保留，所以常用磷酸氫鹽溶液溶解樣品，可抑制溶液解離。試驗比較了使用甲醇∶水=1∶1為提取條件和流動相B 為提取條件時的檢測效果，結果表明，使用流動相B溶解樣品可有效保留和分離4種有機酸。

2.2 有機酸標準曲線及方法檢出限、定量限

按選定的色譜條件對4種有機酸標準品單獨進樣，確定各有機酸的分離時間?？紤]一般液體酸化劑產品中有機酸的含量，將標準儲備液稀釋成濃度為0.5～8.0 g/L的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸標準工作液，進行上機檢測，繪制甲酸、乙酸、丙酸、丁酸標準溶液色譜圖，見圖5。

圖5 甲酸、乙酸、丙酸、丁酸標準溶液色譜圖

將儲備液進行大倍數稀釋后上機測定，以3 倍信噪比計算檢出限，以10倍信噪比計算定量限，測定儀器所能檢出和定量的最低濃度。4種有機酸的保留時間、線性回歸方程、相關系數、檢出限及定量限見表2。由表2可知，4 種有機酸在0.5～8.0 g/L 線性范圍內，相關系數為0.999 7～1.000 0，均呈現出良好的線性關系。4 種有機酸檢出限在0.26～0.53 mg/L，定量限為0.70～2.65 mg/L，表明方法靈敏度較高。

表2 4種有機酸的保留時間、線性回歸方程、相關系數、檢出限及定量限

2.3 方法重復性

對同一液體酸化劑產品使用1.2.2方法處理，上機進行6 次檢測，計算各有機酸含量的相對標準偏差值（RSD），液體酸化劑樣品RSD值見表3。由表3可知，甲酸、乙酸、丙酸、丁酸的RSD 值分別為0.76%、1.41%、1.93%、0.84%，表明該方法精密度良好。

表3 液體酸化劑樣品精密度檢測結果 單位：%

2.4 加標回收率

準確稱取6 個液體酸化劑產品，向其中加入不同濃度的有機酸混合標準液測定加標回收率，每種有機酸設置3個添加濃度，每個添加濃度進行2次平行測定，使用1.2.2 方法處理樣品，并上機測定。液體酸化劑加標回收率的檢測結果見表4。由表4 可知，4 種有機酸均可達到較穩定的回收率，回收率范圍為94.1%～101.2%，表明方法有良好的準確度。

表4 液體酸化劑加標回收率的檢測結果

2.5 樣品測定

從市面上隨機采購3種已知含量的液體酸化劑產品，按1.2.2 方法處理樣品，對樣品進行定性和定量檢測。3種液體酸化劑產品的定量檢測結果見表5。樣品檢測色譜圖見圖6。由表5 和圖6 可知，本方法可以滿足一般液體酸化劑中的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸的測定需求。

圖6 樣品檢測色譜圖

表5 3種液體酸化劑產品的定量檢測結果 單位：%

3 結論

本研究建立的高效液相色譜法可同時檢測液體酸化劑中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸的含量。該方法分離效果和線性關系良好，精密度和準確度較高，樣品前處理簡單，檢測時間短，可大幅提高檢測效率。使用優化后的色譜方法對市場上已知含量的液體酸化劑樣品進行檢測，可準確檢測不同種類液體酸化劑中有機酸的含量，能夠滿足液體酸化劑在研發和生產中的質控要求。