內(nèi)含肽介導(dǎo)的撕裂Cas9：一種非轉(zhuǎn)基因的植物基因編輯系統(tǒng)

賈凌， 許冰心， 葉冬梅， 李亞秀， 夏慶友

西南大學(xué) 前沿交叉學(xué)科研究院生物學(xué)研究中心，重慶 400715

近年來(lái), 鋅指核酸酶(ZFNs)、 轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)器核酸酶(TALENs)、 聚集的規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列/CRISPR相關(guān)蛋白9(CRISPR/Cas9)等基因編輯技術(shù)在動(dòng)植物中得到了快速的發(fā)展[1]． CRISPR/Cas9由于其高效性、 簡(jiǎn)便性以及低成本等優(yōu)點(diǎn)迅速成為最受歡迎的基因編輯技術(shù)之一, 該技術(shù)不僅在生物學(xué)方面起著革命性的突破作用, 在人類(lèi)疾病防治和動(dòng)植物育種方面也具有較大潛力[2-3]． 隨著其重要性的增加, CRISPR/Cas9系統(tǒng)先后在擬南芥、 煙草、 高粱、 水稻、 黃豆、 玉米和其他植物中建立起來(lái)[4-7]． CRISPR/Cas9的遞送方法主要是基于傳統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化(比如農(nóng)桿菌)致使外源DNA片段插入到靶標(biāo)宿主的基因組上[8]． 由于缺乏有效的方法, 很多植物難于進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化． 盡管通過(guò)雜交選擇后代的方法可以分離轉(zhuǎn)基因元件, 但在基因編輯過(guò)程中涉及的轉(zhuǎn)基因未來(lái)仍可能會(huì)引發(fā)公眾和監(jiān)管部門(mén)的注意[9]． 為了克服監(jiān)管障礙, Woo等[10]在體外將Cas9蛋白和gRNA復(fù)合物進(jìn)行組裝后, 利用聚乙二醇將其轉(zhuǎn)染到原生質(zhì)體中, 從而在擬南芥、 煙草、 萵苣和水稻的再生植株中實(shí)現(xiàn)靶向突變． 該策略在玉米和小麥中也展現(xiàn)了很高的效率和更低的脫靶[11-12], 然而, 該方法的前提必須是要分離獲得靶標(biāo)植物的原生質(zhì)體, 否則該策略就不能進(jìn)行． 目前該方法在大部分的非模式植物中基本上還沒(méi)有成功, 而病毒遞送CRISPR元件也許是一個(gè)比較好的方法, 原因如下: 1) 病毒不會(huì)整合到宿主植物基因組中, 因此其產(chǎn)生的是非轉(zhuǎn)基因植物[13]; 2) RNA病毒能高量表達(dá)外源蛋白[14]; 3) 馬鈴薯病毒X(PVX)能從一個(gè)細(xì)胞移動(dòng)到另外一個(gè)細(xì)胞, 從而系統(tǒng)感染植物[15]． 由于大部分的病毒載體只能運(yùn)載較小的蛋白, 比如鋅指核酸酶[16]等, 而來(lái)源于金黃色葡萄球菌的SaCas9(3.1kb)由于其太大, 因此不能直接在植物病毒中表達(dá)． 有研究報(bào)道, 可以將Cas9分成兩段在病毒載體中獨(dú)立表達(dá), 然后采用多種系統(tǒng)將分段的Cas9連接起來(lái), 從而行使完整Cas9的編輯作用, 這些系統(tǒng)包括: 1) sgRNA作為支架用于Cas9組裝; 2) 雷帕霉素控制的FKBP/FRB系統(tǒng); 3) 光調(diào)控的磁性系統(tǒng); 4) 內(nèi)含肽[17-19]． Moretti等[20]采用腺相關(guān)病毒載體(rAAV)運(yùn)載內(nèi)含肽介導(dǎo)的Cas9, 成功在杜興氏肌肉萎縮癥模型豬中進(jìn)行體細(xì)胞基因編輯, 有效改善了骨骼肌和心肌衰竭．

本研究我們開(kāi)發(fā)了一個(gè)內(nèi)含肽介導(dǎo)的片段化Cas9系統(tǒng), 用于植物的基因編輯． 將SaCas9基因分割成3個(gè)部分, 通過(guò)內(nèi)含肽DnaB或DnaE將其進(jìn)行組合, 并采用馬鈴薯病毒X載體進(jìn)行遞送, 使其能系統(tǒng)感染煙草．

1 材料和方法

1.1 材料

研究使用的HEK293FT, 是一種人胚胎腎細(xì)胞系, 保存于西南大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院生物學(xué)研究中心． 在37 ℃條件下, 用Dulbecco改良的Eagle氏培養(yǎng)基、 約5%的CO2和10%的胎牛血清(合格, Invitrogen)培養(yǎng)細(xì)胞． 植物材料使用栽培煙草紅花大金元, 在煙草的4片真葉期用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染．

1.2 載體構(gòu)建

利用化學(xué)方法合成EF1a啟動(dòng)子后, 采用NcoI,SalI和XhoI酶切連接的方法將EF1a啟動(dòng)子插入到PUC-V4-N-SaCas9載體上, 以形成含有SV40終止子的EF1a-V4-N載體． 在金斯瑞生物科技公司化學(xué)合成gRNA-T4S和12個(gè)內(nèi)含肽介導(dǎo)的撕裂SaCas9(V1-N-SaCas9, V1-M-SaCas9, V1-C-SaCas9, V2-N-SaCas9, V2-M-SaCas9, V2-C-SaCas9, V3-N-SaCas9, V3-M-SaCas9, V3-C-SaCas9, V4-N-SaCas9, V4-M-SaCas9, V4-C-SaCas9), 并通過(guò)NcoI和SalI將其插入到EF1a-V4-N載體, 以構(gòu)建EF1a-V1/V2/V3/V4-N/M/C-SaCas9載體． 采用Cla I和SalI將內(nèi)含肽介導(dǎo)的撕裂SaCas9克隆到馬鈴薯病毒X載體(PGR107)上, 以形成PGR107-V4的4個(gè)系列載體: PGR107-V4-N-SaCas9, PGR107-V4-M-SaCas9, PGR107-V4-C-SaCas9和PGR107-gRNA-T4S．

1.3 單鏈退火系統(tǒng)的構(gòu)建和熒光素酶活性檢測(cè)

基于Huang等[21]描述的方法構(gòu)建單鏈退火系統(tǒng)(SSA)． 在SSA中, 采用人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子啟動(dòng)熒光素酶(LUC)的表達(dá)[21]． 將熒光素酶切分成3個(gè)部分, 分別命名為L(zhǎng)UC-A (317 bp), LUC-B (871 bp)和LUC-C (465 bp)． 將終止子(TGA)和gRNA靶位點(diǎn)置放于2個(gè)LUC-B之間, 從而將LUC分成2個(gè)部分． 當(dāng)Cas9和gRNA加入到SSA中, gRNA會(huì)引導(dǎo)Cas9去切割DNA, 從而形成雙鏈缺口, 2個(gè)LUC-B可基于SSA形成完整的熒光素酶, 用pRL-TK載體表達(dá)海腎螢光素酶(RUC)作為對(duì)照組． 將HEK293FT細(xì)胞置放在有培養(yǎng)基的24孔板中, 加入300 ng內(nèi)含肽介導(dǎo)的撕裂SaCas9(EF1a-Vx-N-SaCas9, EF1a-Vx-M-SaCas9和EF1a-Vx-C- SaCas9), 300 ng的EF1a-gRNA, 150 ng的SSA質(zhì)粒和50 ng海腎螢光素酶質(zhì)粒, 利用脂質(zhì)體2000將其共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中． 48 h后, 收集細(xì)胞, 基于操作手冊(cè)采用雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定螢光素酶(LUC)和海腎熒光素酶(RUC)的活性． 每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次．

1.4 病毒侵染

基于Pandey等[22]的方法進(jìn)行少許修改, 進(jìn)行病毒感染的瞬時(shí)侵染實(shí)驗(yàn), 主要包括以下步驟: 將4種質(zhì)粒(PGR107-V4-N-SaCas9, PGR107-V4-M-SaCas9, PGR107-V4-C-SaCas9和PGR107-gRNA-T4S)轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101菌株中, 挑取陽(yáng)性克隆子在含有卡那霉素(50 mg/L)和利福平(25 mg/L)的酵母抽提物牛肉培養(yǎng)基中28 ℃生長(zhǎng)16 h; 通過(guò)離心的方式收集農(nóng)桿菌細(xì)胞, 并將其利用侵染溶液(含10 mmol/L MES, 10 mmol/L MgCl2和 200 μmol/L乙酰丁香酮)重懸, 使農(nóng)桿菌細(xì)胞的光密度在1.6～2.0范圍內(nèi); 將4種農(nóng)桿菌按照1∶1∶1∶1的比例進(jìn)行混合, 并將其放置在25 ℃培養(yǎng)箱中靜置4～6 h; 使用注射器針頭將上述混合的重新懸浮的農(nóng)桿菌滲透到植株葉片的遠(yuǎn)軸表面．

1.5 DNA提取和突變檢測(cè)

將農(nóng)桿菌注射到煙草葉片15 d后, 收集新長(zhǎng)出的葉片以及注射的葉片, 采用EasyPure Plant Genomic DNA Kit提取煙草葉片的DNA, 并以此為模板, 設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 采用PEASY-T5進(jìn)行TA克隆, 最后在華大基因公司進(jìn)行Sanger測(cè)序． 通過(guò)序列分析, 以判定DNA的突變形式和突變效率．

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)含肽介導(dǎo)的撕裂SaCas9系統(tǒng)的設(shè)計(jì)

當(dāng)植物病毒載體運(yùn)送外源DNA時(shí), 外源DNA的大小和蛋白表達(dá)的穩(wěn)定性呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)[23]．SaCas9基因的大小是3.1 kb, 我們將SaCas9的編碼序列分成3部分以適應(yīng)馬鈴薯病毒X載體(PGR107)的運(yùn)載能力． 內(nèi)含肽介導(dǎo)蛋白表達(dá)的方法被應(yīng)用于體內(nèi)重新產(chǎn)生全長(zhǎng)的SaCas9蛋白． 基于SaCas9蛋白的晶體結(jié)構(gòu)鑒定了7個(gè)可能的潛在切割位點(diǎn)[24], 從而形成了4個(gè)N端形式, 稱(chēng)為N1-308, N1-355, N1-389和N1-430, 4個(gè)中間體形式, 稱(chēng)為M309-615, M356-803, M390-803和M431-836, 3個(gè)C端形式, 稱(chēng)為C616-1053, C804-1053和C837-1053． 內(nèi)含肽介導(dǎo)的撕裂SaCas9是由N端、 M端和C端的SaCas9, 經(jīng)由內(nèi)含肽DnaB或DnaE連接而來(lái)(圖1)． 為了確保內(nèi)含肽介導(dǎo)的撕裂SaCas9具有核酸酶的活性, 將SaCas9設(shè)計(jì)了4種形式(V1, V2, V3和V4)． V1采用SaCas91-308, SaCas9309-615和 SaCas9616-1053作為撕裂Cas9, 形成的3種融合結(jié)構(gòu)稱(chēng)為V1-N-SaCas9, V1-M-SaCas9和V1-C-SaCas9; V2采用SaCas91-355, SaCas9356-803和SaCas9804-1053作為撕裂Cas9, 形成的3種融合結(jié)構(gòu)稱(chēng)為V2-N-SaCas9, V2-M-SaCas9和V2-C-SaCas9; V3采用SaCas91-389, SaCas9390-803和SaCas9804-1053作為撕裂Cas9, 形成的3種融合結(jié)構(gòu)稱(chēng)為V3-N-SaCas9, V3-M-SaCas9和V3-C-SaCas9; V4采用SaCas91-430, SaCas9431-836和SaCas9837-1053作為撕裂Cas9, 形成的3種融合結(jié)構(gòu)稱(chēng)為V4-N-SaCas9, V4-M-SaCas9和V4-C-SaCas9．

基于撕裂內(nèi)含肽重新構(gòu)建的屬性, 撕裂內(nèi)含肽的一部分將其自身分成兩種形式(N-intein和C-intein), 并與SaCas9的N端、 中間部分、 C端相連, 最終形成有活性的全長(zhǎng)SaCas9蛋白． 撕裂SaCas9共有4種形式: V1, V2, V3, V4． 藍(lán)色表示SaCas9的N端序列, 紫色表示SaCas9的中間部分序列, 土黃色表示SaCas9的C端序列; 綠色表示內(nèi)含肽DnaB和DnaE的N端, 紅色表示內(nèi)含肽DnaB和DnaE的C端．

2.2 內(nèi)含肽介導(dǎo)的撕裂SaCas9在SSA中有活性

為了高效測(cè)試內(nèi)含肽介導(dǎo)的撕裂SaCas9是否具有活性, 我們構(gòu)建了單鏈退火系統(tǒng)(SSA), 將熒光素酶基因分成3個(gè)部分, 包括A,B和C區(qū)域(圖2)． 將終止子和gRNA靶位點(diǎn)放于2個(gè)B區(qū)域之間． 如果添加的Cas9蛋白具有活性, Cas9能將gRNA靶位點(diǎn)切割形成雙鏈缺口, 基于SSA修復(fù)機(jī)制, 熒光素酶的B區(qū)域?qū)⒈恍迯?fù), 形成一個(gè)完整的熒光素酶基因, 因此熒光素酶的活性就能被檢測(cè)到(圖2a)． 在該實(shí)驗(yàn)中, 內(nèi)含肽介導(dǎo)的撕裂SaCas9的4種形式(SaCas9-V1/V2/V3/V4)和gRNA在載體中分別被組裝起來(lái)(圖2b)． gRNA, EF1a-N/M/C-SaCas9 和SSA載體同時(shí)轉(zhuǎn)染到HEK293FT哺乳動(dòng)物細(xì)胞中, 48 h后檢測(cè)熒光素酶的活性． 結(jié)果表明在4種測(cè)試形式中, 有2種形式(V3和V4)的LUC/RUC的比例顯著高于對(duì)照組(只有SSA和pRL-TK載體)(圖2c)． 該結(jié)果表明了內(nèi)含肽DnaB和DnaE能高效介導(dǎo)全長(zhǎng)Cas9蛋白的形成． V1和V2不能使3部分的SaCas9片段形成全長(zhǎng)SaCas9的原因可能是第306號(hào)、 315號(hào)、 或第613號(hào)氨基酸殘基起了十分重要的作用． 此外, SSA活性暗示了重新形成的Cas9蛋白保留了基因編輯的活性, 基于此, 選擇V4用于后續(xù)研究．

a圖中黃色的A, B, C分別表示熒光素酶基因的3部分． b圖中藍(lán)色的N-SaCas9、 紫色的M-SaCas9、 土黃色C-SaCas9分別表示SaCas9的N端、 中間部分和C端的序列, 并均由EF1a啟動(dòng)子啟動(dòng); 綠色的DnaB-N-intein, DnaB-C-intein分別表示內(nèi)含肽DnaB的N端和C端序列; 深藍(lán)色的DnaE-N-intein, DnaE-C-intein分別表示內(nèi)含肽DnaE的N端和C端序列; SV40為終止子． c圖中CK表示對(duì)照組, V1, V2, V3, V4分別是撕裂SaCas9的4種形式．

2.3 內(nèi)含肽介導(dǎo)的撕裂SaCas9能通過(guò)馬鈴薯病毒X遞送到煙草中有效靶向PDS基因

為了進(jìn)一步檢測(cè)內(nèi)含肽介導(dǎo)的撕裂SaCas9是否能在植物中有效引起突變, 構(gòu)建了V4形式的撕裂SaCas9到PGR107載體中, CP啟動(dòng)子控制了撕裂SaCas9的表達(dá), gRNA也在CP啟動(dòng)子中表達(dá)． 應(yīng)用tRNA系統(tǒng)構(gòu)建了2個(gè)gRNA靶向PDS基因(圖3a)． 將4種含有PGR107-V4-N-SaCas9, PGR107-V4-M-SaCas9, PGR107-V4-C-SaCas9和PGR107-gRNA-T4S質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染處于4～6葉期的煙草葉片中, 15 d后, 在煙草葉片上出現(xiàn)了白化的表型(圖3b), 而在對(duì)照組(只有PGR107載體)中, 沒(méi)有出現(xiàn)白化的表型． 為了探究白化表型是否是由于植物病毒載體表達(dá)的撕裂SaCas9引起的, 收集了5個(gè)植株新發(fā)育的葉片, 進(jìn)行DNA提取、 PCR擴(kuò)增、 TA克隆和Sanger測(cè)序, 序列分析表明在2號(hào)植株中在gRNA位點(diǎn)1上有單堿基的刪除和替換, 在第4號(hào)和第5號(hào)植株上出現(xiàn)了單堿基的刪除(圖3c)． 以上結(jié)果暗示由于移碼突變,PDS基因不能被翻譯成正確的蛋白, 從而使煙草葉片變?yōu)榘咨? 而經(jīng)由內(nèi)含肽介導(dǎo)的撕裂SaCas9引起PDS突變的頻率較低, 在1.25%～5.00%之間(表1)． 該結(jié)果可能是因?yàn)镾aCas9被分成了3個(gè)部分, 而僅有少部分形成了全長(zhǎng)SaCas9分子．

表1 在煙草葉片中檢測(cè)PDS突變

a圖中PGR107表示馬鈴薯病毒載體X; PGR107/N-SaCas9, PGR107/M-SaCas9, PGR107/C-SaCas9表示將SaCas9的N端、 中間部分和C端的序列分別構(gòu)建到PGR107載體上; DnaB-N-intein, DnaB-C-intein分別表示內(nèi)含肽DnaB的N端和C端序列; DnaE-N-intein, DnaE-C-intein分別表示內(nèi)含肽DnaE的N端和C端序列． b圖中PGR107-scaffold表示注射含有質(zhì)粒PGR107農(nóng)桿菌后的新葉片; Split-SaCas9-V4 +gRNA表示注射有混合質(zhì)粒Split-SaCas9-V4+gRNA農(nóng)桿菌后的新葉片． c圖中紅色短線(xiàn)表示堿基刪除; 紅色字母表示堿基替換; NO. #表示第幾號(hào)植株．

3 結(jié)論與討論

在本研究中, 我們構(gòu)建了內(nèi)含肽介導(dǎo)的撕裂SaCas9載體． 采用SSA系統(tǒng), 在一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中證實(shí)了內(nèi)含肽介導(dǎo)的撕裂SaCas9活性． 采用瞬時(shí)侵染的方法, 發(fā)現(xiàn)馬鈴薯病毒X載體(PGR107)能運(yùn)載撕裂SaCas9, SaCas9能在新長(zhǎng)出的葉片中表達(dá), 并能實(shí)現(xiàn)靶向編輯煙草的內(nèi)源基因．

目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了兩種非轉(zhuǎn)基因的基因組編輯策略, 以推廣和應(yīng)用基因組編輯方法產(chǎn)生新的植物: 1) 從大腸桿菌中純化到核酸酶(Cas9, Cpf1)和gRNA在體外進(jìn)行組裝, 將該復(fù)合物通過(guò)聚乙二醇或是基因槍遞送到原生質(zhì)中, 之后由原生質(zhì)體再生形成非轉(zhuǎn)基因的小苗[11-12]; 2) 通過(guò)植物病毒載體瞬時(shí)表達(dá)鋅指核酸酶[16]． 以上兩種方法與傳統(tǒng)RNA引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶(RGEN)相比, 能得到非轉(zhuǎn)基因植株, 但外源DNA不會(huì)插入到宿主基因組中． 由于第1種方法效率高、 時(shí)間少、 脫靶率低, 已經(jīng)成功應(yīng)用到一些雙子葉(擬南芥、 煙草、 萵苣、 馬鈴薯和牽?；?和單子葉植物(水稻、 玉米和小麥)中[10-12, 23, 25-26]． 在RNA引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶復(fù)合體方法中用到的原生質(zhì)體分離、 轉(zhuǎn)染以及再生步驟, 則會(huì)阻止該方法在其他植物中的應(yīng)用和延伸． 由于便攜的操作和不需要原生質(zhì)體, Marton等[16]采用TRV成功在煙草和牽?；ㄖ斜磉_(dá)了鋅指核酸酶, 并獲得了可以遺傳的基因編輯植株．

馬鈴薯病毒X是一種單鏈病毒, 不能被整合到宿主基因組DNA中[23]． 此外, 馬鈴薯病毒X在多個(gè)組織中可以高量表達(dá), 且能系統(tǒng)感染, 所以該病毒被應(yīng)用于基因功能研究以降低基因的表達(dá)量或是在植物中表達(dá)具有商業(yè)價(jià)值的蛋白[15, 22]． 在本研究中, 采用馬鈴薯病毒X表達(dá)SaCas9蛋白, 可獲得非轉(zhuǎn)基因的編輯煙草植株．

本研究采用內(nèi)含肽介導(dǎo)的撕裂SaCas9蛋白成功在煙草葉片中編輯了PDS基因, 然而該系統(tǒng)的編輯效率不是很高, 主要的原因可能是SaCas9被分成了3個(gè)部分, 而3個(gè)部分比2個(gè)部分組裝形成全長(zhǎng)SaCas9的概率低, 因此探尋更小的Cas9[27]或是運(yùn)載能力更大的載體, 或許能提高撕裂SaCas9的效率． 如果該系統(tǒng)的效率能得到提升, 那么其可能在植物基因功能研究上成為一個(gè)簡(jiǎn)單且有效的基因編輯方法．