溫陽強心顆粒治療慢性心力衰竭的作用機制預測*

姜濤，趙薇，王茸，魏琳，劉暢，王冰梅，王微

長春中醫藥大學 吉林長春 130117

“心力衰竭”簡稱心衰，是指由于心臟的收縮功能和（或）舒張功能發生障礙，不能將靜脈回心血量充分排出心臟，導致靜脈系統血液淤積，動脈系統血液灌注不足，從而引起心臟循環障礙癥候群，此障礙癥候群集中表現為肺淤血、腔靜脈淤血[1]。

網絡藥理學作為一種藥物研究的新模式出現，其整體性和系統性特征與中醫的整體理解、辨證治療以及與處方配伍的原則相吻合[3]。網絡藥理學從整體角度探討藥物與疾病之間的關系，突出了從“單個靶標”到“網絡靶標”研究模式的轉變[2-3]。

溫陽強心顆粒具有明顯的改善慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）的作用，但是目前對于溫陽強心顆粒的作用機理研究和文獻很少，也比較單一，尚需進一步研究。網絡藥理學的發展為我們提供了預測和分析“藥物-靶標”相互作用的可能。本文采用網絡藥理學預測溫陽強心方的活性成分，篩選治療心力衰竭的作用靶點，結合系統生物學研究多角度、全方位揭示溫陽強心方對心力衰竭的效應機制[4]。

資料與方法

1 溫陽強心顆粒有效活性成分及作用靶點數據庫構建

通過中藥系統藥理學數據庫（TCMSP，http//：lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp）檢索溫陽強心顆粒（黨參、甘草、葶藶子、附子、丹參、三七、茯苓、黃芪、當歸、白術、桂枝）各組分的有效成分及作用靶點。以口服生物利用度（oral bioavilability，OB）≥ 30%，類藥性（druglike，DL）≥ 0.18為篩選條件，篩選出溫陽強心顆粒的有效成分及靶點[5]。將篩選后所得的藥物靶點通過全球蛋白質資源數據庫（Uniprot，https：//www.uniprot.org/），限定物種為“Homo sapiens”，并點擊Reviewed進行基因的標準化處理，從而將蛋白名稱轉換為Gene Symbol。

2 CHF靶點數據庫構建

通過在線人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM，http：//www.omim.org/）和基因卡片數據庫（GeneCards，https：//www.genecards.org/）輸入關鍵詞“chronic heart failure”檢索與CHF相關的基因，點擊選項Export選擇Export to Excel格式，并篩選出相關分數Relevance score ≥ 15的基因構建疾病數據庫。

3 溫陽強心顆粒治療CHF靶點及有效成分的篩選

將“1”取得的溫陽強心顆粒靶點與“2”取得的疾病靶點導入Venny 2.1平臺取其交集，所得交集靶點即為溫陽強心顆粒治療CHF的潛在作用靶點，并制作Venny圖。

4 中藥活性成分-交集靶點網絡構建

將“3”取得的溫陽強心顆粒與疾病的交集靶點進行分析，找出各個中藥之間的重復成分，對數據進行分析，并準備好網絡文件和屬性文件。先將網絡文件導入Cytoscape 3.9.1軟件，設置第一列為MOL、第二列為Gene，接著導入屬性文件，即可獲得一個初步的中藥有效成分-交集靶點網絡圖，再對其初步的網絡圖進行調整美化得到最終的中藥有效成分-交集靶點網絡圖。

5 蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建

為了探討CHF與溫陽強心顆粒之間的潛在靶點相互作用的關系，將“3”獲得的交集靶點蛋白輸入String數據庫（https：//cn.string-db.org/），限定物種為“Homo sapiens”進行分析，隨后導入輸出文件和蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡圖[2]。為了確保數據的準確性，設置選項“minimum required interaction score = 0.4”的PPI關系數據，構建溫陽強心顆粒對治療CHF的 PPI網絡圖。將溫陽強心顆粒與疾病CHF在String數據庫取得的交集靶點輸入到Cytoscape 3.9.1軟件中，在得到的PPI互作圖中去除掉游離的邊緣靶點蛋白，再對剩余比較集中的交集靶點蛋白的網絡互作圖進行修飾，通過計算靶點蛋白結點之間的Degree值，根據Degree值的大小來進行作圖，最終得到PPI網絡互作圖。

6 基因本體（gene ontology，GO）功能與 KEGG 通路富集分析

為了進一步闡明溫陽強心顆粒的作用機制，本研究擬采用DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對溫陽強心顆粒治療靶點進行GO 功能和 KEGG 通路富集分析。將得到的數據以 P ≤ 0.05 為篩選標準，通過微生信網站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）以圖表的方式進行生物過程、分子 功能、 細胞組分以及KEGG 氣泡圖的可視化處理[3]。

結 果

1 溫陽強心顆粒治療CHF的有效成分及靶點

應用TCMSP數據庫檢索溫陽強心顆粒的各成分信息，設置OB（%）≥ 30%和DL ≥ 0.18作為篩選條件，據統計符合條件的共有278種活性化合物。去除重復數據，共篩選出246種活性化合物，見表1，獲得靶點231個。

表1 溫陽強心顆粒化合物及靶點數量表

2 溫陽強心顆粒治療CHF靶點篩選結果

通過CHF致病基因數據庫構建，篩選CHF疾病相關靶點10698個，并以相關分數（Relevance score）≥15為條件檢索出CHF疾病相關靶點1060個。通過 Venny 2.1 平臺將“1”所得藥物靶點與“2”所得的相應疾病靶點進行取交集，從而獲取有效靶點，保存交集靶點，共得到交集靶點共有106 個，并制作Venny圖，見圖1。

圖1 溫陽強心顆粒與心力衰竭相關

3 構建中藥活性成分-交集靶點網絡圖

將“3”取得的溫陽強心顆粒與疾病的交集靶點進行分析，找出各個中藥之間的重復成分，對其進行標注，然后對數據進行分析，通過Cytoscape 3.9.1軟件獲得一個初步的中藥有效成分-交集靶點網絡圖，再對其初步的網絡圖進行調整美化得到最終的中藥有效成分-交集靶點網絡圖見圖2。

圖2 中藥有效成分-交集靶點

橘色代表黃芪（HQ）、茯苓（FL）、白術（BZ）、三七（SQ）、茯苓（FL）、桂枝（GZ）、丹參（DS）、附子（FZ）、川芎（CX）、當歸（DG）、附子（FZ）、黨參（DANGS）；藍色代表靶點蛋白；粉色代表有效成分；綠色代表共有成分（注：A1為黨參和丹參的共有成分；A2為黨參、當歸、三七的共有成分；A3為黨參、甘草的共有成分；B1為當歸、三七、葶藶子的共有成分；C1為川芎、桂枝、甘草、附子的共有成分；C2為川芎、三七的共有成分；D1為三七、甘草、葶藶子、黃芪的共有成分；F1為甘草、葶藶子、黃芪的共有成分；F2為甘草、黃芪的共有成分；F3為甘草、葶藶子、黃芪的共有成分；F4為甘草、黃芪的共有成分）。

4 蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建

為了進一步探討核心靶點之間的相互作用關系，將“1”得到的藥物與疾病的 106個交集靶蛋白基因名導入到 String數據庫，將物種限定為“人”，得到藥物-疾病之間的 PPI 網絡圖[6]見圖3。

圖3 溫陽強心顆粒治療CHF的PPI網絡圖

圖中共有105個節點，1997條邊，平均節點度 38；節點代表靶標蛋白，邊表示蛋白與蛋白之間的關系，邊連接節點構建靶蛋白網絡。將 String 數據庫得到的數據導入 Cytoscape 3.9.1 軟件中，繪制 藥物 -疾病的核心靶點網絡圖見圖4。其中節點度值前二十的分別為AKT1、IL6、TNF、VEGFA、IL1B、CASP3、TP53、EGFR、MMP9、PTGS2、CCL2、SERPINE1、MYC、ERBB2、HIF 1A、IL10、PPARA、MPQ、CRP、HMOX1推測這20個靶蛋白在溫陽強心顆粒治療CHF過程中發揮重要的作用。

圖4 核心靶點網絡圖可視化

5 GO生物過程結果分析

通過DAVID數據庫對獲得的106個“溫陽強心顆粒-心力衰竭”共同靶點進行富集分析。GO屬于基因功能分類體系，有3個分支，即生物學過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。通過對所得數據進行分析，以 P ≤ 0.05 為篩選標準，最終得到556個BP，54個CC，91個MF。其中涉及的生物學過程包括成骨細胞發育、半胱氨酸型內肽酶活性的激活、壞死過程的負調節等；涉及的細胞組成有低密度脂蛋白顆粒、毛孔復合物、細胞頂端部分等；涉及的分子功能有低密度脂蛋白顆粒結合、神經遞質轉運蛋白活性、β-連環蛋白結合等。應用微生信網站根據“Enrichment score（-log（Pvalue））”對富集的前10個BP、CC、MF進行柱狀圖可視化見圖5。

圖5 GO富集分析

6 KEGG通路富集分析結果

將106個靶蛋白數據通過DAVID在線進行KEGG通路分析。結果顯示：富集出 KEGG信號通路共127條（P ≤ 0.01，FDR ＜ 0.05）。其中與舒張血管有關通路PI3K-AKT信號通路[7]（PI3K-Akt signaling pathway）；與腫瘤相關通路有癌癥通路（Pathways in cancer）、甲狀腺癌（Thyroid cancer）、胃癌（Gastric cancer）；與血管新生有關通路有VEGF信號通路[8-9]（VEGF signaling pathway）；與心律失常有關通路有Ca信號通路[10-11]（Calcium signaling pathway）、NA重新收信號通路（Aldosterone-regulates sodium reabsorption）；與免疫調節相關的信號通路有T細胞受體信號通路（T cell receptor signaling pathway）、NOD樣受體信號通路[12]（NOD-like receptor signaling pathway）、Toll樣受體信號通路[13]（Toll-like receptor signaling pathway）；與心室重構和心肌修復有關通路腎素分泌信號通路[14-15]（Renin secretion）、JAKSTAT信號通路[9，16]（JAK-STAT signaling pathway）。由此可見，溫陽強心顆粒中的活性成分可以作用于上述的這些信號通路，從而達到調節CHF和治療疾病的目的。運用微生信平臺對前20個的富集結果進行可視化處理見圖6。

圖6 KEGG 富集分析的氣泡圖（前20）

討 論

在以前的藥物研發模式中，主要遵循“一個藥物、一個基因、一種疾病”的模式，這是導致70%的新藥在臨床試驗失敗的主要原因[17]。然而，目前對CHF作用機制的研究相對較為單一，因此有必要研究溫陽強心顆粒治療CHF的作用機制[18]。

對比傳統的藥理學，網絡藥理學從整體網絡的角度認識藥物的作用機制，指導臨床合理用藥。在進行新藥發現和新藥作用評價以及新藥開發時，我們發現藥物的靶點并不是隨機分布在網絡中，而是具有靶點分布的特點和一定的規律。因此，基于網絡藥理學，對中藥復方溫陽強心顆粒的有效成分、靶蛋白和信號通路進行預測和分析，構建與CHF相關的PPI網絡，對溫陽強心顆粒治療CHF的可能作用機制進行初步的分析。通過網絡藥理學研究發現溫陽強心顆粒可以通過作用于抗心律失常、免疫炎癥反應、舒張血管平滑肌、血管新生等方面治療心力衰竭[19]。

為了探究溫陽強心顆粒治療心力衰竭的作用機制，本研究對溫陽強心顆粒中的中藥活性成分進行了分析，構建了中藥活性成分-交集靶點網絡，分析了中藥活性成分與靶點的作用關系[20]。在中藥活性成分-交集靶點網絡中有多個與疾病緊密相關的關鍵靶點蛋白，如AKT1、IL6TNF、VEGFA等，由此可推測溫陽強心顆粒正是與這些靶點直接或間接作用發揮藥理作用。

此外，本研究還對溫陽強心顆粒在GO功能和KEGG通路進行富集分析。GO功能富集分析結果顯示，溫陽強心顆粒作用的靶點參與了成骨細胞發育、半胱氨酸型內肽酶活性的激活、壞死過程的負調節、低密度脂蛋白顆粒、毛孔復合物、細胞頂端部分、低密度脂蛋白顆粒結合、神經遞質轉運蛋白活性、β-連環蛋白結合等生物過程、細胞組成和分子功能。KEGG通路進行富集分析顯示，溫陽強心顆粒大多數基因富集到與癌癥有直接關系的通路上，包括Choline metabolism in cancer、Central carbon metabolism in cancer等；另一部分負責調控信號通路，包括Epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection、Adrenergic signaling in cardiomyocytes、GnRH signaling pathway等。

綜上所述，溫陽強心顆粒治療CHF的作用機制是多成分、多靶點、多通路的復雜網絡結構[21]。在溫陽強心顆粒治療CHF中，通過網絡藥理學預測了溫陽強心顆粒對該疾病的主要作用機制，為其活性成分的深入研究以及藥理實驗提供了理論依據。