坤泰膠囊治療卵巢儲備功能下降的作用機制*

武桐，吳越，李偉莉，3

1 安徽醫科大學 安徽合肥 230031

2 安徽中醫藥大學 安徽合肥 230031

3 安徽中醫藥大學第一附屬醫院 安徽合肥 230031

卵巢儲備功能下降（diminished ovarian reserve，DOR），是指卵巢產生卵子的能力減弱、卵母細胞質量下降，從而導致女性性激素缺乏、生育能力下降的一種疾病，進一步發展可演變為卵巢早衰[1]。西醫主要采用激素替代療法、促排卵療法及輔助生殖技術等方法進行治療[2]，但其缺點不容忽視，比如增加婦科腫瘤和心血管疾病等發病幾率的風險、依賴性強、失敗率高、價格高昂等。中醫藥治療本病歷史悠久，已積累了豐富的經驗。中醫學中，并無卵巢儲備功能下降的病名，但可根據其臨床表現歸屬于“月經過少”“月經后期”“不孕”“經斷前后諸證”等范疇。現臨床常用中成藥制劑--坤泰膠囊，由《傷寒論》中“黃連阿膠湯”化裁而來，具有滋陰清熱、安心除煩、補血養血、調和陰陽等多重功效，主要用于絕經期前后諸證、婦女卵巢功能衰退等婦科疾病。坤泰膠囊組方為熟地、黃芩、黃連、茯苓、白芍和阿膠，其中熟地為君藥，生精益髓、滋陰養血；黃連苦寒，入心經而清降心火，阿膠甘平，入腎經而補血滋陰，兩藥相伍以達心火降、腎水旺，調和陰陽之功，此共為臣藥；黃芩助黃連清熱瀉火，白芍養血調經，柔肝斂陰，助阿膠滋補腎水，茯苓健脾寧心，此共為佐藥。

網絡藥理學是一種基于系統層次和生物網絡的整體角度，解析藥物和治療對象之間的分子關聯規律的新興學科[3]。坤泰膠囊雖已在臨床上取得一定效驗，但其發揮作用的有效活性成分、潛在靶點、生物過程尚不十分明確。故本研究將采用網絡藥理學方法，通過挖掘坤泰膠囊治療 DOR 的有效成分、潛在作用靶點，進行Go功能富集及KEGG通路富集分析，系統的對其作用機制進行深入探討，以期為卵巢儲備功能下降的臨床決策提供科學依據。

資料和方法

1 坤泰膠囊的活性成分及靶標基因收集

通過TCMSP（http：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）對坤泰膠囊中熟地、黃連、白芍、黃芩、茯苓進行檢索，利用BATMAN-TCM（bionet.ncpsb.org.cn/batmantcm）和化學專業數據庫（www.organchem.csdb.cn/scdb/default.htm）對阿膠進行檢索，由此建立坤泰膠囊的化學成分數據庫。以藥動學參數中的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（druglikeness，DL）≥0.18作為篩選條件，最終獲得的化合物共77個。將獲得的活性成分輸入TCMSP數據庫，檢索出對應的靶點，結合Uniprot數據庫獲得坤泰膠囊的基因靶點。

2 DOR疾病靶標收集

以“diminished ovarian reserve”為關鍵詞，在人類孟德爾遺傳綜合數據庫數據庫（http：//www.omim.org/）及Genecards數據庫（http：//genecards.org/）中檢索DOR的疾病靶點。

3 活性成分-作用靶點網絡構建

將整理好的坤泰膠囊有效成分及靶點上傳至Cytoscape3.8.0軟件，建立“成分-靶點”可視化網絡圖，由此得出坤泰膠囊治療 DOR 的主要活性成分。

4 PPI網絡構建

通過Venny 2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic/tools/venny/index.html）獲取坤泰膠囊與疾病的交集靶點，然后將交集靶點導入String數據庫（http：//www.string-db.org），限定物種選擇“Homo sapiens”，置信度選擇“medium confidence（0.400）”，同時將游離點設置隱藏，得到相互作用網絡圖，并利用Cytoscape3.8.0軟件進行可視化展示。

5 Go功能富集分析及KEGG通路富集分析

Metasacpe平臺（http：//metascape.org/gp/index.html）是一個功能豐富的基因功能注釋分析工具。將坤泰膠囊治療 DOR 的靶點錄入Metasacpe平臺，限定物種選擇“H.sapiens”，分析類型選擇“Custom Analysis”，分別進行Go功能富集分析和KEGG通路富集分析，并將數據導入微生信（www.bioinformatics.com.cn）制作條形圖、氣泡圖以求數據可視化。

結 果

1 坤泰膠囊的活性成分收集

由TCMSP數據庫得出的活性成分分別為熟地2個，黃連14個，白芍13個，黃芩36個，茯苓15個，阿膠3個，由BATMAN-TCM和化學專業數據庫得到阿膠的3個活性成分，部分活性成分信息見表1。

表1 坤泰膠囊所含部分化合物基本信息

2 坤泰膠囊作用靶點和DOR疾病靶點獲取

在TCMSP和Uniprot數據庫檢索坤泰膠囊的基因靶點，在人類孟德爾遺傳綜合數據庫數據庫及Genecards數據庫檢索DOR 的疾病靶點，分別整合去重，最終得到140個藥物作用靶點，3522個疾病靶點。同時繪制成韋恩圖，得到交集靶點112個。如圖1。

圖1 藥物靶點及疾病靶點的韋恩圖

3 “成分-靶點”網絡構建

將坤泰膠囊的有效成分及靶點傳輸至Cytoscape軟件之后，構建“成分-靶點”網絡圖（見圖2），包括294個節點，427條邊，其中黃色菱形代表坤泰膠囊的有效成分，綠色圓形代表作用靶點，連接條數最多、較為密集的成分和靶點在該網絡中起著關鍵作用。根據拓撲學性質（度值≥20），可以得到坤泰膠囊治療DOR 的核心有效活性成分依次為槲皮素、山奈酚、β谷甾醇、漢黃芩素、豆甾醇、蛇床子素。

4 PPI網絡構建

將在韋恩圖中獲得的交集基因導入String數據庫，獲取TSV格式文件后導入Cytoscape3.8.0繪制PPI網絡圖（見圖3）。用節點的大小和顏色表示degree值的大小，即節點越大、顏色越深，degree值越大；用邊的粗細和顏色表示combined score的大小，即邊越粗、顏色越深，combined score值越大。其中關鍵節點涉及AKT1、VEGFA、PTGS2、CASP3、TP53、CXCL8、MMP9等。

圖3 PPI網絡圖

5 Go功能富集分析及KEGG通路富集分析

將篩選到的坤泰膠囊治療 DOR 的靶點導入Metascape數據庫中，分別進行Go功能富集分析及KEGG通路富集分析，設定閾值P＜0.01，其中Go富集分析又包括生物過程（biological process）、分子功能（molecular function）及細胞組分（cellar component）。搜集到生物過程112個條目，分子功能42個條目，細胞組分21個條目，信號通路107個。分別選取前20的條目進行可視化，將結果導入微生信進行Go富集分析三合一柱狀圖和KEGG富集分析氣泡圖繪制。其中KEGG富集分析氣泡圖中，P值用氣泡顏色表示，代表富集程度，即越接近紅色代表P值越小；count值用氣泡大小表示，代表富集基因數，即氣泡越大就代表富集的基因數目越多；橫坐標為基因比例，縱坐標為信號通路名稱（見圖4、圖5）。

圖4 Go功能富集分析（三合一）

圖5 KEGG富集分析

討 論

本研究通過網絡藥理學手段，探索坤泰膠囊的物質基礎和潛在作用機制。在化合物和作用靶點方面，共篩選出坤泰膠囊的主要活性成分有77個，作用靶點有112個。其中起關鍵作用的活性成分分別為槲皮素、山奈酚、β谷甾醇、漢黃芩素、豆甾醇、蛇床子素。槲皮素、山奈酚、漢黃芩素屬于黃酮類化合物，都具有抗炎、抗氧化、抗凋亡以及抗癌的作用。有研究證明槲皮素可以調節女性生殖系統功能，減少卵巢細胞凋亡，促進卵母細胞成熟、改善卵母細胞質量，直接調節類固醇和肽類激素的釋放，即通過調節HGPA軸，下調FSH及LH水平，還可降低雌激素受體α（ERα）、β（ERβ）和孕激素受體（PR）在下丘腦、垂體和子宮內膜的表達[4]。β谷甾醇和豆甾醇屬于植物甾醇類，為天然多酚羥酸類化合物。β谷甾醇有著抗炎、抗氧化、抗凋亡和神經保護的作用，曾莉萍認為β谷甾醇具有雌激素活性，誘導卵巢顆粒細胞產生雌激素[5]，更有研究表明β谷甾醇可通過增加P-AKT 和 P-PIK3CA蛋白表達水平促進顆粒細胞增殖，且降低Caspase-3蛋白表達水平，從而抑制顆粒細胞的凋亡[6]。豆甾醇可調節促性腺激素，具有抗氧化活性[7]。蛇床子素具有緩解氧化應激損傷的作用，可保護卵巢組織的功能，增強卵巢組織的抗氧化能力[8]。

通過PPI網絡分析發現，AKT1、VEGFA、PTGS2、CASP3、TP53是坤泰膠囊治療 DOR 的關鍵靶點。AKT1是P13K/AKT通路中的重要蛋白，可促進細胞存活、發育和增殖[9]，李錦英[10]等學者認為AKT1可維持原始卵泡正常的生長發育，調節卵母細胞的生長和顆粒細胞的增殖分化，并可抑制細胞凋亡。卵巢血管生成對卵泡發育起著至關重要的作用，馮遜遜[11]等人通過超聲動態觀察免疫性原發性卵巢功能不全的小鼠與正常小鼠，證明了卵巢血管順應性和血管彈性與卵巢儲備功能呈正相關。而VEGFA是主要的促血管內皮生長因子之一，一般來源于基質細胞，在血管生成和血管通透性方面發揮生理功能，Wei Jingzan[12]經體外實驗表明，VEGFA與miR-185相互影響，達到減輕卵巢結構損傷，保護顆粒細胞層厚度、膜細胞層厚度的作用。諸多研究發現，PTGS2主要定位于顆粒細胞，卵丘細胞和黃體細胞，參與多種生殖活動，例如排卵、著床及妊娠等，且其高表達與血管生成密切相關，從而影響卵巢血供[13-14]。CASP3是Caspase家族重要的下游調控因子，是細胞凋亡的主要執行者，在卵母細胞、顆粒細胞中均有表達，可使卵巢功能下降[15]。TP53在細胞周期阻滯、凋亡、衰老和自噬等各種環節中扮演者重要角色。相關研究證明，衰老細胞在TP53缺失后，對凋亡信號失去反應，可重新進入細胞周期，使衰老細胞快速增殖[16]，這可能是TP53成為坤泰膠囊治療 DOR 關鍵靶點之一的原因。

通過Go生物過程功能富集分析，可以得到坤泰膠囊可能主要參與炎癥反應、循環系統過程、對無機物的應答、離子反應的正向調控等生物過程。通過KEGG通路富集分析，發現富集通路主要是信號傳導通路（JAK-STAT、Wnt、VEGF、HIF-1、NF-KB、雌激素、趨化因子、長壽信號通路）、疾病通路（利什曼原蟲感染、胰島素抵抗、丙肝、癌癥）等。其中顯著性較高的通路為癌癥、糖尿病并發癥中的糖化終末產物及其受體信號通路、丙型肝炎等，JAK-STAT信號通路受雌激素調控，并與衰老相關通路有通向變化[17]，HIF-1通路與細胞增殖、血管生成的蛋白質表達有關[18]，Wnt通路的作用于胚胎發育，同時參與成年女性的生殖功能、維持體內穩態等。由此可見，坤泰膠囊是通過多靶點、多通路對 DOR 進行調控以達到治療作用。

綜上所述，本研究應用網絡藥理學方法，初步闡釋了坤泰膠囊治療 DOR 的相關作用機制，體現了多成分、多靶點、多效應的治療特點。然而由于現階段中藥化學數據庫資料不足、各數據庫之間差異較大等，本研究結果可能有偏差，且本次研究僅限于分子層面，仍需更多研究加以佐證。