麻黃附子細(xì)辛湯治療變應(yīng)性鼻炎作用機制探究*

陳蘭蘭，陳榮榮，原夢雪，張銘，王安琪，李莉

山西中醫(yī)藥大學(xué) 山西太原 030024

變應(yīng)性鼻炎（Allergic rhinitis，AR）是機體接觸過敏原后由IgE介導(dǎo)的鼻黏膜非感染性慢性炎癥，通常以鼻癢、打噴嚏、流清水涕、鼻塞等為主要就診表現(xiàn)，在耳鼻喉科較為常見且多發(fā)[1]。在中國，約有1.9億成人和2.2億兒童患有變應(yīng)性鼻炎，占中國總?cè)丝诘?3.26%和15.79%，而全球患病率也高達10%～40%[2-3]。受環(huán)境因素和生活習(xí)慣的影響，變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病數(shù)量也逐年增多，給患者的工作效率、生活質(zhì)量等產(chǎn)生了很大的負(fù)面影響，此外，變應(yīng)性鼻炎治療不當(dāng)還可引起哮喘的發(fā)作和影響其控制[4]，為此變應(yīng)性鼻炎在全球公共衛(wèi)生隱患中受到極大關(guān)注。

麻黃附子細(xì)辛湯出自張仲景的《傷寒論》，可達到溫經(jīng)解表、宣肺散寒、扶正祛邪的作用，方中麻黃可發(fā)汗解表；附子可有溫經(jīng)通脈、助陽散寒之效；細(xì)辛能夠散寒解表、宣通鼻竅[5]。據(jù)相關(guān)文獻表明[6]，麻黃附子細(xì)辛湯能夠升高AR大鼠血漿中IFN-γ含量，降低IL-13含量，以達到恢復(fù)Th1/Th2免疫失衡狀態(tài)的效果，提示了麻黃附子細(xì)辛湯可以對變應(yīng)性鼻炎起到良好的免疫調(diào)節(jié)作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這一名詞由英國研究者Hopkins AL初次提出，它是基于系統(tǒng)生物信息學(xué)，通過綜合運用各類組學(xué)、網(wǎng)絡(luò)可視化等技術(shù)[7]，建立“中藥復(fù)方成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)，多成分、多靶點、系統(tǒng)性地對中藥復(fù)方治療疾病的分子機制進行研究分析，對中藥復(fù)方配伍及中醫(yī)整體觀念的研究具有獨特的優(yōu)勢[8]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)推測麻黃附子細(xì)辛湯醫(yī)治變應(yīng)性鼻炎的潛在分子機制，為后期相關(guān)研究提供理論依據(jù)和新的研究思路。

資料與方法

1 麻黃附子細(xì)辛湯活性成分的篩選

借助TCMSP數(shù)據(jù)庫，分別以“麻黃（Mahuang）”、“附子（Fuzi）”、“細(xì)辛（Xixin）”為關(guān)鍵詞，搜索出各中藥的所有活性成分以及各成分的口服生物利用度（OB）和藥物相似性（DL）。根據(jù)相關(guān)文獻[9]，設(shè)定兩個閾值進行篩選，即：OB≥30%、DL≥0.18，對搜索到的化合物進行過濾。

2 中藥活性成分作用靶標(biāo)的預(yù)測

利用TCMSP平臺，挑選得到候選活性化合物所對應(yīng)的潛在靶標(biāo)，并將其輸入UniProt平臺（http：//www.uniprot.org/）中的UniProt知識庫（UniProt KB），設(shè)定物種為人，最后將查詢到的所有化合物活性成分靶點統(tǒng)一進行標(biāo)準(zhǔn)化。

3 AR疾病相關(guān)靶蛋白的收集

以“allergic rhinitis”作為檢索詞，分別在Dis-GeNET平臺（https：//www.disgenet.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）以及GeneCards數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org/）進行檢索，以獲得目前已知的與變應(yīng)性鼻炎相關(guān)的疾病靶點。根據(jù)相關(guān)文獻[10]，score值越高則表示該靶標(biāo)與疾病的聯(lián)系越緊密，若得到的靶標(biāo)過多則按照score值＞中位數(shù)的靶標(biāo)作為該疾病的潛在靶標(biāo)。

4 關(guān)鍵靶點的篩選

為明確變應(yīng)性鼻炎相關(guān)靶點與麻黃附子細(xì)辛湯潛在靶點的相互作用，利用R軟件程序包對疾病靶點與麻黃附子細(xì)辛湯中藥物活性成分預(yù)測靶點取交集并繪出韋恩圖。

5 PPI拓?fù)鋵W(xué)分析

以基因名的形式將篩選得到的關(guān)鍵靶點上傳到String平臺（https：//string-db.org /），建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（protein protein interaction，PPI），最后將獲得的PPI網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape軟件進行拓?fù)鋵W(xué)分析。

6 藥物-疾病共同靶點基因本體功能（GO）與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

借助基迪奧生物信息云平臺（OmicShare）（https：//www.omicshare.com/），對藥物-疾病共同靶點進行GO富集分析和KEGG信號通路分析，將結(jié)果按P值的大小排序，取前20條通路進行可視化分析。

7 麻黃附子細(xì)辛湯治療AR相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

依托Cytoscape（3.8.0）軟件分別建立出麻黃附子細(xì)辛湯的活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖和麻黃附子細(xì)辛湯治療變應(yīng)性鼻炎的核心靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖。圖中的節(jié)點（node）是活性成分、靶點等，而節(jié)點與節(jié)點之間的連接則稱為邊（edge）。節(jié)點的大小及連接的線條代表節(jié)點之間的聯(lián)系，節(jié)點越大或線條連接得越多表示該節(jié)點越重要。

8 分子對接驗證

從PubChem平臺獲取麻黃附子細(xì)辛湯治療AR關(guān)鍵化合物的結(jié)構(gòu)，再利用ChemOffice將其進行優(yōu)化。在RCSB PDB平臺下載AR關(guān)鍵靶蛋白的分子結(jié)構(gòu)，并利用PyMOL軟件去除水分子和無效小分子配體。依托AutoDock（1.5.6）工具和Vina進行分子對接，獲得關(guān)鍵化合物與關(guān)鍵靶蛋白的對接效果，并將最佳構(gòu)象利用PyMOL工具進行可視化展示。

結(jié) 果

1 麻黃附子細(xì)辛湯中活性成分及預(yù)測靶點的獲取

在TCMSP平臺中共篩選出麻黃附子細(xì)辛湯的已知化學(xué)成分620種，包括麻黃363種，附子65種，細(xì)辛192種。在通過了以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選條件后，總共獲得了麻黃附子細(xì)辛湯52個活性成分，其中來源于麻黃23個，附子21個，細(xì)辛8個，列出主要的中藥活性成分，內(nèi)容見表1。查詢出麻黃附子細(xì)辛湯蛋白靶點共計227個，并將預(yù)測出的所有蛋白靶點名稱借助UniProt平臺（http：//www.uniprot.org/）轉(zhuǎn)換為基因名。

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2 疾病靶點的獲取及核心靶點的篩選

依托DisGeNET、OMIM以及GeneCards平臺，分別在上述數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)頁檢索框中輸入關(guān)鍵詞“allergic rhinitis”后，得到的靶點個數(shù)分別為446、1、1034，匯總?cè)ブ睾?，得?01個疾病靶點。將得到的301個疾病靶點與227個藥物活性成分靶點借助R軟件取交集并繪制韋恩圖（見圖1）。結(jié)果獲得30個藥物活性成分與疾病的共同靶點，即：PTGS2、ADRB2、DPP4、PPARG、NOS2、BCL2、ICAM1、GSTP1、AHR、AKR1B1、VEGFA、PLAU、MMP9、MAPK1、HIF1A、IL1B、CCL2、CXCL8、IL2RA、PLAT、SERPINE1、IFNG、IL1A、PARP1、PPARA、SPP1、IL4、CHRM3、CAT、NOX1。將篩選得到的關(guān)鍵靶點以基因名的形式上傳到String平臺并進行拓?fù)鋵W(xué)分析，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。

圖2 PPI拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果圖

圖3 生物過程（BP）

圖4 分子功能（MF）

圖5 細(xì)胞組成（CC）

3 基因本體功能與通路富集分析

借助基迪奧生物信息云平臺（OmicShare）（https：//www.omicshare.com/）對麻黃附子細(xì)辛湯與變應(yīng)性鼻炎的30個共同靶點進行基因本體功能（GO）富集分析和KEGG通路分析。將所得的結(jié)果根據(jù)P值的大小排列，并依次以排序前20項的條目形式列出生物學(xué)過程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）以及細(xì)胞組成（Cellular Component，CC），并依次繪出柱狀圖，見圖3-5。結(jié)果顯示，在藥物-疾病共同靶點上共富集的生物學(xué)過程17743條，分子功能過程18408條，細(xì)胞組成18579條。其中主要涉及的生物學(xué)過程有：細(xì)胞對外界刺激的反應(yīng)、細(xì)胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)、細(xì)胞對有機物的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、對含氧化合物的反應(yīng)等；主要涉及的分子功能有：細(xì)胞因子活性、信號受體結(jié)合、受體配體的活性、受體調(diào)節(jié)器活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合等；主要涉及的細(xì)胞組成有：細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)部分、質(zhì)膜外側(cè)、富含ficolin-1的顆粒管腔、分泌顆粒等；在進行藥物-疾病共同靶點KEGG通路分析后，共富集出197條通路，其中排名前20條的為：流體剪切力和動脈粥樣硬化、AGE- RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、IL-17信號通路、癌癥、美洲錐蟲病、Th17細(xì)胞分化、HIF-1信號通路等，見表2，將結(jié)果繪制成氣泡圖，見圖6。

圖6 KEGG前20條氣泡圖

圖7 麻黃附子細(xì)辛湯活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

圖8 靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖

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4 相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

依托Cytoscape（3.8.0）工具分別建立出麻黃附子細(xì)辛湯的活性成分-靶點圖和麻黃附子細(xì)辛湯治療變應(yīng)性鼻炎的核心靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，見圖7-8。其中，麻黃附子細(xì)辛湯的活性成分-靶點圖中共有60個節(jié)點（node）和104條邊（edge），麻黃附子細(xì)辛湯治療變應(yīng)性鼻炎的核心靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖中共有51個節(jié)點和170條邊。

5 分子對接驗證結(jié)果

將PPI拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果中5個節(jié)點度最高的靶蛋白（IL1B、VEGFA、PTGS2、HIF1A、ICAM1）與“麻黃附子細(xì)辛湯活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖”中的主要化合物kaempferol（山奈酚）、quercetin（槲皮素）、luteolin（木犀草素）、naringenin（柚皮素）分別依次在AutoDock（1.5.6）軟件中進行分子對接驗證。結(jié)果見表3。當(dāng)受體與配體的結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol時則表示分子與蛋白靶點之間具有較好的結(jié)合活性[11]。驗證結(jié)果顯示，麻黃附子細(xì)辛湯主要活性成分與AR疾病關(guān)鍵靶點的結(jié)合活性在-5.7kcal/mol至-9.6kcal/mol之間，表明麻黃附子細(xì)辛湯主要活性成分與AR疾病關(guān)鍵靶點之間形成的構(gòu)象結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，具有較好的結(jié)合活性。另外，由表3可見，luteolin（木犀草素）與5個靶蛋白結(jié)合能最低，利用PyMOL軟件對木犀草素與核心靶蛋白的最佳結(jié)合構(gòu)象進行可視化分析，見圖9。

表3 主要化合物與核心靶蛋白分子對接結(jié)果

圖9 木犀草素與核心靶蛋白對接圖

討 論

變應(yīng)性鼻炎屬于中醫(yī)“鼻鼽”“鼽嚏”等范疇，大量研究表明，運用麻黃附子細(xì)辛湯治療變應(yīng)性鼻炎能取得一定的療效。方中麻黃是麻黃科植物的干燥草質(zhì)莖，麻黃的主要化學(xué)成分為生物堿、黃酮類、揮發(fā)油類等，具有平喘、發(fā)汗、利尿、抗炎抗過敏等作用[12]，其中，麻黃中的水提物和乙醇提取物可抑制肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺等化學(xué)介質(zhì)，具有抗變態(tài)反應(yīng)的作用[13]；現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示[14]，附子具有強心、抗癌、抗炎等作用；細(xì)辛能夠抗病毒抗菌、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等，其中，細(xì)辛中的甲基丁香酚、芝麻脂素具有明顯的抗炎作用[15]。

本研究中藥物-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖顯示，麻黃附子細(xì)辛湯治療AR的主要化合物依次為槲皮素、木犀草素、山柰酚、柚皮素、豆甾醇等。槲皮素是一種天然存在的多酚類黃酮化合物，它可以抑制組胺等化學(xué)介質(zhì)的產(chǎn)生，可以調(diào)節(jié)Th1/Th2的穩(wěn)定性，具有抗氧化、抗炎抗過敏以及免疫調(diào)節(jié)的作用，對相關(guān)的變應(yīng)性疾病有著廣泛的應(yīng)用[16]。木犀草素主要通過調(diào)節(jié)NF-κB、AP-1、STAT3等轉(zhuǎn)錄因子達到一定的抗炎作用，有研究表明木犀草素可通過調(diào)節(jié)變應(yīng)性鼻炎大鼠的 TLR4/NF-κB 信號通路和調(diào)整Th1/Th2 失衡狀態(tài)以改善鼻黏膜炎癥[17]。山奈酚可降低小鼠血清中的組胺、腫瘤壞死因子-α、IL- 8等，具有抗過敏作用[18]。柚皮素能顯著改善變應(yīng)性鼻炎大鼠的鼻黏膜組織，且能降低大鼠血清中IgE、IL4及IL5值，對變應(yīng)性鼻炎大鼠具有一定的保護作用[19]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，在獲得的主要活性成分中，大多來源于麻黃，這可能與麻黃在研究變應(yīng)性鼻炎方面更為廣泛有關(guān)。在對得到的30個核心靶點進行拓?fù)鋵W(xué)分析后顯示，VEGF-A、IL1B、PTGS2、HIF1A、等可能是麻黃附子細(xì)辛湯發(fā)揮治療AR作用的重要靶點，其中血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A）是VEGF家族中研究最多的一種，具有促進血管生成、增加血管通透性、參與血管重塑以及促進受損黏膜組織修復(fù)等作用[20]，相關(guān)研究顯示，血管內(nèi)皮生長因子在變應(yīng)性鼻炎患者中有較高的表達[21]，說明VEGF-A與變應(yīng)性鼻炎鼻黏膜重塑有關(guān)。IL1B基因中第5外顯子rs1143634使IL-1β分泌增加，而在變應(yīng)性鼻炎患者抗原激發(fā)后其鼻腔分泌物中IL-1β水平會顯著增高，亦有研究發(fā)現(xiàn)IL-1β與過敏性疾病的炎癥進展呈現(xiàn)正相關(guān)，這說明IL1B與變應(yīng)性鼻炎的炎癥有著密切的聯(lián)系[22-23]。綜上，麻黃附子細(xì)辛湯的多個核心靶點對變應(yīng)性鼻炎的炎癥狀態(tài)、鼻黏膜重塑、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮作用。

通過富集分析，得出197條麻黃附子細(xì)辛湯與變應(yīng)性鼻炎相關(guān)的通路。其中流體剪切力和動脈粥樣硬化這一信號通路為麻黃附子細(xì)辛湯對變應(yīng)性鼻炎的第一作用通路，流體剪切力和動脈粥樣硬化與NF-κB炎癥信號的激活有關(guān)[24]。AGE-RAGE信號通路與神經(jīng)和外周血管的修復(fù)、再生密切相關(guān)[25]，有研究報告，AGE-RAGEs影響著細(xì)胞的凋亡和增殖、參與細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)過程[26]。IL-17信號通路是變應(yīng)性鼻炎機制研究較多的通路之一，是由T輔助細(xì)胞（Th17）產(chǎn)生，可激活NF-κB、MAPKs等多種信號通路以誘導(dǎo)促炎趨化因子和細(xì)胞因子的表達，在防御反應(yīng)、過敏性疾病以及自身免疫疾病中起著重要作用[27-28]。從富集結(jié)果來看，對麻黃附子細(xì)辛湯治療變應(yīng)性鼻炎的研究主要可以通過流體剪切力和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用、IL-17信號通路、癌癥、美洲錐蟲病、Th17細(xì)胞分化、HIF-1信號通路等進行。

在得到的分子對接結(jié)合能中，我們發(fā)現(xiàn)木犀草素與5個關(guān)鍵靶蛋白的總結(jié)合能最高，說明木犀草素可能是麻黃附子細(xì)辛湯治療AR的核心化合物。

借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)對麻黃附子細(xì)辛湯治療AR的分子機制從多成分、多靶點、多信號通路進行預(yù)測，為麻黃附子細(xì)辛湯治療變應(yīng)性鼻炎的作用機制提供了一定的理論依據(jù)和研究方向。但由于本研究主要借助相關(guān)網(wǎng)絡(luò)平臺信息，對獲得的結(jié)論還需通過相關(guān)實驗進行進一步驗證。