補脾養心方對心脾兩虛證失眠小鼠補益心脾及改善睡眠的研究

廖艷 熱依拉·吐爾遜 高鑫 樂娜 劉冰清 楊彩玲 張建軍 田世民 王淳

《中國失眠障礙診斷和治療指南》顯示[1],失眠是睡眠障礙的一種,其特征為頻繁而持續的入睡困難或睡眠維持困難并導致睡眠滿意度不足,長期睡眠障礙易出現疲勞、精神萎靡、情緒不穩等癥狀。在我國,失眠的發病率高達30%[2],目前對其根治仍無較好措施。中醫在調理失眠特別是早期失眠即亞健康失眠方面具有獨特優勢[3]。辨證思想是中醫藥的精髓,中醫認為,思慮傷脾、暗耗心血,心神失養誘發的心神不安是失眠的常見類型,治則多以養血安神,補益心脾為主[4]。因此,本研究擬選擇失眠常見的中醫證候心脾兩虛證[5],復制心脾兩虛亞健康失眠小鼠模型,在臨床經驗方“補脾養心方”(酸棗仁、茯苓、靈芝、刺五加、五味子)的基礎上[6],探討該方對于心脾兩虛亞健康失眠小鼠的補益心脾功效和睡眠改善作用,為后續辨證保健應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性昆明小鼠60只,體質量18～22 g,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,許可證編號:SCXK(京)2019-0010。動物飼養于SPF級動物房,給予小鼠普通飼料,自由飲水,室溫(22±2)℃,相對濕度為60%～70%,燈照周期為12小時。實驗通過北京中醫藥大學醫學與實驗動物倫理委員會審查,符合相關倫理學要求。

1.2 實驗藥物

酸棗仁(批號:19062705)、靈芝(批號:20170101)、刺五加(批號:180605002)、茯苓(批號:20071901)、五味子(批號:18101102)、人參歸脾丸(批號:20035001)均購自北京同仁堂;戊巴比妥鈉(上海伊卡生物技術有限公司,批號:20170611)、巴比妥鈉(北京虹湖聯合化工產品有限公司,批號:570471)、鹽酸普萘洛爾片(江蘇亞邦愛普森藥業有限公司,批號:1703098)。

1.3 實驗儀器

定制玻璃游泳箱(規格:75 cm×55 cm×40 cm)、離心機(德國Eppendorf)、全自動生化儀(UZS-300X)、電子天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)、電子秤(賽多利斯科學儀器北京有限公司)、制冰機(松下冷鏈大連有限公司)、冷凍切片機(CryoStar NX50)、超分辨顯微組織成像系統(Leica)。

1.4 補脾養心方的制備

補脾養心方用藥組成為酸棗仁、靈芝、刺五加、茯苓、五味子,因該方目前在專利申請階段,故本文暫略去其劑量及比例,但根據文獻[6]換算后小鼠灌胃低、中、高劑量的濃度分別是:0.15 g/mL,0.3 g/mL,0.6 g/mL。取5倍處方量藥材,加水(10倍藥材量)(V1),浸泡12小時過夜。濾出浸泡液,測定體積(V2),計算吸水倍數。再加水至藥材完全浸沒,測定體積(V3),計算加水倍數。

加水10倍量,浸泡1小時,煎煮3次,每次45分鐘,合并濾液,沸騰濃縮至120 mL,使藥液含藥量達到0.6 g/mL。將120 mL濃縮藥液分成3份,分別為65 mL、35 mL、20 mL。取35 mL藥液加水35 mL,使藥液含藥量變為0.3 g/mL,得到70 mL含藥量0.3 g/mL的藥液,即中劑量組藥液。取20 mL藥液加水60 mL,使含藥量變為0.15 g/mL,得到80 mL含藥量0.15 g/mL的藥液,即低劑量組藥液。每周煮藥1次,共4次。

1.5 人參歸脾丸藥液的配制

陽性對照藥為人參歸脾丸,每丸重9 g,根據文獻數據[4],小鼠給藥濃度為0.5 g/mL。

1.6 分組與給藥方法

將60只雄性昆明小鼠適應性喂養7日后,隨機分為空白對照組、模型組、陽性對照組(5 g/kg)、補脾養心方低(1.5 g/kg)、中(3 g/kg)、高劑量組(6 g/kg),每組10只。每日上午給予空白對照組小鼠生理鹽水,其余各組給予相應劑量的藥物,灌胃劑量0.1 mL/10 g,根據體質量變化調整灌胃量,連續給藥30天。灌胃第27～30天,空白對照組每日下午給予生理鹽水,其余各組給予鹽酸普萘洛爾溶液1.5 mg/100 g,灌胃劑量0.1 mL/10 g,每日1次,連續4日。

1.7 體質量與攝食量測定

于實驗開始第1天、第14天、第21天、第28天記錄各組小鼠體質量,觀察給藥后各組小鼠體質量變化;于實驗第1天、第14天、第28天稱量各組小鼠24小時內攝食量。

1.8 胸腺、脾臟指數測定

實驗第30天,各組小鼠眼球取血后,立即剖腹稱取胸腺和脾臟,計算胸腺、脾臟指數。

1.9 睡眠時間和睡眠潛伏期的測定

通過預實驗判定末次給藥后各組小鼠腹腔注射55 mg/kg戊巴比妥鈉、30 mg/kg戊巴比妥鈉(最大閾下催眠劑量)、300 mg/kg巴比妥鈉,注射量均為0.1 mL/10 g,測定小鼠翻正反射,超過60秒仍無法翻正,則為進入睡眠并記錄各組小鼠入睡動物數,以此觀察小鼠對直接睡眠實驗、戊巴比妥鈉睡眠實驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗和巴比妥鈉睡眠潛伏實驗的影響。

1.10 力竭負重游泳時間和懸尾不動時間測定

力竭負重游泳從灌胃開始的第16日起,灌胃給藥結束1小時后,除空白對照組外,其余各組進行負重力竭游泳運動,首先計算各組小鼠體質量的5%作為負荷重量,并制作相應劑量的鉛塊,實驗開始前,將對應的鉛塊固定在小鼠尾部,隨即將小鼠放入定制的游泳箱內,水溫(20±5)℃,水深25 cm,確保小鼠掉入水中時尾巴不能接觸到游泳箱底部。每箱放入2只,從小鼠進入游泳箱內開始計時。

力竭游泳的判斷標準:小鼠運動失調,頭部無法浮出水面,并且沉入水底超過5～8秒無法上浮。此時立刻將小鼠撈出水面,記錄力竭游泳時間;同時將小鼠放入平坦桌面,開始記錄小鼠懸尾不動時間。

1.11血清指標測定實驗結束后,各組小鼠過夜禁食16小時,稱重并處死。迅速眼球取血,血液樣本靜置2小時后,離心取上清進行谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)和肌酸激酶(creatine kinase,CK)含量檢測。

1.12小鼠心肝脾和肌肉組織病理學檢查實驗結束后,各組小鼠過夜禁食16小時,稱重并處死。迅速采集肝臟、心臟組織、脾臟、肌肉組織樣本。取相同部位心、肝、脾、肌肉組織,甲醇固定24小時脫水,石蠟包埋,切片后蘇木素—伊紅(HE)染色,400倍光鏡下觀察心、肝、脾、肌肉組織形態變化。

2 結果

2.1 對體質量的影響

實驗第14天、21天和28天,與空白對照組比較,模型組體質量明顯下降;與模型組相比,陽性對照組、補脾養心方低、中、高劑量組體質量明顯上升,差異有統計學意義(P<0.05)。結果見表1。

表1 補脾養心方對各組小鼠體質量的影響

2.2 對攝食量的影響

實驗第14天,與模型組相比,陽性對照組小鼠攝食量增加;實驗第28天,與空白對照組比較,模型組小鼠攝食量明顯減少;與模型組相比,陽性對照組、補脾養心方低、中、高劑量組攝食量明顯增加,差異均有統計學意義(P<0.05)。結果見表2。

表2 補脾養心方對各組小鼠攝食量的影響

2.3 對力竭游泳時間和懸尾不動時間的影響

與空白對照組比較,模型組小鼠力竭游泳時間明顯縮短,懸尾不動時間明顯延長;與模型組相比,陽性對照組、補脾養心方低、中、高劑量組小鼠力竭游泳時間明顯延長,懸尾不動時間明顯縮短,差異有統計學意義(P<0.01)。結果見表3。

表3 補脾養心方對各組小鼠力竭游泳和懸尾不動時間的影響

2.4 對胸腺指數、脾臟指數的影響

與空白對照組比較,模型組小鼠胸腺指數和脾臟指數均有明顯下降;與模型組比較,陽性對照組、補脾養心方低、中、高劑量組小鼠胸腺指數和脾臟指數均有提高,差異均有統計學意義(P<0.05)。結果見表4。

表4 補脾養心方對各組小鼠胸腺指數、脾臟指數的影響

2.5 對睡眠的影響

在直接睡眠行為學實驗中,各組小鼠均無產生直接睡眠(P>0.05)。與空白對照組相比,模型組睡眠時間明顯縮短,并延長了睡眠潛伏期;與模型組相比,陽性對照組和補脾養心方低、中、高劑量組均延長了睡眠時間,縮短了睡眠潛伏期,發生了閾下劑量的睡眠行為,差異均有統計學意義(P<0.05)。結果見表5。

表5 補脾養心方對各組小鼠睡眠的影響

2.6 對血清ALT、AST、ALP的影響

與空白對照組比較,模型組小鼠ALT、AST、ALP含量明顯升高;與模型組比較,陽性對照組、補脾養心方低、中、高劑量組的ALT、AST、ALP含量降低,差異有統計學意義(P<0.01)。結果見表6。

表6 補脾養心方對各組小鼠血清ALT、AST、ALP的影響

2.7 對血清CK、LDH的影響

與空白對照組比較,模型組小鼠CK和LDH含量明顯升高;與模型組比較,陽性對照組、補脾養心方低、中、高劑量組小鼠CK和LDH均降低,差異有統計學意義(P<0.01)。結果見表7。

表7 補脾養心方對各組小鼠血清CK、LDH的影響

2.8 對小鼠心、肝、脾、肌肉組織的影響

2.8.1 對小鼠心臟組織的影響 與空白對照組相比,模型組細胞間隙增大,部分線粒體形態結構不完整;陽性對照組、補脾養心方低、中、高劑量組細胞間隙正常,心肌纖維排列整齊,陽性對照組和補脾養心方高劑量組改善更明顯。詳見圖1。

注A 空白對照組;B 模型組;C 陽性對照組;D 補脾養心方低劑量組;E 補脾養心方中劑量組;F 補脾養心方高劑量組。圖1 補脾養心方對各組小鼠心臟組織的影響(HE,×400)

2.8.2 對小鼠肝臟組織的影響 與空白對照組比較,模型組肝細胞密集、體積縮小,核密度增大,細胞間隙大,雙核細胞增多,細胞質中出現空泡。與模型組相比,陽性對照組、補脾養心方低、中、高劑量組小鼠肝細胞形態趨于正常,細胞圓潤,細胞間隙明顯縮小,空泡和雙核細胞出現較少,陽性對照組和補脾養心方高劑量組改善更明顯。詳見圖2。

注A 空白對照組;B 模型組;C 陽性對照組;D 補脾養心方低劑量組;E 補脾養心方中劑量組;F 補脾養心方高劑量組。圖2 補脾養心方對各組小鼠肝臟組織的影響(HE,×400)

2.8.3 對小鼠脾臟組織的影響 與空白對照組相比,模型組紅白髓分界不清晰,結構不完整,出現紊亂,呈現出散在的小團狀;與模型組比較,陽性對照組、補脾養心方低、中、高劑量組脾臟紅白髓界限逐漸清晰,結構完整,呈現出完整的形狀,淋巴細胞密度增大。詳見圖3。

注A 空白對照組;B 模型組;C 陽性對照組;D 補脾養心方低劑量組;E 補脾養心方中劑量組;F 補脾養心方高劑量組。圖3 補脾養心方對各組小鼠脾臟組織的影響(HE,×400)

2.8.4 對小鼠肌肉組織的影響 與空白對照組相比,模型組小鼠肌肉組織染色改變,肌纖維間隙增大,出現部分炎性細胞浸潤;與模型組相比,陽性對照組、補脾養心方低、中、高劑量組小鼠肌纖維間隙明顯縮小,炎性細胞較少,肌纖維排列趨于整齊。詳見圖4。

注A 空白對照組;B 模型組;C 陽性對照組;D 補脾養心方低劑量組;E 補脾養心方中劑量組;F 補脾養心方高劑量組。圖4 補脾養心方對各組小鼠肌肉組織的影響(HE,×400)

3 討論

失眠證又稱“不寐”。中醫學認為,不寐的總體病機可概括為陰陽失交,臟腑氣血功能失調[7-9]。心脾兩虛,本在脾虛,脾胃為氣血生化之源,心主血脈、主神志,若氣血生化乏源,則無以濡養心神,心神失養而進一步導致失眠[10]。現代臨床研究中,心脾兩虛證常表現為乏力、疲勞、心悸等,故治則多以補益心脾、寧心安神為主[11]。基于對1081例診斷為失眠患者的診療信息進行整合,發現失眠患者多以虛證為主,尤以心脾兩虛證居多[5]。故本研究結合中醫辨證論治及辨證保健的思想[12],并在前期組方“補脾養心方”的基礎上[6],探討該方對心脾兩虛亞健康失眠小鼠補益心脾和改善睡眠的作用。

補脾養心方由酸棗仁、靈芝、茯苓、刺五加、五味子組成。其中酸棗仁和靈芝酸甘化陰,滋肝血以調暢情志,補心氣以安神助眠;茯苓利水滲濕以健脾寧心;刺五加補益心脾,益氣養血;五味子酸溫,斂心氣,助酸棗仁、靈芝、茯苓健脾寧心。據《中成藥辭典》[13]和《衛生部藥品標準中藥成方制劑》第四冊[14]記載,人參歸脾丸處方來源于《濟生方》中歸脾湯,適用于思慮過度、心脾兩虛所致的心悸怔忡、失眠健忘等,故選擇具有益氣補血、健脾養心功效的人參歸脾丸作為陽性對照藥進行本次研究。

目前的失眠模型多使用氯苯丙氨酸誘導[15],其優勢在于操作方便、耗時短且成功率較高,但該誘導更偏向于評價疾病狀態。李貴海[16]使用多平臺水環境法建立睡眠剝奪大鼠模型,探究養心安神法對其改善睡眠作用;徐立等[17]用每日負重游泳+實驗后四天灌服心得安溶液、皮下注射利血平建立心脾兩虛失眠模型。本實驗在上述模型研究的基礎上,結合亞健康失眠人群特點,基于已有文獻[18],使用行為學與灌服心得安藥物的方式復制心脾兩虛亞健康失眠小鼠模型開展研究。

心脾兩虛證候評價要素中,小鼠一般狀態、體質量和攝食量是其評價體系中常用的生理狀態指標。灌胃一周至兩周后,模型組小鼠體質量開始下降,攝食量減少,提示模型組小鼠表現出心脾兩虛證候的指征。力竭游泳時間和懸尾不動時間這兩項行為學實驗也是評價心脾兩虛的有力指標[19]。《素問·痿論篇》云:“脾主身之肌肉[20]。”即脾氣健運,則肌肉豐盈而有活力,反之則肌肉痿縮不用。漢代張仲景提出:“虛勞虛煩不得眠。”本研究中模型組小鼠力竭游泳時間明顯縮短且其懸尾不動時間延長,符合脾虛證候的判別要素。此外,模型組小鼠心臟組織出現少量炎癥改變,肝臟組織細胞體積縮小,脾臟組織分界模糊,肌肉組織肌纖維斷裂等病理學改變。綜上,通過基本生理指標、行為學和病理學分析,表明本實驗所復制的模型小鼠具備了心脾兩虛證候特征。

研究表明,LDH和CK是與睡眠相關的生物標記物[21]。CK、LDH常用作心肌能量代謝以及骨骼肌損傷和修復的重要標志。本研究中模型組小鼠CK和LDH升高,提示CK和LDH可能在改善睡眠和心脾兩虛證候中起著重要的調節作用。胸腺和脾臟是重要的免疫器官,可以直接反映機體的免疫力[22],正常的睡眠—覺醒周期又高度依賴于機體免疫系統的調節功能[23]。模型組小鼠脾臟和胸腺指數降低,提示其免疫功能下降,也反映其睡眠狀態不佳和心脾兩虛的證候。

本研究探討了補脾養心方對心脾兩虛失眠小鼠的補益心脾作用,相比模型組,補脾養心方低、中、高三個劑量組和陽性對照組小鼠力竭游泳時間明顯延長,懸尾不動時間縮短;心、肝、脾、肌肉組織病理變化均有所好轉,表明心脾兩虛癥狀明顯改善,且補脾養心方可以延長睡眠時間、縮短睡眠潛伏期,降低戊巴比妥鈉閾下劑量,提示對小鼠睡眠情況也有所改善。此外,補脾養心方三個劑量組均能下調血清中ALT、AST、ALP含量,使其趨于正常水平,提示可能有一定的保肝作用且安全性較好。另外,相較于人參歸脾丸,補脾養心方藥味精簡,無明顯禁忌人群,且安全性和適用性良好。

綜上,補脾養心方對心脾兩虛亞健康失眠小鼠具有良好的補益心脾功效和改善睡眠作用,為其后續的辨證保健研究及中醫對亞健康健康管理模式[24]提供了實驗基礎,但該方改善睡眠的可能作用機制還有待深入研究。