Cav3.2 基因在盆底電刺激治療小鼠壓力性尿失禁中的作用及其機制

劉劍鋒, 湯劍明, 陽 蓮, 張舒飛, 洪 莉

（武漢大學人民醫院婦產科，湖北 武漢 430060）

女 性 壓 力 性 尿 失 禁 （stress urinary incontinence，SUI）是指女性患者腹壓升高時尿液不自主外漏，多見于經產婦和高齡女性患者，其發病率逐年升高，嚴重影響了患者的生活質量和心理健康［1-2］。SUI 的治療方法主要分為手術和非手術治療。對于輕中度SUI 患者和無法接受手術治療的患者多采用行為療法、盆底肌鍛煉和藥物治療等非手術治療，其中盆底電刺激（pelvic floor electrical stimulation，PES）治療作為非手術治療方法之一，能有效防治SUI，但其治療相關機制尚未完全闡明［3-4］。研究［5-6］發現：盆底支持結構細胞外基質（extracellular matrix，ECM）重構是SUI 的主要發病機制，包含Ⅰ型膠原（collagen type Ⅰ，ColⅠ）、Ⅲ型膠原（collagen type Ⅲ，Col Ⅲ）和細胞內Ca2+濃度等一系列變化。T 型鈣通道是一種電壓依賴型Ca2+通道，在盆底組織中廣泛分布，在神經電生理、激素分泌和平滑肌收縮等生理過程中發揮重要作用。T 型鈣通道蛋白包括 Cav 3.1、Cav 3.2 和Cav 3.3，本課題組前期研究［7-8］已經證實：在小鼠成纖維細胞中以Cav 3.2 為主，且Cav 3.2 參與了PES 治療并升高細胞內Ca2+濃度。本研究在野生型和Cav 3.2 基因敲除型小鼠SUI 模型上觀察電刺激產生的盆底膠原水平變化及其與Cav 3.2 基因的作用關系，進一步探討PES 治療SUI 的作用及其相關機制，為臨床SUI 治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器選取8～10 周、體質量17～22 g、雌性、未生育的C57BL/6 小鼠30 只，由武漢大學人民醫院實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004，小鼠Cav 3.2 基因敲除委托北京維通利華實驗動物技術有限公司進行，購自美國Jackson 實驗室（編號：013707）。0.25% 胰蛋白酶、磷酸鹽（phosphate buffer solution，PBS）緩沖液和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）［翌圣生物科技（上海）股份有限公司］，青-鏈霉素、兔抗小鼠整合素β1、鈣蛋白酶2、ColⅠ和ColⅢ多克隆抗體（美國 Santa 公司），山羊抗兔多克隆抗體（英國Abcam 公司）。鋼制砝碼（上海眾淵公司），超凈工作臺、25 cm2細胞培養瓶、6 孔細胞培養板和CO2培養箱（香港Healforce 公司），離心機（德國Eppendorf 公司）。

1.2 實驗動物造模和分組采用4%異氟烷氣體吸入麻醉小鼠，采用校正的6-Fr 弗利導尿管確保尖端球囊密閉性良好，石蠟油潤滑并將其緩慢插入小鼠陰道，采用 5 /0 絲線收縮陰道周圍皮膚將導尿管固定，向球囊內注入0.3 mL 生理鹽水擴張陰道，導尿管末端固定于手術臺緣高度的定滑輪，滑輪末端懸掛鋼制砝碼30 g 牽引1 h 后撤去牽引球囊，放水后拔出導尿管，拆除縫線，繼續常規飼養［9-11］。根據干預措施將30 只C57BL/6 小鼠分為對照組［未進行陰道擴張（vaginal dilatation，VD）造模］、VD 組（VD 造模）和VD+PES 組（VD 造模聯合PES）。每組各10 只小鼠，均按隨機原則分組。根據基因型和干預措施將小鼠分為WT-VD 組（野生型VD 造模）、WT-VD+PES 組（野生型VD 造模聯合PES）、KO-VD 組（Cav 3.2 敲除型VD 造模）和KO-VD+PES 組（Cav 3.2 敲除型VD 造模聯合PES）。

1.3 小鼠PES 實驗異氟烷氣體麻醉小鼠后，采用直徑 3 mm 的針灸針自制電刺激針電極，放置并固定在小鼠陰道內，連接 Powerlab 35 生理信號采集系統，并采用 LabChart7.2 軟件設置參數：恒流 2 mA，頻率 50 Hz，脈沖刺激，每日1 次，每次15 min，連續刺激7 d［12］。

1.4 Masson 染色觀察各組小鼠尿道和陰道前壁組織中ColⅠ和ColⅢ膠原纖維沉積情況和膠原纖維表達水平頸椎脫臼處死并取小鼠尿道和陰道前壁組織，4%多聚甲醛固定后石蠟包埋切片。切片脫蠟至水，依次采用自來水和蒸餾水洗滌，蘇木精染液染核10 min，清洗后再采用Masson 麗春紅酸性復紅液染色10 min，0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻。95%酒精和無水酒精脫水各5 min，二甲苯透明5 min，最后用中性膠封片。待封片吹干后于光學顯微鏡下觀察各小組小鼠尿道和陰道前壁組織中ColⅠ和ColⅢ膠原纖維沉積情況。膠原纖維呈藍色，肌纖維胞質呈紅色，細胞核呈藍褐色。采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析儀測量系統，選擇HSI 模式（將吸管顏色設定為黃色），設置H 117～200、S 0～255 和I 180～240 參數。測量各組小鼠膠原纖維陽性表達區域總積分吸光度（A）值，每張切片取 5 個視野（上、下、左、右和中央），定量檢測 Masson 染色切片的積分A值，計算平均A 值，以平均A 值代表各組小鼠ColⅠ和ColⅢ膠原纖維表達水平。平均A值=總積分A 值/測量區域總面積。

1.5 小鼠尿動力學參數測定異氟烷氣體麻醉小鼠后，暴露膀胱并將硬膜外導管插入膀胱并縫合固定于導管上，置管后第2 天進行尿動力學檢測。將膀胱導管分別連接至注射泵和壓力轉換器上，計算機收集轉換器信號并進行數據處理。小鼠仰臥位，排空膀胱，1 mL·min－1注入生理鹽水，當尿道口出現第1 滴尿液時的注入量為膀胱最大容積（maximum bladder capacity，MBC），此時膀胱內壓力記錄為漏尿點壓力（leakage point pressure，LPP）。各測量 3 次取平均值。

1.6 Western blotting 法檢測各組小鼠尿道和陰道前壁組織中整合素β1、鈣蛋白酶2、ColⅠ及ColⅢ蛋白表達水平頸椎脫臼處死并取小鼠尿道和陰道前壁組織，液氮磨碎組織并加入裂解液冰上裂解30 min，超聲1 min，充分裂解后4 ℃、12 000 r·min－1離心15 min，取上清液，采用 BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測樣品蛋白濃度。10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質，采用全濕電轉移法將蛋白質分子轉移至PVDF 膜上，TBST 溶液洗滌PVDF膜1次5 min，室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h。分別采用一抗孵育，整合素1 （1 ∶1 000）、鈣蛋白酶2（1∶1 000）、ColⅠ（1∶1 000）、ColⅢ（1∶1 000）和內參 GAPDH （1∶1 000），4 ℃搖床過夜。次日TBST 溶液洗膜 3 次，每次10 min，置入帶有羊抗兔熒光標記的相應二抗稀釋液 （1∶1 000）室溫下避光孵育1 h，TBST 溶液洗膜3 次，每次5 min，Odyssey 雙色紅外激光成像系統掃描收集熒光信號，獲取并分析蛋白條帶。實驗獨立重復 3 次，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1.7 統計學分析采用SPSS 22.0 統計軟件進行統計學分析。各組小鼠尿道和陰道前壁組織中ColⅠ及ColⅢ膠原纖維表達水平，MBC 和LPP，整合素β1、鈣蛋白酶2、ColⅠ和ColⅢ蛋白表達水平均符合正態分布，以±s 表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用 LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠尿道和陰道前壁組織中COL Ⅰ及COL Ⅲ膠原纖維表達水平與對照組比較，VD 組小鼠尿道和陰道前壁組織中Col Ⅰ及Col Ⅲ膠原纖維表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。與VD 組比較，VD+PES 組小鼠尿道和陰道前壁組織中Col Ⅰ及Col Ⅲ膠原纖維表達水平明顯升高（P＜0.01）。與WT-VD 組比較，WT-VD+PES 組小鼠尿道和陰道前壁組織中Col Ⅰ及Col Ⅲ膠原纖維表達水平明顯升高（P＜0.01）。與WT-VD+PES組比較，KO-VD 組和KO-VD+PES 組小鼠尿道和陰道前壁組織中Col Ⅰ及Col Ⅲ膠原纖維表達水平明顯降低（P＜0.01）；KO-VD 組和KO-VD+PES 組小鼠尿道和陰道前壁組織中Col Ⅰ及Col Ⅲ膠原纖維表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1～3。

圖1 Masson 染色檢測各組小鼠尿道和陰道前壁組織中Col Ⅰ及Col Ⅲ膠原纖維沉積情況（×200）Fig.1 Deposition of Col Ⅰ and Col Ⅲ collagen in urethral and anterior vaginal wall tissue of mice in various groups detected by Masson staining（×200）

圖2 Masson 染色檢測各組小鼠尿道和陰道前壁組織中Col Ⅰ及Col Ⅲ膠原纖維表達（×200）Fig.2 Expressions of Col Ⅰ and Col Ⅲ collagen fibers in urethral and anterior vaginal wall tissue of mice in various groups detected by Masson staining（×200）

圖3 各組小鼠尿道和陰道前壁組織中ColⅠ及Col Ⅲ膠原纖維表達水平Fig.3 Expression levels of Col Ⅰ and Col Ⅲ collagen fibers in urethral and anterior vaginal wall tissue of mice in various groups

2.2 各組小鼠尿動力學功能參數與對照組比較，VD 組小鼠MBC 和LPP 均降低（P＜0.05）。與VD 組比較，VD+PES 組小鼠MBC 和LPP 均升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠MBC 和LPPTab.1 MBC and LPP of mice in various groups(n=10，±s）

表1 各組小鼠MBC 和LPPTab.1 MBC and LPP of mice in various groups(n=10，±s）

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with VD group.

LPP（P/cmH2O）38.37±2.62 24.83±3.93*29.33±3.25△Group Control VD VD+PES MBC（V/mL）0.11±0.01 0.07±0.01*0.08±0.01△

2.3 各組小鼠尿道和陰道前壁組織中ColⅠ及ColⅢ蛋白表達水平與對照組比較，VD 組小鼠尿道和陰道前壁組織中Col Ⅰ及Col Ⅲ蛋白表達水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。與VD 組比較，VD+PES 組小鼠尿道和陰道前壁組織中Col Ⅰ及Col Ⅲ蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.01）。與WT-VD組比較，WT-VD+PES 組小鼠尿道和陰道前壁組織中Col Ⅰ及Col Ⅲ蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）。與WT-VD+PES 組比較，KO-VD 組和KO-VD+PES 組小鼠尿道和陰道前壁組織中ColⅠ及Col Ⅲ蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01）。KO-VD 組和KO-VD+PES 組小鼠尿道和陰道前壁組織中Col Ⅰ及Col Ⅲ蛋白表達水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖4 和5。

圖4 Western blotting 法檢測各組小鼠尿道和陰道前壁組織中ColⅠ和Col Ⅲ蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.4 Electrophoregram(A) and histograms(B) of expressions of Col Ⅰ and Col Ⅲ proteins in urethral and anterior vaginal wall tissue of mice in various groups detected by Western blotting method

圖5 Western blotting 法檢測各組小鼠尿道和陰道前壁組織中ColⅠ及Col Ⅲ蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.5 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of Col Ⅰ and Col Ⅲ proteins in urethral and anterior vaginal wall tissue of mice in various groups detected by Western blotting method

2.4 各組小鼠尿道和陰道前壁組織中整合素β1 和鈣蛋白酶2 蛋白表達水平與WT-VD 組比較，WT-VD+PES 組小鼠尿道和陰道前壁組織中整合素β1 及鈣蛋白酶2 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）。KO-VD 組和KO-VD+PES 組小鼠尿道及陰道前壁組織中整合素β1 和鈣蛋白酶2 蛋白表達水平比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖6 和7。

圖6 Western blotting 法檢測各組小鼠尿道和陰道前壁組織中整合素β 1 及鈣蛋白酶2 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.6 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of integrin β 1 and calpain 2 proteins in urethral and anterior vaginal wall tissue of mice in various groups detected by Western blotting method

圖7 Western blotting 法檢測各組小鼠尿道和陰道前壁組織中整合素β 1 及鈣蛋白酶2 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.7 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of integrin β 1 and calpain 2 proteins in urethral and anterior vaginal wall tissue of mice in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

隨著人口老齡化和人們對生活質量要求的提高，女性SUI 受到廣泛關注，衰老、重體力勞動和分娩對SUI 的發生有較大影響，其中陰道分娩是 SUI 最主要的危險因素，在妊娠和陰道分娩過程中盆底神經、肌肉和結締支持組織等發生不可逆的損傷［13-14］。盆底包括骨盆結構、盆底肌群和神經血管等軟組織，各組織在結構和功能上共同構成了復雜的盆底結構，在維持子宮、膀胱和直腸等盆腔器官處于正常位置起支撐作用。分娩過程中陰道和盆底組織肌肉等受到牽拉和擠壓從而產生了機械牽拉及組織缺氧缺血等一系列損傷，造成了盆底支持功能減弱，從而形成SUI［15-16］。

本研究結果顯示：與對照組比較，VD 組小鼠MBC 和LPP 均降低，表明SUI 模型制備成功，進一步證實陰道模擬分娩造成了盆底組織的損傷和尿動力學功能的影響。經PES 電刺激干預后，小鼠的MBC、LPP 和盆底組織中ColⅠ及ColⅢ膠原纖維和蛋白表達水平均升高，證實PES 治療在SUI 及盆底損傷中起保護作用。

研究［12］顯示：在SUI 發生過程中，盆底支持結構ECM 重構是SUI 的重要發病機制。本課題組前期研究［7-8］發現：Cav 3.2 T 型Ca2+通道在小鼠成纖維細胞的興奮等電生理過程中起重要作用。本研究結果顯示：Cav 3.2 基因敲除后，KO-VD 組和KO-VD+PES 組小鼠尿道和陰道前壁組織中 ColⅠ及ColⅢ膠原纖維和蛋白表達水平比較差異無統計學意義；與WT-VD 組比較，WT-VD+PES 組小鼠尿道和陰道前壁組織中 ColⅠ及ColⅢ膠原纖維和蛋白表達水平明顯升高，表明Cav 3.2 基因缺失阻斷了PES 的治療作用，也一定程度提示Cav 3.2在PES 治療方面的重要作用。

研究［17-18］發現：SUI 患者盆底組織細胞中Ca2+水平降低影響其與鈣蛋白酶2 結合，進而抑制其活性，影響膠原合成，造成盆底組織張力下降。鈣蛋白酶2 可激活整合素β1，從而增強膠原合成作用［8，19］。本研究結果顯示：與WT-VD 組比較，WT-VD+PES 組小鼠尿道和陰道前壁組織中整合素β1 及鈣蛋白酶2 蛋白表達水平明顯升高，KOVD 組與KO-VD+PES 組小鼠尿道和陰道前壁組織中整合素β1 及鈣蛋白酶2 蛋白表達水平比較差異無統計學意義，提示小鼠PES 可能通過 Cav3.2 鈣通道蛋白激活鈣蛋白酶2 和整合素β1，Cav 3.2 基因的敲除會阻斷電刺激激活鈣蛋白酶2 及整合素β1，進而影響盆底膠原的生成。

T 型鈣通道Cav 3.2 廣泛分布于盆底結締組織中，參與肌肉興奮-收縮耦合和細胞生長調節，在調節細胞內外Ca2+濃度中起關鍵作用［20］。而鈣蛋白酶2 作為一種鈣調蛋白酶，具有Ca2+依賴性。研究［21-22］顯示：鈣蛋白酶2 能夠作用于整合素活化的直接上游蛋白talin 1，在其N 端和C 端均可進行切割，釋放的頭端有獨立于全長talin 1 以外的功能。PES 能夠誘導激活鈣蛋白酶2，切割完整的talin 1蛋白的頭端，進而激活整合素β1。提示整合素β1可能通過轉化生長因子β1/Smad 信號通路調節盆底膠原表達。

本研究針對野生型小鼠和基因敲除型小鼠進行VD 造模和PES 干預，在蛋白分子和尿動力學水平證實了PES 的治療作用及Cav 3.2 基因對PES 的影響；提示PES 可能通過 Cav 3.2 鈣通道蛋白激活鈣蛋白酶2 和整合素β1，促進盆底膠原的生成，進而達到促進盆底修復的治療作用。