GRK5 過表達對P301S Tau 轉基因小鼠抑郁樣行為的影響及其機制

章天珍, 沈洪濤, 龔 正, 趙 斌, 王 巖

（1.廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經(jīng)病學研究所 廣東省衰老相關心腦疾病重點實驗室，廣東 湛江524001；2.廣東醫(yī)科大學實驗動物中心，廣東 湛江 524001）

G 蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCR）激酶5（GPCR kinases 5，GRK5）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，調節(jié)GPCR 的磷酸化和脫敏［1-2］。GRK5 與微管蛋白和α-突觸核蛋白等非GPCR 底物磷酸化有關聯(lián)［3-4］。GRK5 可參與多種疾病進展，如社交障礙、成癮行為、精神分裂癥和帕金森病等，也參與心血管疾病及癌癥等疾病過程［5-12］。研究［13］顯示：GRK5 與抑郁有關，參與抑郁的進展。Tau 蛋白改變不僅是阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的主要病理表現(xiàn)之一，亦與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關［14］。研究［15］顯示：Tau 蛋白沉積很可能是重度抑郁癥的基礎。P301S Tau 轉基因小鼠以朊病毒蛋白啟動子（prion protein promoter，Prnp）插入P301S 突變基因，表達人源Tau 蛋白，其表達量約為小鼠內源性Tau 蛋白表達量的5 倍。6 月齡P301S 小鼠可表現(xiàn)出空間認知障礙、后肢癱瘓和精神異常等行為學表現(xiàn)，病理上出現(xiàn)Tau 蛋白過度磷酸化、膠質細胞激活和突觸損傷等［16-18］。研究［13］證實：Tau 增強N-甲基-D- 天冬氨酸受體 （N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）依賴性去電位，NMDAR 是興奮性谷氨酸鹽神經(jīng)遞質的受體，在腦內廣泛分布，與神經(jīng)元突觸傳遞、突觸可塑性、學習記憶、疼痛和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等密切相關。當NMDAR 功能低下時，其與重度抑郁癥（major depressive disorder，MDD）的發(fā)病過程有關，表明攜帶P301S 突變基因的Tau 小鼠可能與抑郁表現(xiàn)有關，GRK5 對P301S Tau 轉基因小鼠抑郁樣行為的影響尚未完全闡明。本研究采用腦立體定位儀向小鼠海馬區(qū)中注射GRK5 過表達病毒，探討GRK5 對P301S Tau 轉基因小鼠抑郁樣行為的影響，進一步闡明其病理過程及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、病毒、主要試劑和儀器3 月齡P301S Tau 轉基因小鼠購自江蘇華創(chuàng)信諾醫(yī)藥科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2020-0009。飼養(yǎng)于室溫（22±2）℃、相對濕度（60±5）%、12 h 光照/12 h 黑暗周期環(huán)境中，自由進食。GRK5 過表達腺相關病毒購自上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司。BCA 試劑盒購自美國Novagen 公司，Western blotting 抗體稀釋液和免疫熒光抗體稀釋液購自上海碧云天生物技術有限公司。腦立體定位注射儀購自德國Neurostar 公司，OLYMPUS FV3000 激光掃描共聚焦顯微鏡購自日本Olympus 公司，懸尾儀和強迫游泳儀購自北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司。

1.2 動物分組和處理P301S Tau 轉基因小鼠在標準環(huán)境下飼養(yǎng)，小鼠5 月齡時，采用5%水合氯醛麻醉 （0.9 mL·100 g－1），脫毛暴露頭部皮膚，將小鼠固定于腦立體定位儀，剪開頭皮暴露前后囟門，將前囟設為0 點，根據(jù)小鼠腦圖譜設置注射參數(shù)，前后：－2.3 mm，左右：±2.0 mm，背腹：－1.8 mm。根據(jù)上述參數(shù)在顱骨相應位置鉆孔。采用微量進樣器給予小鼠每側海馬區(qū)1.5 μL病毒，注射速度0.1 μL·min－1。每次注射結束后，針頭停留5 min。結束后，縫合傷口，將小鼠安放于溫暖環(huán)境。17 只雄性P301S Tau 小鼠隨機分為空白對照組（n=6，不進行任何處理）、陰性對照組（n=5，雙側海馬區(qū)注射GRK5 陰性對照腺相關病毒）和過表達組（n=6，雙側海馬區(qū)注射GRK5 腺相關病毒并插入目的基因空載體AAV-GRK5-EGFP-3FLAG）。

1.3 糖水偏好實驗檢測各組小鼠糖水偏好率實驗開始前訓練小鼠適應含糖飲水：每籠同時放置2 個水瓶，第一個24 h 內給予2 瓶1%蔗糖水；隨后的24 h 內，給予1 瓶1 %蔗糖水和1 瓶純水。實驗開始后，首先禁食禁水24 h，再給予1 瓶1 %蔗糖水和1 瓶純水，實驗期間每6 h 更換水瓶位置，24 h 后，取2 瓶水稱質量，計算各組小鼠糖水偏好率。小鼠糖水偏好率＝糖水消耗量/總液體消耗量×100%。

1.4 懸尾實驗（tail suspension test，TST）檢測各組小鼠不動時間百分率將小鼠尾部距末端約2 cm 處采用膠帶固定，倒懸于30 cm× 25 cm×25 cm 箱內的支架上，使小鼠頭部距箱底約5 cm。懸掛時間為6 min，統(tǒng)計后4 min 內不動時間，計算各組小鼠不動時間百分率。不動時間百分率=4 min 內不動時間（min）/240 min×100%。

1.5 強迫游泳實驗（forced swimming test，F(xiàn)ST）檢測各組小鼠不動時間百分率在直徑15 cm，高50 cm 透明玻璃圓缸內，裝入30 cm 深的清水，水溫（23±2）℃，實驗開始后將小鼠放入水中，測試持續(xù)時間為6 min，統(tǒng)計小鼠后4 min 內不動時間。實驗結束后，將小鼠從水中移出，擦干水放回籠中，計算各組小鼠不動時間百分率。不動時間百分率=4 min 內不動時間（min）/240 min×100%。

1.6 Western blotting 法檢測各組小鼠海馬組織中神經(jīng)功能相關蛋白表達水平取各組小鼠半腦海馬組織，加入裂解液進行研磨，4 ℃離心提取蛋白，采用BCA 法測定各樣品蛋白濃度。蛋白樣品加入Loading Buffer 后，100 ℃煮沸5 min，上樣量為30 μg。60 V 電壓電泳直至樣品到達分離膠，調節(jié)電壓至100 V 電泳直至溴酚藍在分離膠底部。200 V 恒壓轉膜2 h 后，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，GRK5（1∶200），小膠質細胞標記物抗體（ionized calciumbiding adapter molecule 1，IBA1）（1∶500），膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）（1∶1 000），突觸小泡蛋白（synatotagmin，SYN）（1∶1 000），突觸后致密蛋白95（postsynaptic density 95，PSD95）（1∶1 000），神經(jīng)元特異性核蛋白（neuronspecific nuclear protein，NeuN）（1∶1 000），Tau T205（1∶1 000），β-actin（1∶1 000），TBST 緩沖液洗滌3 次，每次10 min；室溫下孵育二抗羊抗鼠或羊抗兔（1∶10 000）1 h；TBST 緩沖液洗滌3 次，每次10 min，ECL 發(fā)光液使條帶顯影。以β-actin 為內參，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平＝目的蛋白條帶灰度值／內參蛋白條帶灰度值。

1.7 免疫熒光染色檢測各組小鼠海馬組織中IBA1、NeuN 和GFAP 表達情況小鼠麻醉后，4%多聚甲醛灌注取腦組織，采用10%、20%和30%蔗糖梯度脫水，OCT 包埋劑包埋腦組織，存放于－80℃環(huán)境中。采用冰凍切片機切10 μm 薄片，PBS 緩沖液室溫下洗滌3 次，每次5 min，4%多聚甲醛固定20 min，PBS 緩沖液室溫下洗滌3 次，每次5 min，通透液作用10 min，PBS 緩沖液室溫下洗滌3 次，每次5 min，10%山羊血清室溫下封閉30 min，孵育一抗IBA1（1∶200），GFAP（1∶200），NeuN（1∶500），4 ℃過夜，PBS 緩沖液室溫下洗滌3 次，每次5 min，室溫孵育熒光二抗1 h，DAPI染色3 min。采用OLYMPUS FV3000 共聚焦顯微鏡拍攝熒光圖像并記錄各組小鼠海馬組織中IBA1、NeuN 和GFAP 表達情況。

1.8 統(tǒng)計學分析采用GraphPad Prism6.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組小鼠糖水偏好率、不動時間百分率、海馬組織中神經(jīng)功能相關蛋白GRK5、IBA1、GFAP、SYN、PSD95、NeuN 和 Tau T205 蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以x±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用Tukey 事后檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠糖水偏好率和不動時間百分率糖水偏好實驗檢測結果顯示：與空白對照組比較，陰性對照組小鼠糖水偏好率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與空白對照組和陰性對照組比較，過表達組小鼠糖水偏好率升高（P＜0.05）。TST 和FST檢測結果顯示：與空白對照組比較，陰性對照組小鼠不動時間百分率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與空白對照組和陰性對照組比較，過表達組小鼠不動時間百分率升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠糖水偏好率和不動時間百分率Tab.1 Sugar-water perference rate and percentages of immobility time of mice in various groups (±s，η/%）

表1 各組小鼠糖水偏好率和不動時間百分率Tab.1 Sugar-water perference rate and percentages of immobility time of mice in various groups (±s，η/%）

*P＜0.05 compared with blank control group；ΔP＜0.05 compared with negative control group.

Group Blank control Negative control Over-expression Percentage of immobility time in TST 14.70±13.46 12.64±6.07 44.03±16.17*Δ n655 Sugar-water perference rate 43.40±19.88 38.56±13.21 78.65±5.47*Δ Percentage of immobility time in FST 13.65±11.77 15.46±3.85 46.46±16.83*Δ

2.2 各組小鼠海馬組織中神經(jīng)功能相關蛋白表達水平Western blotting 法檢測結果顯示：與空白對照組和陰性對照組比較，過表達組小鼠海馬組織中GRK5、Tau T205 和IBA1 蛋白表達水平升高（P＜0.05），SYN 蛋白表達水平降低（P＜0.05），GFAP、NeuN 和PSD95 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1 和表2。

圖1 各組小鼠海馬組織神經(jīng)功能相關蛋白表達電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of neurological funcion-related-proteins in hippocampus tissue of mice in various groups

表2 各組小鼠海馬組織中GRK5、Tau T205、IBA1、GFAP、NeuN、PSD95 和SYN 蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of GRK5, Tau T205, IBA1, GFAP, NeuN, PSD95, and SYN proteins in hippocampus tissue of mice in various groups[n=3，±s，ρB/（g·L－1）］

表2 各組小鼠海馬組織中GRK5、Tau T205、IBA1、GFAP、NeuN、PSD95 和SYN 蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of GRK5, Tau T205, IBA1, GFAP, NeuN, PSD95, and SYN proteins in hippocampus tissue of mice in various groups[n=3，±s，ρB/（g·L－1）］

*P＜0.05 compared with blank control group；ΔP＜0.05 compared with negative control group.

Group Blank control Negative control Over-expression SYN 1.05±0.07 1.05±0.08 0.74±0.10*Δ GRK5 0.98±0.02 1.25±0.30 2.56±0.14*Δ Tau T205 1.08±0.10 1.24±0.04 1.54±0.11*Δ IBA1 1.07±0.13 1.29±0.12 2.03±0.27*Δ GFAP 1.05±0.05 1.14±0.08 1.05±0.10 NeuN 0.85±0.22 0.69±0.09 0.57±0.13 PSD95 1.02±0.03 1.12±0.09 1.06±0.10

2.3 各組小鼠海馬組織中增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescence protein，EGFP）表達免疫熒光染色檢測結果顯示：與空白對照組比較，陰性對照組和過表達組小鼠海馬組織中均有EGFP 表達，表明病毒成功注射至海馬區(qū)。腦細胞中EGFP 主要與NeuN 發(fā)生共定位，而小膠質細胞和星形膠質細胞中幾乎未觀察到EGFP，表明EGFP 主要在神經(jīng)元細胞核中表達。與陰性對照組比較，過表達組小鼠海馬組織中EGFP 表達更集中于神經(jīng)元的細胞核中。見圖2。

圖2 各組小鼠海馬組織中EGFP 和NeuN 表達（免疫熒光，×10）Fig.2 Expressions of EGFP and NeuN in hippocampus tissue of mice in various groups(Immunofluorescence,×10)

2.4 GRK5 過表達后各組小鼠海馬組織中小膠質細胞數(shù)和星形膠質細胞數(shù)與空白對照組和陰性對照組比較，過表達組小鼠海馬組織中小膠質細胞數(shù)增加（P＜0.05），星形膠質細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明GRK5 主要影響小膠質細胞的激活。見圖3 和4。

圖3 各組小鼠海馬組織中小膠質細胞數(shù)Fig.3 Number of microglia in hippocampus tissue of mice in various groups

圖4 各組小鼠海馬組織中星形膠質細胞數(shù)Fig.4 Number of astrocytes in hippocampus tissue of mice in various groups

3 討 論

抑郁癥是目前常見的心理疾病，是以持久的情緒低落、思維遲緩、認知功能損害、意志活動減退和軀體癥狀為主要臨床特征的一類心境障礙［19］。其病因不清，發(fā)病機制復雜，涉及基因遺傳、人格和環(huán)境等多種因素，目前研究的機制有炎癥反應假說、單胺類神經(jīng)遞質及其受體假說、谷氨酸及其受體假說、下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamicpituitary-adrenal，HPA）軸功能失調假說、神經(jīng)營養(yǎng)因子假說和多因素綜合等［20］。研究［13］顯示：GRK5 基因與抑郁篩查量表患者健康問卷（patient health questionnaire，PHQ）評分顯著相關，通過對具有社會經(jīng)濟特性的湯森德剝奪指數(shù)（townsend deprivation index，TDI）組成的數(shù)據(jù)進行分析并以TDI 為環(huán)境因子進行全基因組基因-環(huán)境相互作用研究，確定了GRK5 為抑郁的候選基因之一。研究［5］顯示：在曠場試驗中，GRK5 缺陷小鼠在中心區(qū)的時間較其野生型同窩小鼠延長，但在TST 和FST 中表現(xiàn)正常，表明GRK5 缺陷小鼠可表現(xiàn)出焦慮樣行為。

本研究結果顯示：與空白對照組和陰性對照組比較，過表達組小鼠海馬組織中GRK5 和IBA1 蛋白表達水平升高；與空白對照組比較，陰性對照組和過表達組小鼠海馬組織均有EGFP 表達，表明在P301S Tau 小鼠海馬組織中實現(xiàn)了GRK5 的過表達，提示GRK5 過表達的小鼠模型構建成功。

P301S Tau 小鼠GRK5 過表達后，在無壓迫環(huán)境中糖水偏好率升高，在TST 和FST 壓迫環(huán)境中小鼠不動時間百分率升高，表現(xiàn)為抑郁樣行為。這種矛盾的行為學表現(xiàn)可能與環(huán)境有關，表明GRK5可能是抑郁的風險基因，這項結果與YE 等［13］研究結果一致，該風險基因GRK5 可以與環(huán)境等因素協(xié)同作用誘導抑郁樣行為的發(fā)生。

抑郁癥發(fā)病與海馬組織體積減小、神經(jīng)元衰亡和丟失及突觸和神經(jīng)發(fā)生減少等神經(jīng)可塑性改變有關［21］。SYN 缺失可能導致突觸間信息傳遞功能缺損，進而導致神經(jīng)元突觸可塑性受損，引發(fā)抑郁癥等多種認知及情感相關精神障礙［22］。研究［15，23］顯示：Tau 蛋白積累與抑郁的發(fā)生有關聯(lián)。本研究結果顯示：GRK5 過表達后，P301S Tau 小鼠海馬組織中小膠質細胞明顯增生，Tau T205 蛋白表達水平升高，提示抑郁癥發(fā)病機制可能與海馬組織和Tau 蛋白有關聯(lián)。

GRK5 是一種多功能蛋白，在不同類型的細胞中均有表達，在不同的信號傳導過程中GRK5 在亞細胞器中表達存在差異。GRK5 可調節(jié)GPCR，也可與非GPCR 相關蛋白和DNA 自身相互作用［24］。心肌細胞在促肥大刺激條件下，GRK5 易位至細胞核，并且在核內積累，促進活化的T 細胞核內因子（nuclear factor of activated T-cells，NFAT）活性，從而介導核內信號轉導［25］。GRK5 在神經(jīng)元中過表達可負性調控5-羥色胺受體介導的細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）通路激活，以介導核內信號的傳導［9］。本研究結果顯示：過表達的GRK5 蛋白主要出現(xiàn)在神經(jīng)元核內，表明GRK5 具有入核功能，提示模型小鼠抑郁樣行為表現(xiàn)可能與GRK5 在神經(jīng)元核內積累有關聯(lián)。

綜上所述，GRK5 過表達P301S Tau 小鼠海馬組織中小膠質細胞增生，SYN 和NeuN 蛋白表達減少等病理改變可能與GRK5 入核并在核中表達增加有關聯(lián)，從而誘導抑郁樣行為。