羥基脲聯合輻射對沉默ATRX 后細胞周期及凋亡的影響

田宏遠, 尹彩云, 王 麗, 胡沛蕓, 張晨陽, 李秋月, 鄭清照, 齊亞莉, 方 芳, 王志成

（1.吉林大學公共衛生學院 國家衛健委放射生物學重點實驗室，吉林 長春 130021；2.吉林醫藥學院公共衛生學院流行病學教研室，吉林 吉林 132013）

羥基脲（hydroxyurea，HU）是一種結構簡單的化學合成物，對核糖核苷酸還原酶（ribonucleotide reductase，RNR）起抑制作用［1］。RNR 參與DNA 復制和修復的重要環節，核糖核苷酸在RNR 作用下脫氧被還原為DNA 合成過程中所需要的原料［2］。研究［3］發現：HU 誘導骨肉瘤U2OS 細胞凋亡。HU 上調凋亡相關基因和蛋白表達誘發細胞的氧化應激，并在小鼠卵母細胞成熟期間導致細胞凋亡［4］。研究［5-7］報道：α-地中海貧血/精神發育遲滯綜合征 X 染色體相關蛋白（α-thalassemia/mental retardation syndrome nondeletion type X-chromosome associated protein，ATRX）是重要的DNA 損傷修復和染色質重塑蛋白。本課題組前期研究［8］結果顯示：沉默ATRX可以增強輻射誘導HeLa 細胞的凋亡，可以作為腫瘤輻射增敏的潛在靶點。因此，本研究探討HU 預處理聯合輻射對沉默ATRX 細胞周期及凋亡的影響，并分析相關分子機制，為腫瘤放療增敏提供新的分子靶點和思路。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器靶向沉默ATRX 的慢病毒由吉林大學國家衛健委放射生物學重點實驗室包裝和保存，A549 細胞和HEK293T 細胞（上海生命科學學院細胞研究所）。Annexin Ⅴ-PE/7-ADD 凋亡試劑盒（美國BD 公司），ATRX 一抗和ECL 發光試劑盒（美國Santa Cruz 公司），GAPDH、細胞周期分裂因子25B （cell division cyclin 25B，CDC25B）、細胞周期蛋白（Cyclin）B1和細胞周期蛋白依賴性激酶1 （cyclin dependent kinase 1，CDK1）一抗（美國CST 公司），DMEM培養基（美國Gibco 公司），胎牛血清（江蘇MRC公司），HU（美國Sigma 公司），其他試劑為國產分析純。流式細胞儀（美國BD FACS Aria 公司），X 射線輻照儀（X-RAD320iX，美國Precision X-ray股份有限公司）。

1.2 沉默ATRX 細胞模型的制備本課題組［7］前期構建了靶向沉默ATRX 的shRNA 載體，采用HEK293T 細胞包裝靶向沉默ATRX 慢病毒，并感染A549 細胞，嘌呤霉素篩選構建穩定沉默ATRX的細胞模型shATRX-A549，熒光顯微鏡下觀察細胞感染情況，采用Western blotting 法檢測沉默ATRX 細胞中ATRX 蛋白表達量驗證細胞模型，以shNC-A549 細胞作為陰性對照。

1.3 實驗分組和處理實驗分為對照組、HU 組、輻射組（給予8 Gy X 射線輻射）和HU+輻射組（給予HU+8 Gy X射線輻射）。細胞經0.1 mmol·L－1HU 處理24 h 后給予8 Gy X 射線輻射，劑量率1.02 Gy·min－1，電壓180 kV，電流12.0 mA。

1.4 流式細胞術檢測各組不同細胞周期A549 細胞百分率和細胞凋亡率將shNC-A549 和shATRXA549 細胞按照每孔2×105個的密度接種于6 孔細胞培養板，待細胞達80%～90%融合，HU 處理細胞24 h 后，8 Gy X 射線輻射，24 h 后加入300 μL無EDTA 的胰酶消化，PBS 緩沖液洗滌1 次后，重懸細胞，加入500 μL 預冷的75%冰乙醇，4 ℃冰箱內固定 2 h，PBS 緩沖液洗滌1 次，重懸細胞，過濾。每管加入終濃度 50 mg·L－1PI 30 μL 和10%Triton X-100 2 μL 混勻。反應條件4 ℃，避光30 min，采用流式細胞術檢測各組不同細胞周期細胞百分率，CellQuest 軟件收集細胞，ModFit 軟件分析結果。細胞消化后，PBS 緩沖液洗滌1 次，加入Binding Buffer 懸浮細胞100 μL，加入AnnexinⅤ-PE 和7-AAD 各5 μL 混勻，避光室溫反應10 min，每管補充Binding Buffer 400 μL，吹打混勻后上機檢測，細胞凋亡率以百分率表示。

1.5 RNA 測序（RNA-sequencing，RNA-seq）檢測沉默ATRX 后A549 細胞中mRNA 表達提取shNC-A549 和shATRX-A549 細胞總RNA，采用試劑盒去除樣品中摻雜的核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA），將mRNA 片段化后，采用逆轉錄試劑盒合成cDNA，修復末端，并在3′端加A 堿基，PCR 擴增后，采用Agilent 2100 Bioanalyzer 對片段進行對比和檢測，同時采用Illumina 的測序技術測序，對表達顯著差異基因mRNA 通過Gene Set Enrichment Analysis （GSEA）和 Ingenuity Pathway Analysis（IPA）軟件對相應的信號通路進行分析和歸納，并進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析（華大基因公司）。

1.6 Western blotting 法檢測各組細胞中CDC25B、Cyclin B1 和CDK1 蛋白表達量將shNC-A549 和shATRX-A549 細胞按照每孔1×107個細胞的密度接種于6 孔細胞培養板，待細胞生長至80%～90%融合，0.1 mmol·L－1HU 處理24 h 后，8 Gy X 射線輻射，輻射后24 h 收集細胞，并加入裂解液RIPA 100 μL，提取總蛋白后進行定量，取40 μg 蛋白加入5×Loading Buffer，100 ℃變性10 min 后上樣。濃縮膠80 V，分離膠120 V，SDS-PAGE 電泳后轉膜緩沖液4 ℃中過夜濕轉，5%脫脂奶粉封閉1 h后，GAPDH、CDC25B、Cyclin B1 和CDK1 一抗孵育2 h，TBST 洗滌3 次，每次10 min，加入由TBST 稀釋的HRP-二抗后孵育1 h，TBST 洗滌3 次，加入ECL 液A 液和B 液，暗室中曝光，拍照分析。以蛋白條帶灰度代表目的蛋白表達量。

1.7 統計學分析采用SPSS 24.0 統計軟件進行統計學分析。各組不同細胞周期細胞百分率和細胞凋亡率均符合正態分布，以±s 表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 沉默 ATRX 的 A549 細胞模型建立

HEK293T 細胞包裝靶向沉默ATRX 慢病毒后感染A549 細胞，經2 次感染后，熒光顯微鏡下觀察可見shNC-A549 和shATRX-A549 細胞表達綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP），表明感染成功，基因未丟失。見圖1。Western blotting法檢測結果顯示：與A549 和shNC-A549 細胞比較，shATRX-A549 細胞中ATRX 蛋白表達量明顯減少，表明細胞模型建立成功，可用于后續實驗。見圖2。

圖1 熒光顯微鏡下觀察A549 細胞中GFP 表達（Bar=200 μm）Fig.1 Expression of GFP in A549 cells observed under fluorescence microscope(Bar=200 μm)

圖2 Western blotting 法檢測各種細胞中ATRX 蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of ATRX protein in different kinds of cells in various groups detected by Western blotting method

2.2 各組不同細胞周期細胞百分率與對照組比較，HU 組shNC-A549 細胞中G0/G1期細胞百分率升高（P＜0.05），S 期和G2/M 期細胞百分率明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）；輻射組shNC-A549細胞中G0/G1和S 期細胞百分率明顯降低（P＜0.01），G2/M 期細胞百分率明顯升高（P＜0.01）；HU+輻射組shNC-A549 細胞中G0/G1期細胞百分率明顯降低（P＜0.01），S 期和G2/M 期細胞百分率明顯升高（P＜0.01）。與對照組比較，HU 組shATRX-A549 細胞中G0/G1期細胞百分率升高（P＜0.05），G2/M 期細胞百分率明顯降低（P＜0.01），S 期細胞百分率差異無統計學意義（P＞0.05）；輻射組shATRX-A549 細胞中G2/M 期細胞百分率明顯升高（P＜0.01），G0/G1期和S 期細胞百分率明顯降低（P＜0.01）；HU+ 輻射組shATRX-A549 細胞中G0/G1期細胞百分率明顯降低（P＜0.01），S 期和G2/M 期細胞百分率明顯升高（P＞0.01）。與shNC-A549 細胞比較，輻射組shATRX-A549 細胞中G0/G1期細胞百分率升高（P＜0.05），G2/M 期細胞百分率降低（P＜0.05）；HU+輻射組shATRX-A549 細胞中S 期細胞百分率升高（P＜0.05）。見圖3 和表1 及表2。

表1 各組不同細胞周期shNC-A549 細胞百分率Tab.1 Percentages of shNC-A549 cells at different cell cycles in various groups(n=4，±s，η/%）

表1 各組不同細胞周期shNC-A549 細胞百分率Tab.1 Percentages of shNC-A549 cells at different cell cycles in various groups(n=4，±s，η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group G2/M 6.81±1.40 1.62±0.35**49.53±0.56**47.41±0.94**Percentage of cells G0/G1 69.66±5.60 80.66±1.04*45.93±0.88**19.63±0.84**S Control HU Radiation HU+radiation 23.53±6.97 17.72±3.70*4.54±0.34**32.96±1.39**

表2 各組不同細胞周期shATRX-A549 細胞百分率Tab.2 Percentages of shATRX-A549 cells at different cell cycles in various groups(n=4，±s，η/%）

表2 各組不同細胞周期shATRX-A549 細胞百分率Tab.2 Percentages of shATRX-A549 cells at different cell cycles in various groups(n=4，±s，η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group S Control HU Radiation HU+radiation Percentage of cells G0/G1 73.71±0.35 78.04±0.58*50.06±1.44**18.01±0.12**G2/M 7.22±0.38 2.25±0.23**44.68±0.76**44.35±0.23**19.08±0.67 19.71±1.23 5.26±0.78**37.64±0.18**

圖3 流式細胞術檢測各組不同細胞周期A549 細胞百分率Fig.3 Percentages of cells at different cell cycles in A549 cells in various groups detected by flow cytometry

2.3 各組A549 細胞凋亡率與對照組比較，HU組、輻射組和 HU+ 輻射組 shNC-A549 和shATRX-A549 細胞凋亡率均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；與shNC-A549 細胞比較，HU 組和HU+輻射組shATRX-A549 細胞凋亡率升高（P＜0.05）。見圖4 和表3 及表4。

表3 各組shNC-A549 細胞凋亡率Tab.3 Apoptotic rates of shNC-A549 cells in various groups(n=4，±s，η/%）

表3 各組shNC-A549 細胞凋亡率Tab.3 Apoptotic rates of shNC-A549 cells in various groups(n=4，±s，η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group Control HU Radiation HU+radiation Apoptotic rate 1.91±0.38 6.21±0.68**5.53±0.72*24.37±0.83**

表4 各組shATRX-A549 細胞凋亡率Tab.4 Apoptotic rates of shATRX-A549 cells in various groups (n=4，±s，η/%）

表4 各組shATRX-A549 細胞凋亡率Tab.4 Apoptotic rates of shATRX-A549 cells in various groups (n=4，±s，η/%）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with control group.

Group Control HU Radiation HU+radiation Apoptotic rate 2.88±0.53 9.69±1.28**6.66±1.03*27.86±0.77**

2.4 沉默ATRX 后A549 細胞中mRNA 表達

RNA-seq 結果顯示：沉默ATRX 后A549 細胞中mRNA 差異表達主要表現在細胞周期調節等多個環節，且形成互作網絡主要以c-Myc、Esp1、Cdc20、Plk1、CycA/B、Cip1 和PCNA 為核心，其與DNA 復制、DNA 損傷和修復應答及細胞周期調節等細胞生物學進程有關。見圖5。

圖5 RNA-seq 檢測沉默ATRX 后A549 細胞中mRNA 的差異表達和相關通路Fig.5 Differential expressions of mRNA in A549 cells after silencing of ATRX detected by RNA-seq and relative signaling pathways

2.5 各組A549 細胞中CDC25B、Cyclin B1 和CDK1 蛋白表達量與對照組比較，HU 組、輻射組和HU+輻射組shNC-A549 和shATRX-A549 細胞中CDC25B、Cyclin B1 和CDK1 蛋白表達量減少。與shNC-A549 細胞比較，對照組和HU 組shATRX-A549 細胞中Cyclin B1 蛋白表達量略有減少，輻射組和HU+輻射組shATRX-A549 細胞中CDC25B、Cyclin B1 和CDK1 蛋白表達量均增加。見圖6。

圖6 Western blotting 法檢測各組細胞中CDC25B、Cyclin B1 和CDK1 蛋白表達電泳圖Fig.6 Electrophoregram of expressions of CDC25B,Cyclin B1, and CDK1 proteins in cells in various groups detected by Western blotting method

3 討 論

《2022 年全國癌癥報告》［9］顯示：肺癌的發病率和死亡率均占據首位且無性別差異。盡管外科手術仍是肺癌的主要治療方式，但對于肺癌患者，放化療結合的綜合治療在安全性和患者接納度上都因其無創性而更具優勢。隨著放療技術、醫學影像設備和精準醫療的發展，放射治療在肺癌治療中的優勢也更受到重視。放療技術已經被列為早期非小細胞肺癌的一線治療方法［10］。但放療術后癌癥的轉移和復發仍是影響其療效的主要因素，如何提高放療的效果非常關鍵。

細胞周期在電離輻射的暴露下會發生變化［11-13］。輻射后細胞DNA 放射性損傷，細胞周期發生阻滯，有利于細胞損傷的修復。本研究結果顯示：暴露在8 Gy 劑量X 射線下，輻射誘導shATRX-A549 細胞積累于G2/M 期，并同時消耗G0/G1期的細胞。而單獨采用周期特異性阻滯劑HU 處理shATRX-A549 細胞，HU 能夠導致細胞積聚于G0/G1期，發生特異性細胞周期阻滯［14］。HU和輻射聯合處理后，觀察到細胞在G2/M 和S 期積聚。沉默ATRX 給予A549 細胞更大的DNA 復制壓力，DNA 不易修復，損傷也隨之增加。HU 與輻射聯合處理使周期阻滯效應較分別單獨處理更加明顯。HU 聯合輻射使shATRX-A549 細胞中S 期細胞百分率升高，提示HU 和輻射對于A549 細胞周期阻滯效應不一致，且二者聯合處理會進一步擾亂細胞周期進程。

細胞凋亡是放射性殺傷腫瘤細胞的主要途徑［15］。當X 射線導致DNA 斷裂受損后，一旦細胞無法修復由X 射線造成的DNA 損傷，細胞就進入凋亡進程，對于腫瘤輻射增敏具有正向作用［16-17］。本研究結果顯示：與對照組比較，HU 單獨處理和HU+輻射聯合處理后shATRX-A549 細胞凋亡率升高。研究［18-19］證實：沉默ATRX 可上調凋亡蛋白PAPR1 的表達，激活凋亡過程中Caspase 級聯反應并誘導細胞凋亡。HU 作為廣泛應用的化療藥物可誘導細胞凋亡途徑的發生，單獨采用HU 處理和單獨輻射處理均可誘導A549 細胞凋亡。對于沉默ATRX 的A549 細胞，在X 射線輻射基礎上加用HU 處理，細胞凋亡率較單獨輻射處理誘導的細胞凋亡率更高，凋亡作用更加顯著，提示HU 增加輻射對shATRX-A549 細胞的促凋亡效應。

DNA 復制與損傷修復相關的生物學進程主要發生在細胞S 期［20-22］。輻射通過誘導DNA 斷裂殺傷細胞，因此大部分易被輻射殺傷的細胞處于G1和G2期，而處于S 期細胞可以通過周期檢查點的激活減少被阻滯。HU 特異性影響細胞周期進程，使HU 增加輻射誘導的G2/M 期細胞阻滯并誘導發生S 期阻滯，可能與HU 阻礙復制叉活動有關［23］。復制叉停止前進導致共濟失調毛細血管擴張RAD3 相關蛋白/細胞周期檢查點激酶1 的S 期檢查點受到抑制，干擾細胞周期調控［24-25］。本研究對細胞周期檢查點相關蛋白進行檢測，發現G2/M 期相關蛋白CDK1、Cyclin B1 和CDC25B 蛋白表達量均降低，提示CDC25B/Cyclin B/CDK1 通路參與誘導shATRX-A549 細胞G2/M 和S 期阻滯。綜上所述，本研究成功構建了靶向沉默ATRX的A549 細胞，HU 和輻射可以導致細胞周期進程紊亂，且HU 一定程度上促進G2/M 期細胞周期阻滯。RNA 表達測序分析，ATRX 沉默后，細胞周期相關因子表達異常，提示ATRX 的缺失造成了細胞周期紊亂，相關蛋白表達量變化也可驗證。HU 和輻射均可誘導細胞凋亡，二者聯合作用還可進一步促進shATRX-A549 細胞凋亡。