β-谷甾醇對阿爾茨海默病模型小鼠認知功能的改善作用及其機制

王星燁, 孔祥日, 金夢麗, 王冰梅, 黎明全

（1.長春中醫藥大學中西醫結合學院中西醫結合實驗室，吉林 長春 130117；2.長春中醫藥大學第三附屬醫院腦病科，吉林 長春 130118；3.長春中醫藥大學中醫學院內分泌科，吉林 長春 130117；4.長春中醫藥大學臨床醫學院生理教研室，吉林 長春 130117）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種年齡相關性神經退行性疾病，隨著人口年齡結構的改變，AD 患病率逐年升高，給患者家庭和社會帶來巨大壓力。研究［1-2］顯示：AD 發病機制源于突觸功能障礙，進而相繼形成β 淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）斑塊和神經元纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFT）及磷酸化tau 蛋白過度聚集。神經炎癥在AD 發生發展中發揮了重要作用，以促炎細胞因子釋放、免疫細胞浸潤和膠質細胞激活為特征。研究［3-4］顯示：神經炎癥在神經退行性疾病的發病過程中起重要作用。當發生神經炎癥時，免疫細胞被激活從而釋放大量有毒細胞因子至外周神經元中，并進一步激活免疫細胞，形成惡性循環，促進疾病進展［5-7］。因此，抑制神經炎癥可能是緩解神經退行性疾病的有效措施。

白細胞介素17 （interleukin-17，IL-17）是一種主要的促炎細胞因子，介導對病原體或組織損傷的反應，并驅動自身免疫性疾病［8］。研究［9］顯示：IL-17 可能在各種神經退行性疾病中起重要作用。白細胞介素17A （interleukin-17A，IL-17A）為IL-17 家族成員的配體。轉錄因子p53 作用于細胞周期控制、DNA 損傷反應和細胞凋亡過程，維持基因組完整性。p53 蛋白能保持基因組的穩定性，避免或減少基因突變的發生，是防止神經元退化的各種補償或防御機制的基礎［10］。β-谷甾醇是一種植物甾醇，廣泛分布于多種油料性植物及中藥植物的根、莖、葉、種子和果實中［11］。目前已有研究［11-12］證實：β-谷甾醇在人體內發揮多種有益作用，包括抗菌、抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化斑塊和抗衰老等作用。研究［13-14］表明：β-谷甾醇與HT22 海馬細胞膜結合，通過影響雌激素受體使磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）在膜脂募集，從而激活PI3K 信號通路，延緩因腦膜脂質過氧化而加快的AD 進展。β-谷甾醇還可通過與線粒體膜結合，提高增強線粒體內膜流動性腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）含量，延緩神經退行性疾病的進展［15］。

本研究對C57BL/6J 小鼠側腦室注射β 淀粉樣蛋白1-42（amyloid β-protein1-42，Aβ1-42）建立AD 模型，探討β-谷甾醇通過抑制神經炎癥對AD 模型小鼠認知功能的改善作用，并闡明其可能的分子機制，為延緩AD 進展，優化神經退行性疾病治療方案提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器72 只6～8 周齡的雄性C57BL/6J 小鼠（SPF 級）購自遼寧長生生物技術股份有限公司，動物生產許可證號：SCXK（吉）2011-0004。所有小鼠在光照/黑暗：12 h/12 h 環境中飼養，可自由飲食。β-谷甾醇（上海源葉生物科技有限公司），鹽酸多奈哌齊片（中國衛才藥業有限公司），Aβ1-42（上海Sigma Aldrich 貿易有限公司），小鼠 IL-17A 酶聯免疫吸附測定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒和還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平測定試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司），RNA 提取試劑盒和逆轉錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），重組Anti-p53 抗體、重組Anti-B 細胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體、重組Anti-β-actin抗體、重組Anti-Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體、Anti-cleaved Caspase-3 抗體、Anti-Caspase-3 抗體和重組Anti-IL-17A 抗體（上海艾博抗貿易有限公司）。小鼠自由活動箱、新物體識別實驗裝置和Morris 水迷宮（北京諾達思信息技術有限責任公司），核酸定量儀NanoDrop 2000c、酶標儀Multiskan GO 和實時熒光定量PCR （realtime fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀（美國Thermo Fisher 公司），垂直電泳儀（美國Bio-Rad 公司），化學發光成像儀（Fusion FX7，法國Vilber 公司）。

1.2 實驗動物造模和給藥72 只C57BL/6J 小鼠隨機分為對照組、假手術組、AD 組、鹽酸多奈哌齊組（0.6 mg·kg－1鹽酸多奈哌齊）、低劑量β-谷甾醇組（1.0 mg·kg－1β-谷甾醇）和高劑量β-谷甾醇組（4.0 mg·kg－1β-谷甾醇），每組12 只。除對照組和假手術組，其他各組小鼠按照參考文獻［16］的方法制備小鼠AD 模型，Aβ1-42在37 ℃無菌生理鹽水中孵育7 d，使蛋白肽結構發生變化，從而產生毒性。采用1.25% 阿佛丁溶液 （0.02 mL·g－1）對小鼠進行深度麻醉，采用微針向小鼠側腦室注射5 μL Aβ1-42（1 g·L－1）建立AD 小鼠模型。假手術組小鼠側腦室注射5 μL 生理鹽水，對照組小鼠不予處理。鹽酸多奈哌齊組、低劑量β-谷甾醇組和高劑量β-谷甾醇組小鼠自造模后灌胃β-谷甾醇或鹽酸多奈哌齊，連續給藥14 d，每日1 次。Aβ1-42注射造模7 d 后開始行為學觀察實驗。待行為學實驗全部結束后，處死各組小鼠，取海馬組織用于后續實驗。

1.3 自主活動實驗觀察各組小鼠自由活動次數小鼠自由活動箱尺寸為（長×寬×高=0.30m×0.30 m×0.45 m），箱體底部和側壁不透光，頂端設有紅外攝像機。將小鼠放入箱中試驗開始，小鼠自由活動10 min 后開始記錄，采集30 min 內各組小鼠自由活動次數。以自由活動次數代表小鼠自主活動能力。

1.4 筑巢行為實驗觀察各組小鼠社會行為和日常活動能力筑巢行為實驗區別于空間學習和記憶相關的行為實驗，注重考察小鼠認知功能，其更關注小鼠日常活動和執行功能［17］。將群養的小鼠分成單籠飼養，適應48 h，每籠中換入厚度為1 cm 的玉米芯墊料，12 h 后放入方形無味薄紙片16 張（邊長4 cm），18 h 后按照4 分法對筑巢質量進行評分：1 分，紙片無規則地分散在籠子中，未被撕咬；2 分，紙片較松散地聚集于籠子一側，但無成型的巢，無明顯的撕咬痕跡；3 分，紙片聚攏折疊成型，但只有較平的巢，無明顯的撕咬痕跡；4 分，紙片聚攏折疊成較深的巢，并被撕咬成小塊。

1.5 新物體辨別實驗觀察各組小鼠非空間記憶能力新物體識別實驗是一種較為精細的行為學檢測方法，通過記錄小鼠對不同物體探索時間的區別，檢測小鼠的非空間記憶能力［18］。按照參考文獻［19］的方法操作，實驗在隔音和避光的裝置中進行，固定尺寸（長×寬×高=0.25 m×0.25 m×0.40 m），準備3 個足夠重物體，其中2 個物體為顏色形狀完全一致的立方體，另一個物體為與前2 個物體完全不同的圓錐體。在測試裝置上方以60 W白光燈照射以消除陰影。適應階段（第1 天）：僅將小鼠置入測試盒的中央，適應活動5 min；訓練階段（第2 天）：在測試盒內置入2 個顏色形狀完全相同的物體，位置固定，將小鼠背對物體置入裝置中，探索10 min；檢測階段（第3 天）：取出相同物體中的1 個物體，并于相同位置置入顏色外觀不同的物體，將小鼠背對物體置入裝置中，探索10 min。記錄不同階段小鼠探索時長，并計算新舊物體辨別時間的比值，即辨別比（discrimination ratio，DR），以對新物體辨別時間和DR 代表小鼠非空間記憶能力。DR=探索新物體時間/探索物體總時間。

1.6 Morris 水迷宮實驗觀察各組小鼠空間記憶和空間辨別能力實驗前在水池壁上做不同標記參照物，位置保持不變。定位巡航：水池十字均分為4 個象限，平臺始終置于第1 象限的中央不變。將小鼠頭朝池壁放入任一象限的水中，逃避潛伏期定義為小鼠找到平臺所用時間。引導小鼠學習上臺并停留10 s。每次學習上限90 s，若小鼠未成功登陸平臺，記為90 s，每只小鼠每天間歇性訓練3 次，連續訓練5 d。空間探索：第7 天，移除平臺，開始空間探索。將小鼠由第3 象限置入水中，記錄逃避潛伏期和90 s 內小鼠穿越原平臺的次數用于評價小鼠的空間記憶和空間辨別能力。

1.7 RT-qPCR 法檢測各組小鼠海馬組織中IL-17A 和p53 mRNA 表達水平采用TRIzol 法提取小鼠海馬組織中總RNA，按照逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄為cDNA，進行RT-qPCR 檢測。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。采用2－ΔΔCt法計算各組小鼠海馬組織中IL-17A 和p53 mRNA 表達水平。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.8 Western blottig 法檢測各組小鼠海馬組織中IL-17A、p53、Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bcl-2 和Bax 蛋白表達水平采用勻質儀破碎各組小鼠海馬組織總蛋白，溶解于含1%蛋白酶抑制劑PSMF 和2%磷酸酶抑制劑的RIPA 溶液中。采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度，加入5×Loading Buffer 煮樣后離心。采用4%～20% 預制SDS-PAGE 分離蛋白，并轉至PVDF 膜上。采用5% 脫脂奶粉封閉2 h，采用一抗（1∶1 000 稀釋）孵育過夜，TBST 緩沖液洗滌后，HRP 標記的山羊抗兔或抗鼠二抗（1∶5 000 稀釋）孵育2 h。采用ECL 化學發光試劑盒在化學發光成像儀上成像目的蛋白條帶。以β-actin 為內參，采用SHST 圖像分析軟件（杭州申花科技有限公司）檢測蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平＝目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1.9 ELISA 法檢測各組小鼠海馬組織中SOD 活性和GSH、TNF-α 及IL-17A 水平按照ELISA 檢測試劑盒說明書操作，檢測各組小鼠海馬組織中SOD 活性和GSH、TNF-α 及IL-17A 水平。采用酶標儀檢測波長450 nm 和412 nm 處吸光度（A）值，繪制標準曲線。根據標準曲線和A 值計算海馬組織中SOD 活性和GSH、TNF- α 及IL-17A 水平。

1.10 統計學分析采用SPSS 22.0 統計軟件進行統計學分析。各組小鼠自主活動次數，筑巢行為評分，對新物體辨別時間，DR，逃避潛伏期，跨越平臺次數，海馬組織中IL-17A 和p53 mRNA 及蛋白表達水平，海馬組織中Caspase 3、cleaved Caspase-3、Bax 和Bcl-2 蛋白表達水平，SOD 活性和GSH、TNF-α 及IL-17A 水平均符合正態分布，以±s 表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用Dunnett’st檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠自主活動能力和筑巢行為評分各組小鼠自主活動次數比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。與對照組比較，AD 組小鼠筑巢行為評分明顯降低（P＜0.01）。與AD 組比較，鹽酸多奈哌齊組和低劑量β-谷甾醇組小鼠筑巢行為評分升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠自主活動次數和筑巢行為評分Tab.2 Number of autonomic activity and scores of nesting behavior of mice in various groups (n=12，±s）

表2 各組小鼠自主活動次數和筑巢行為評分Tab.2 Number of autonomic activity and scores of nesting behavior of mice in various groups (n=12，±s）

*P＜0.01 vs control group; △P＜0.05 vs AD group.

Group Score of nesting behavior Control Sham operation AD Donepezil hydrochloride Low dose of β-sitosterol High dose of β-sitosterol Number of autonomic activity 110.33±10.24 107.50±15.10 110.50±14.49 109.83±13.81 107.17±14.41 103.00±14.86 3.17±0.58 3.00±0.74 1.67±0.78*2.75±0.87△2.67±0.89△2.25±1.06

2.2 各組小鼠非空間記憶能力與對照組比較，AD 組小鼠對新物體辨別時間明顯減少（P＜0.01），且DR 明顯降低（P＜0.01）。與AD 組比較，鹽酸多奈哌齊組和高劑量β-谷甾醇組小鼠對新物體辨別時間明顯增加（P＜0.01），DR 差異無統計學意義（P＞0.05）；低劑量β-谷甾醇組小鼠對新物體辨別時間差異無統計學意義（P＞0.05），DR 升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠對新物體辨別時間和DRTab.3 Indentification time of new object and DR of mice in various groups(n=12，±s）

表3 各組小鼠對新物體辨別時間和DRTab.3 Indentification time of new object and DR of mice in various groups(n=12，±s）

*P＜0.01 vs control group; △P＜0.05, △△P＜0.01 vs AD group.

Group DR Control Sham operation AD Donepezil hydrochloride Low dose of β-sitosterol High dose of β-sitosterol Idenfification time of new object (t/s)57.56±11.78 54.30±10.96 34.47±7.94*50.88±11.30△△39.37±10.68 44.53±4.01△△0.65±0.14 0.64±0.15 0.36±0.11*0.48±0.15 0.51±0.14△0.45±0.10

2.3 各組小鼠空間記憶和空間辨別能力隨著小鼠訓練時長增加，各組小鼠逃避潛伏期逐漸縮短，其中對照組小鼠逃避潛伏期縮短幅度較大，鹽酸多奈哌齊組和低及高劑量β-谷甾醇組小鼠逃避潛伏期也呈縮短趨勢。與對照組比較，AD 組小鼠在定位巡航訓練第3 和5 天逃避潛伏期明顯延長（P＜0.01）。與AD 組比較，鹽酸多奈哌齊組和低及高劑量β-谷甾醇組小鼠訓練第1 天逃避潛伏期差異無統計學意義（P＞0.05），鹽酸多奈哌齊組和低及高劑量β-谷甾醇組小鼠訓練第3和5天逃避潛伏期明顯延長（P＜0.05或P＜0.01）。與對照組比較，AD組小鼠跨越平臺次數明顯增加（P＜0.01）。與AD 組比較，鹽酸多奈哌齊組和低及高劑量β-谷甾醇組小鼠跨越平臺次數明顯減少（P＜0.01）。見表4。

表4 各組小鼠逃避潛伏期和跨越平臺次數Tab.4 Escape latencies and number of crossing platform of mice in various groups(±s）

表4 各組小鼠逃避潛伏期和跨越平臺次數Tab.4 Escape latencies and number of crossing platform of mice in various groups(±s）

*P＜0.01 vs control group; △P＜0.05, △△P＜0.01 vs AD group.

Group n Escape latency(t/s)3 5 Number of crossing platform Control Sham operation AD Donepezil hydrochloride Low dose of β-sitosterol High dose of β-sitosterol 12 12 11 12 12 12(t/d) 1 80.73±5.10 81.36±4.51 81.33±4.93 80.23±3.75 77.10±5.95 80.19±4.96 47.47±12.57 54.06±13.00 75.14±8.35*62.12±11.56△61.91±9.87△56.57±10.40△△35.81±11.81 41.14±7.79 67.80±5.60*47.81±7.65△△52.79±12.06△△55.62±7.39△△2.70±0.65 2.80±0.97 5.90±1.60*3.10±1.30△△3.40±1.80△△4.00±1.21△△

2.4 各組小鼠海馬組織中IL-17A 和p53 mRNA 表達水平與對照組比較，AD 組小鼠海馬組織中IL-17A 和p53 mRNA 表達水平均明顯升高（P＜0.01）。與AD 組比較，低和高劑量β-谷甾醇組小鼠海馬組織中IL-17A mRNA 表達水平降低（P＜0.05）；鹽酸多奈哌齊組和高劑量β-谷甾醇組小鼠海馬組織中p53 mRNA 表達水平降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠海馬組織中IL-17A(A)和p53(B) mRNA 表達水平Fig.1 Expression levels of IL-17A(A) and p53 (B) mRNA in hippocampus tissue of mice in various groups

2.5 各組小鼠海馬組織中IL-17A、p53、Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bax 和Bcl-2 蛋白表達水平與對照組比較，AD 組小鼠海馬組織中IL-17A、p53 和cleaved Caspase-3 蛋白表達水平及Bax/Bcl-2 比值明顯升高（P＜0.01）。與AD 組比較，低劑量β-谷甾醇組小鼠海馬組織中IL-17A 和p53 蛋白表達水平及Bax/Bcl-2 比值明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），鹽酸多奈哌齊組小鼠海馬組織中cleaved Caspase-3 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），高劑量β-谷甾醇組小鼠海馬組織中IL-17A、cleaved Caspase-3 蛋白表達水平和Bax/Bcl-2 比值明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組小鼠海馬組織中凋亡相關蛋白表達電泳圖（A-C)和直條圖（D-H）Fig.2 Electrophoregrams(A-C) and histograms(D-F) of expressions of apoptosis-related proteins in hippocampus tissue of mice in various groups

2.6 各組小鼠海馬組織中SOD 活性和GSH 水平與對照組比較，AD 組小鼠海馬組織中SOD 活性和GSH 水平明顯降低（P＜0.01）。與AD 組比較，高劑量β-谷甾醇組小鼠海馬組織中SOD 活性和GSH 水平明顯升高（P＜0.01），鹽酸多奈哌齊組和低劑量β-谷甾醇組小鼠海馬組織中SOD 活性和GSH 水平均有升高趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表5。

表5 各組小鼠海馬組織中SOD 活性和GSH 水平Tab.5 SOD activities and GSH levels in hippocampus tissue of mice in various groups(n=3,±s）

表5 各組小鼠海馬組織中SOD 活性和GSH 水平Tab.5 SOD activities and GSH levels in hippocampus tissue of mice in various groups(n=3,±s）

*P＜0.01 vs control group; △P＜0.01 vs AD group.

Group Control Sham operation AD Donepezil hydrochloride Low dose of β-sitosterol High dose of β-sitosterol SOD[λB/(U·mL－1)]56.97±5.51 54.77±6.30 37.41±9.94*44.18±14.76 40.15±7.89 53.56±8.13△GSH[cB/(μmol·L－1)]123.47±27.99 123.71±22.85 70.59±9.64*88.30±10.95 93.70±16.22 109.59±13.59△

2.7 各組小鼠海馬組織中TNF-α 和IL-17A 水平

與對照組比較，AD 組小鼠海馬組織中TNF-α和IL-17A 水平明顯升高（P＜0.01）。與AD 組比較，低劑量β-谷甾醇組小鼠海馬組織中TNF-α 水平降低（P＜0.05），高劑量β-谷甾醇組小鼠海馬組織中IL-17A 水平降低（P＜0.05）。見表6。

表6 各組小鼠海馬組織中TNF-α 和IL-17A 水平Tab.6 Levels of TNF-α and IL-17A in hippocampus tissue of mice in various groups[n=3,±s，ρB/(ng·L－1)]

表6 各組小鼠海馬組織中TNF-α 和IL-17A 水平Tab.6 Levels of TNF-α and IL-17A in hippocampus tissue of mice in various groups[n=3,±s，ρB/(ng·L－1)]

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.05 vs AD group.

Group Control Sham operation AD Donepezil hydrochloride Low dose of β-sitosterol High dose of β-sitosterol IL-17A 192.98±57.22 218.30±62.85 489.49±45.26*454.13±92.60 415.89±64.78 381.97±94.82△TNF-α 467.63±36.50 495.21±54.06 571.12±52.05*547.58±32.65 507.49±41.57△525.28±39.31

3 討 論

本研究采用小鼠側腦室注射Aβ1-42建立小鼠AD模型，通過檢測小鼠海馬組織中IL-17A 蛋白表達水平，發現其在海馬組織中高表達，證實AD 小鼠海馬周圍組織神經炎癥。使用β-谷甾醇治療后，小鼠海馬組織中IL-17A 蛋白表達水平降低。CHEN 等［20］研究顯示：IL-17 水平升高與AD 疾病的進展有關。CRISTIANO 等［21］研究表明：采用IL-17 中和抗體治療減輕了AD 小鼠的神經炎癥和記憶障礙，并提出了通過中和IL-17 可能成為未來治療AD 潛在途徑。因此，靶向IL-17 可能是治療AD 的潛在途徑，本研究為靶向IL-17 治療AD 提供了理論基礎。

本研究中AD 小鼠海馬組織中p53 蛋白表達水平升高，Bax/Bcl-2 比值和cleaved Caspase-3 蛋白表達水平升高。β-谷甾醇治療后，Bax/Bcl-2 比值降低，提示β-谷甾醇對于p53 信號通路抑制細胞凋亡的發生可能是通過調控Bax 和Bcl-2 蛋白表達水平進行的。AD 是一種以蛋白質聚集物為特征的神經退行性疾病，p53 聚集后激活，以應對威脅基因組穩定性的各種壓力源［22-23］。研究［24-25］表明：只有在AD 的早期階段，p53 蛋白才能在DNA 修復中發揮其功能。AD 大鼠腦組織中p53 蛋白表達水平升高，并維持持續的tau 蛋白過度磷酸化，而細胞中Aβ 蓄積有助于促進下游p53 效應［22，26］。激活的p53 誘導細胞周期停滯等功能，而DNA 修復機制的失敗導致p53 介導的細胞凋亡［27］。

氧化應激在AD 進程中的作用十分重要。本研究結果顯示：AD 組小鼠海馬組織中SOD 活性和GSH 水平降低，提示中樞系統的過度氧化應激。而高劑量β-谷甾醇治療后，GSH 水平明顯升高。自由基可以促進Aβ 蓄積，造成tau 蛋白過度磷酸化，使神經元發生基因突變。當機體無法維持自由基與清除自由基的平衡時，積聚的過氧化物與組織和細胞中的脂質及蛋白質等過度反應，造成組織損傷和細胞凋亡［28］。

綜上所述，本研究采用小鼠側腦室注射Aβ1-42建立AD 模型，采用β-谷甾醇進行干預治療，以多種行為學觀察實驗評估β-谷甾醇對AD 小鼠認知功能的改善作用，并采用分子生物學的方法檢測到小鼠海馬組織中IL-17 和p53 表達水平的改變，提示β-谷甾醇可能通過IL-17-p53 信號通路作用機制來抑制神經炎癥、神經細胞凋亡和氧化應激，改善AD 小鼠的認知功能。