小陷胸湯加味方對2 型糖尿病大鼠肝損傷的保護作用及其機制

關 敬, 哈 森, 袁 顥, 陳 穎, 劉鵬舉, 劉 智, 姜 爽

（1.長春中醫藥大學臨床醫學院藥理學教研室，吉林 長春 130117；2.長春中醫藥大學健康管理學院預防醫學教研室，吉林 長春 130117）

糖尿病作為一種常見的內分泌系統疾病，發病率高且并發癥較多。國際糖尿病聯盟的最新數據［1］顯示：2019 年全球糖尿病患者超過4.6 億，預計在2045 年將會超過7 億，在糖尿病患病人群中又以2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）為主。T2DM 的病因和發病機制目前尚不明確，但對其病理生理學的研究已較為充分，其主要特征為胰島素調控葡萄糖代謝能力的下降，即胰島素抵抗，并伴胰島B 細胞功能缺陷所導致的胰島素分泌相對減少。肝臟作為糖脂代謝的主要器官，是胰島素抵抗發生的重要部位。研究［2］顯示：T2DM 患者中有超過50%以上伴有肝損傷的發生。因而，改善肝損傷對于治療T2DM 具有積極意義。

小陷胸湯原方由瓜萎、黃連和半夏組成，具有清熱化痰及寬胸散結的功效，主要用于由痰熱互結所引起的心下痞滿不適或小結胸證，具有治療消化系統疾病、心血管疾病、抗腫瘤和鎮靜安神等作用［3］。研究［4］顯示：小陷胸湯能夠明顯改善糖尿病患者的臨床癥狀，降低血糖水平，并且小陷胸湯治療可以提高患者對胰島素的敏感性。劉冬戀等［5］證實：小陷胸湯在改善T2DM 痰熱互結模型大鼠血糖水平、體質量、飲水量和尿量方面有良好效果。同時，尚筱雯等［6］認為：“態靶辨證”的臨床治療方法可以使小陷胸湯在糖尿病的治療方面得到更為廣泛的關注及應用。但目前針對小陷胸湯治療T2DM 并發癥的研究較少，對其治療糖尿病肝損傷的作用尚未完全闡明。本研究探討小陷胸湯加味方（Modified Xiao-Xian-Xiong Decoction，MXD）對T2DM 大鼠肝損傷的保護作用，闡明其作用機制，旨在為其防治糖尿病肝損傷的臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥物、主要試劑和儀器60 只雄性大鼠，均為Wistar 品系，體質量200～240 g，購自長春億斯實驗動物公司，動物生產許可證號：SCXK（吉）2020-0002。本研究通過長春中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準（2021559），大鼠飼養在長春中醫藥大學動物中心，動物使用許可證號：SYXK（吉）2018-0014；飼養條件為室溫22 ℃～24 ℃、相對濕度50%～60%、明暗12 h∶12 h。嚴格按照中國實驗動物管理法規處理動物，遵守3R原則，1 周的適應性喂養后開始實驗。高脂高糖飼料由10%粗蛋白、15%粗脂肪、55%碳水化合物和20%糖組成，購自長春億斯實驗動物公司［吉飼證（2019）01092］。MXD 處方：瓜蔞30 g、黃連15 g、半夏15 g 和大黃10 g，均由長春中醫藥大學附屬醫院中藥房提供并協助煎煮，最終濃縮至2 g·mL－1生藥量，4 ℃保存備用。鹽酸二甲雙胍購自上海施貴寶制藥有限公司，鏈尿佐菌素（streptozotocin，STZ）購自上海MACKLIN 公司，白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒均購自上海黃石科研有限公司，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、還原型谷胱甘肽 （reduced glutathione，GSH）和 丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）等試劑盒購自南京建成工程研究所，核因子E2 相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）、血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體和IgG 二抗均購自武漢三鷹生物技術有限公司，增強型化學發光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）購自上海碧云天生物技術有限公司。電子天平（LE403E 型，上海梅特勒-托利多公司），血糖儀（卓越型，瑞士羅氏公司），全自動生化分析儀（SMT-120V 型，成都斯瑪特公司），超微量分光光度計（N60 型，德國IMPLEN 公司），酶標儀（Spectra Max M2e 型，美國Molecular Devices 公司），電泳及轉印設備（DYCZ-24D 型，北京六一生物科技公司），化學發光成像系統（K3000mini型，北京科創銳新生物科技公司）。

1.2 實驗動物造模、分組和給藥大鼠T2DM 模型制備參照王志塔等［7］的方法。60 只Wistar 大鼠分為對照組（n=10）和實驗組（n=50），對照組大鼠給予標準飼料喂養，實驗組大鼠給予高糖高脂飲食。實驗開始4 周后，實驗組大鼠經由腹腔注射1%STZ 溶液（30 mg·kg－1·d－1），連續2 d，共2 次；對照組大鼠腹腔注射等體積檸檬酸鈉緩沖液。T2DM 大鼠模型造模成功標準：末次STZ 溶液腹腔注射72 h后通過血糖儀檢測空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）水平，當FBG≥16.7 mmol·L－1即為造模成功。共44 只大鼠造模成功（造模成功率為88.00%），剔除FBG 水平最高和最低的大鼠各2 只，將剩余40 只T2DM 模型大鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組（200 mg·kg－1·d－1）和低及高劑量MXD組（630和1 260 mg·kg－1·d－1），灌胃給藥，每組10 只；同時采用等體積蒸餾水灌胃對照組和模型組大鼠，療程共計4 周。實驗期間觀察各組大鼠一般情況，并記錄給藥前及給藥第1、2、3 和4 周后各組大鼠體質量及FBG 水平。

1.3 全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清中丙氨酸氨基轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性給藥結束后，大鼠禁食不禁水12 h，經由腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL·kg－1）實施麻醉，腹主動脈采血，4 500 r·min－1，離心10 min，取部分上清用于檢測，剩余血清存于－80 ℃冰箱備用。采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清中ALT 和AST 活性。

1.4 HE 染色觀察各組大鼠肝組織病理形態表現腹主動脈采血后，取大鼠部分肝組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，做好標記，行石蠟包埋和切片染色，在光學顯微鏡下觀察并記錄各組大鼠肝組織病理形態表現。剩余部分肝組織存放于－80 ℃冰箱中，保存待用。

1.5 ELISA 法檢測各組大鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平取留存的大鼠血清，采用ELISA 法檢測各組大鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平，操作方法按照試劑盒說明書進行。

1.6 分光光度計檢測各組大鼠肝組織中SOD 活性和GSH 及MDA 水平取出存放于－80 ℃冰箱中的肝組織，采用生理鹽水按照1∶9 的比例制成10%肝組織勻漿，按照試劑盒說明書中操作檢測各組大鼠肝組織中SOD 活性和GSH 及MDA 水平。

1.7 Western blotting 法檢測各組大鼠肝組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平于相同部位取各組大鼠肝組織0.1 g，根據試劑盒說明書操作提取肝組織中蛋白。二喹啉甲酸法檢測蛋白表達水平后加入上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min，制作上樣蛋白。上樣后，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕法轉至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST 溶液洗滌10 min，共3 次。滴加Nrf2（1∶2 000）、HO-1 （1∶2 000）和β-actin （1∶5 000）一抗，4 ℃孵育過夜；TBST 溶液洗滌5 min，共5 次，滴加IgG 二抗（1∶5 000）后室溫孵育2 h。TBST 溶液洗滌5 min，共5 次，滴加ECL 顯色。采用Image J 1.8 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1.8 統計學分析采用SPSS 20.0 統計軟件進行統計學分析。各組大鼠體質量，FBG 水平，血清中ALT 和AST 活性及IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平，肝組織中SOD 活性和GSH 及MDA 水平，肝組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平經正態性檢驗均符合正態分布，以±s 表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況和體質量對照組大鼠毛色干凈光滑，攝食和攝水量適中，均無驟增和驟減的情況，大小便顏色和大小便量均正常。模型組大鼠在注射STZ 溶液后每日攝食和攝水量出現驟增現象，排尿量增加，毛發變黃、粗糙，活動量減少，出現糖尿病的典型癥狀。與模型組比較，二甲雙胍組、低劑量MXD 組和高劑量MXD 組大鼠糖尿病癥狀均有不同程度的改善。造模前各組大鼠體質量比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。灌胃給藥治療1、2、3 和4 周后，與對照組比較，模型組大鼠體質量明顯減小（P＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組、低劑量MXD 組和高劑量MXD組大鼠體質量增加，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠體質量Tab.1 Body mass of rats in various groups(n=10，±s，m/g）

表1 各組大鼠體質量Tab.1 Body mass of rats in various groups(n=10，±s，m/g）

*P＜0.01 compared with control group.

Body mass Group 4 weeks after administration Control Model Metformin Low dose of MXD High dose of MXD Before administration 307.61±3.34 303.45±22.41 308.24±23.86 310.42±37.47 309.96±17.18 1 weeks after administration 316.32±11.95 265.19±30.98*288.33±21.93 281.80±40.95 278.04±14.79 2 weeks after administration 325.40±12.64 242.24±27.48*255.85±25.78 261.11±30.92 251.36±11.24 3 weeks after administration 340.59±11.02 234.23±24.75*255.83±25.38 255.01±41.42 249.07±13.67 361.10±12.79 219.89±23.82*242.63±27.65 230.78±24.81 232.56±17.48

2.2 各組大鼠FBG 水平與對照組比較，各時間點模型組大鼠FBG 水平均明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，給藥前二甲雙胍組及低和高劑量MXD 組大鼠FBG 水平差異均無統計學意義（P＞0.05）；給藥第2、3 和4 周，二甲雙胍組和高劑量MXD 組大鼠FBG 水平明顯降低（P＜0.01）；給藥第3 和4 周，低劑量MXD 組大鼠FBG 水平明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠FBG 水平Tab.2 FBG levels of rats in various groups[n=10，±s，cB/（mmol·L-1）］

表2 各組大鼠FBG 水平Tab.2 FBG levels of rats in various groups[n=10，±s，cB/（mmol·L-1）］

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with model group.

FBG level Group 1 weeks after administration 2 weeks after administration 3 weeks after administration 4 weeks after administration Control Model Metformin Low dose of MXD High dose of MXD Before administration 5.04±0.55 18.89±1.92*20.34±3.18 19.97±1.93 20.34±3.20 5.78±0.48 19.24±1.56*18.52±1.60 20.79±3.94 18.66±3.07 6.09±0.83 18.81±1.64*15.92±2.21△△18.13±3.06 16.04±2.81△△5.49±0.54 18.72±4.04*13.55±1.79△△14.88±4.87△12.05±2.84△△5.37±0.68 17.99±2.55*11.21±1.03△△11.79±3.57△△11.08±2.74△△

2.3 各組大鼠血清中ALT 和AST 活性與對照組比較，模型組大鼠血清中AST 和ALT 活性均明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，二甲雙胍組及低和高劑量MXD 組大鼠血清中ALT 和AST 活性明顯降低（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠血清中ALT 和AST 活性Tab.3 Activities of ALT and AST in serum of rats in various groups[n=10，±s，λB/(U·L－1)]

表3 各組大鼠血清中ALT 和AST 活性Tab.3 Activities of ALT and AST in serum of rats in various groups[n=10，±s，λB/(U·L－1)]

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.01 compared with model group.

AST activity 110.54±16.27 601.46±77.78*298.42±34.49△204.78±13.66△169.92±12.61△Group Control Model Metformin Low dose of MXD High dose of MXD ALT activity 83.87±19.21 435.73±59.65*166.09±31.83△93.71±17.68△86.26±13.05△

2.4 各組大鼠肝組織病理形態表現對照組大鼠肝細胞具有清晰的結構，細胞核形態正常，未見炎癥細胞浸潤。模型組大鼠肝組織結構排列松散不規則，形態發生改變，可見水腫和充血，且呈現嚴重的炎癥細胞浸潤及肝細胞腫脹、肝血竇變窄和淤血；同時，可見細胞核發生固縮、分裂甚至消失不見的現象。二甲雙胍組大鼠肝細胞排列較整齊，形態結構有所好轉，可見少量炎癥細胞浸潤。低和高劑量MXD 組大鼠肝細胞排列整齊，形態恢復良好，炎癥細胞浸潤現象基本消失。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理形態表現（HE,×400）Fig.1 Pathomorphology of liver tissue of rats in various groups (HE,×400)

2.5 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平與對照組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平均明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，二甲雙胍組、低劑量MXD 組和高劑量MXD組大鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平均明顯降低（P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平Tab.4 Levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α in serum of rats in various groups [n=10，±s，ρB/(ng·L－1)]

表4 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平Tab.4 Levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α in serum of rats in various groups [n=10，±s，ρB/(ng·L－1)]

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.01 compared with model group.

Group Control Model Metformin Low dose of MXD High dose of MXD TNF-α 72.90±12.03 286.78±33.39*188.02±16.60△151.86±18.59△60.59±9.56△IL-1β 23.58±6.75 46.79±6.02*28.49±4.26△30.82±4.71△27.04±3.08△IL-6 31.13±4.42 157.21±8.10*84.60±5.51△80.82±4.65△51.86±2.23△

2.6 各組大鼠肝組織中SOD 活性和GSH 及MDA水平與對照組比較，模型組大鼠肝組織中SOD活性和GSH 水平明顯降低（P＜0.01），MDA 水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，二甲雙胍組、低劑量MXD 組和高劑量MXD 組大鼠肝組織中SOD 活性和GSH 水平均明顯升高（P＜0.01），低和高劑量MXD 組大鼠肝組織中MDA 水平明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）。見表5。

表5 各組大鼠肝組織中SOD 活性和GSH 及MDA 水平Tab.5 SOD activities and levels of GSH and MDA in liver tissue of rats in various groups(n=10，±s）

表5 各組大鼠肝組織中SOD 活性和GSH 及MDA 水平Tab.5 SOD activities and levels of GSH and MDA in liver tissue of rats in various groups(n=10，±s）

*P＜0.01 compared with control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 compared with model group.

Group Control Model Metformin Low dose of MXD High dose of MXD MDA [mB/(nmol·g－1)]4.35±0.57 9.77±2.16*8.03±1.38 7.35±1.31△5.09±0.86△△SOD [λB/(U·mg－1)]180.52±11.69 96.85±13.76*156.36±13.48△△129.70±16.82△△145.58±15.67△△GSH [mB/(μmol·g－1)]290.22±45.94 38.21±5.80*55.79±7.05△△114.09±25.13△△122.98±13.48△△

2.7 各組大鼠肝組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平與對照組比較，模型組大鼠肝組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，二甲雙胍組、低劑量MXD 組和高劑量MXD 組大鼠肝組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖2。

圖2 各組大鼠肝組織中Nrf2 和HO-1 蛋白表達電泳圖（A)和直條圖（B,C）Fig.2 Electrophoregram（A) and histograms(B,C) of expressions of Nrf2 and HO-1 proteins in liver tissue of rats in various groups

3 討 論

T2DM 患者早期和中期發病的主要原因多為“熱與郁”，患者大多喜食肥甘厚味，久積內熱，胃腸稽熱不下，日久則消；中焦脾胃二者納運失司，長此以往則腸燥津傷，肝郁之熱亦可加重胃腸積熱，反之亦然［8-9］。清·唐宗海《血證論》曰：“食氣入胃……則水谷乃化”，提示若情志失調，肝郁化火，肝郁克脾犯胃，進而導致脾胃升降及膽汁分泌和排泄失常，加重食郁化熱，故而T2DM 多伴有肝損傷的發生。施嵐爾等［10］發現：小陷胸湯治療T2DM 的機制可能與阻斷胰高血糖素信號通路、升高細胞中鈣離子濃度、降低氧化應激和抗炎作用等有關。本研究采用小陷胸湯為基礎方，從腸熱肝郁論治。

小陷胸湯出自《傷寒論》，其中瓜蔞有清心潤肺和化痰解熱之功效，能清熱潤燥，又能疏肝緩急；黃連可苦寒泄熱除痞，有保肝利膽之功效，從而改善肝臟功能；半夏有辛燥化痰散結之功效，除辛溫化痰外，還可以降逆肝之氣機，現代醫學研究［11-12］顯示：其具有改善肝臟酪氨酸轉氨酶活性的作用。大黃具有保護肝臟功能的作用，不但可以促使肝細胞再生，還可以促進體內毒素的排出，是一味公認具有良好保肝和護肝效果的中藥［13］。在小陷胸湯原方基礎上，加入大黃以解決T2DM 患者肝損傷問題，最終達到保護肝臟功能的目的。

T2DM 的治療藥物品類繁多，但以二甲雙胍的臨床應用最為廣泛，在本研究中被選為陽性藥物是因其同時兼有良好的降低FBG 水平效果和肝損傷的保護作用［14-15］。本研究結果顯示：給予T2DM大鼠二甲雙胍和MXD 治療4 周后，大鼠一般狀態均有所改善，體質量減小情況也有不同程度的緩解；與模型組比較，二甲雙胍組、低劑量MXD 組和高劑量MXD 組大鼠FBG 水平均降低。ALT 和AST 活性是評價肝損傷程度的常用指標，研究［16］顯示：當發生肝損傷時，血清中ALT 和AST 活性明顯升高。本研究結果顯示：MXD 可改善大鼠T2DM 癥狀并降低FBG 水平，也可抑制大鼠血清中ALT 和AST 活性，進而發揮保護T2DM 大鼠肝損傷的作用。

T2DM 被認為是一種全身性慢性低度炎癥性疾病，炎性通路過度活化是其相關病癥發生的分子基礎，當肝臟中的炎性反應被激活后，IL-1β、IL-6和TNF-α 等炎癥因子水平升高，不僅參與肝臟炎癥損傷，還參與糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗等［17］。IL-1β 可直接作用于肝細胞，是炎癥狀態下的主要細胞因子，除可觸發其他細胞因子和促炎介質的產生外，還參與刺激T 和B 淋巴細胞的增殖及誘導黏附分子的釋放過程，從而對肝臟產生損傷作用［18-20］。IL-6 是與全身免疫反應和局部血管損傷有關的炎癥因子，一方面可以引起 T 和B 淋巴細胞異常增殖和過度活化，另一方面也可促進單核細胞對內皮細胞的黏附作用，最終加劇其他炎癥介質的損傷［21］。TNF-α 直接激活中性粒細胞，增強中性粒細胞的聚集和浸潤，從而促使炎癥反應發生［22］。本研究結果顯示：T2DM 大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α 水平升高，MXD 可以抑制炎癥反應，表明MXD 保護T2DM 大鼠肝損傷的作用可能與減少IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表達和釋放，抑制T2DM肝臟炎癥反應有關。

研究［23-24］證實：氧化應激的激活被認為是T2DM 肝損傷的中心環節和起始因素。SOD 和GSH 是體內抗氧化系統的重要組成部分，對維持抗氧化系統和氧化系統之間的平衡有重要意義；MDA 作為脂質過氧化的終產物，是反映體內氧化應激水平的重要指標［25］。本研究結果顯示：T2DM 大鼠肝組織中SOD 活性和GSH 水平降低，MDA 水平升高，提示T2DM 大鼠肝組織處于高氧化應激狀態，存在氧化損傷；經MXD 治療后，T2DM 大鼠肝組織中高氧化應激水平得到了改善，表明MXD 可以抑制T2DM 大鼠的氧化應激反應。Nrf2/HO-1 信號通路是機體抗氧化應激反應不可或缺的信號通路，其中Nrf2 作為重要的轉錄因子，可以調節氧化應激反應；HO-1 是血紅素分解代謝過程中的限速酶，為Nrf2 發揮抗氧化作用的重要媒介［26-28］。本研究結果顯示：MXD 有升高Nrf2 和HO-1 蛋白表達水平的作用，提示活化Nrf2/HO-1信號通路是MXD 發揮抗氧化應激作用的潛在機制。

綜上所述，MXD 對T2DM 大鼠肝損傷有保護作用，其機制可能與抗炎及活化Nrf2/HO-1 信號通路進而抑制氧化應激有關。