防風野生品對大鼠類風濕性關節炎的改善作用及其機制

林 喆, 王泰棟, 黃曉巍, 馬 超, 莊雪峰, 王雨辰, 林 賀, 郭駿騏, 律廣富

（1.長春中醫藥大學藥學院中藥藥理學實驗室，吉林 長春 130117；2.長春中醫藥大學 吉林省人參科學研究院中藥藥理組，吉林 長春130117）

類風濕性關節炎是一種以侵蝕性、對稱性、多關節性和滑膜慢性炎癥為主要特征的全身性自身免疫性疾病，全世界類風濕性關節炎患病率約為1.0%，我國類風濕關節炎患病率約為0.3%［1］。中醫學認為類風濕性關節炎屬于“痹證”范疇，此病的發生與感受風、寒、濕、熱等外邪有關，中醫多采用活血養陰、扶正祛邪及祛風除濕等中藥治療方法［2］。防風為傘形科植物防風的干燥根部，味辛、微甘，性溫，歸肝、膀胱和脾經，具有祛風解表、勝濕止痛及止痙的作用［3］。中醫應用防風的歷史悠久，《神農本草經》［4］將其列為上品，用于感冒頭痛、風濕痹痛、風疹瘙癢和破傷風等癥的治療。中醫古籍研究［5］顯示：在歷代醫家治療類風濕性關節炎的方劑中，防風常作為基礎組方之一出現。目前栽培品中藥材已成為臨床應用主流，但由于各地區環境氣候的差異，栽培品中藥材的質量良莠不齊，甚至有些中藥材出現同種不同效的現象，極大降低了中藥材的臨床應用效果。本研究采用防風野生品作為實驗對象，避免由于栽培品的差異導致臨床應用效果不均，最大程度反映中藥材防風的傳統功效和藥理作用，為防風的臨床應用和精準培育提供參考［6］。核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）是一種與炎癥因子生成、細胞增殖和細胞凋亡密切相關的轉錄因子［7］。研究［8］顯示：NFκB 過度活化所引起的前炎性細胞因子合成和釋放是類風濕性關節炎發生發展的重要因素。盡管防風在多種治療類風濕性關節炎的方劑中均有應用，但目前關于防風單味藥治療類風濕性關節炎的研究較少，且其作用機制尚不明確。本研究探討防風治療類風濕性關節炎的作用及其對NF-κB 信號通路的影響，為防風在臨床治療類風濕性關節炎的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥物、主要試劑和儀器健康6～8 周齡SPF 級雄性SD 大鼠50 只，體質量（200±20）g，由長春億斯實驗動物技術有限公司提供，動物生產許可證號：SCXK-（吉）-2020-0002。大鼠飼養于長春中醫藥大學實驗動物室，飼養期間大鼠自由飲水和進食，實驗過程經長春中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查，符合實驗動物福利與倫理規范，倫理編號：2021247。牛Ⅱ型膠原和弗氏完全佐劑（德國Sigma 公司，批號：C7806 和BJ-012-0392），防風野生品（由白山職業技術學院提供，經過長春中醫藥大學中藥資源教研室鑒定，批號：20200901），地塞米松（廣東華南藥業集團有限公司），戊巴比妥鈉（廣州化學試劑廠），白細胞介素1β （interleukin-1β，IL-1β）、白 細 胞 介 素 6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）（江蘇酶免實業有限公司，貨號：MM-0047R1、MM-0190R1 和MM-0180R1），NF-κB p65、NF-κB 抑制因子α （NF-κB inhibitor protein-α，IκB-α）、IκB-α 激酶β（IκB-α kinase-β，IKK-β）及環氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）一抗和二抗（武漢三鷹生物技術有限公司，貨號：10745-1-AP、10268-1-AP、15649-1-AP、26593-1-AP 和SA00001-2），TNF-α 抗體（沈陽萬類生物科技有限公司，貨號：WL01581），RIPA 裂解液和BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：P0013B 和P0010），蛋白酶抑制劑混合液（上海雅酶生物醫藥科技有限公司，貨號：GRF101），苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）（武漢塞維爾生物科技有限公司，貨號：G2008）。冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號：TGL-16），Invitrogen iBright成像系統（美國Thermo公司，型號：CL750），PowerPacTM基礎電泳儀（美國Bio-Rad 公司，型號：1645050）。

1.2 防風水煎液制備防風野生品陰干，切制后得飲片500 g，后于陶瓷煎藥鍋中用水浸泡30 min，浸泡過后煎煮30 min，最后濃縮至1 g·mL－1。

1.3 實驗動物分組、造模和給藥50 只大鼠隨機分為對照組、模型組、地塞米松組、低劑量防風組和高劑量防風組，每組10 只。除對照組外，其余各組大鼠制備類風濕性關節炎模型。稱取5 mgⅡ型膠原，采用0.1 mol·L－1冰醋酸于冰水浴中，定容于25 mL 容量瓶中，4 ℃靜置過夜，隨后將制好的溶液與25 mL 弗氏完全佐劑于冰水浴中混勻乳化制成0.1 g·L－1膠原乳劑，在大鼠尾根部和左后足跖處兩點皮內注射0.1 mL 膠原乳劑，共0.2 mL，10 d 后進行二次免疫，大鼠左足明顯紅腫和體積增大表明造模成功。對照組大鼠注射等量注射用水，其余操作與實驗組大鼠一致［9］。

造模結束后低劑量防風組大鼠以0.45 g·kg－1劑量灌胃給藥，高劑量防風組大鼠以0.90 g·kg－1劑量灌胃給藥，地塞米松組大鼠灌胃2 mg·kg－1地塞米松混懸液，對照組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，共計給藥14 d。

1.4 各組大鼠關節炎指數（arthritis index，AI）評分檢測治療前后采用關節炎評分標準評價各組大鼠的左后足AI。評分標準：足關節無明顯紅腫計0 分；趾關節出現紅腫計1 分；趾關節和足趾腫脹計2 分；踝關節以下足爪腫脹計3 分；全部足爪腫脹計4 分。

1.5 各組大鼠足腫脹程度檢測于造模結束后和末次給藥后，采用手術線環繞各組大鼠左下足跖部位，以手術線環繞1 周的長度作為大鼠足跖圍，直尺測量各組大鼠足跖圍變化，以各組大鼠的足跖圍判定足腫脹程度。

1.6 各組大鼠臟器指數計算處死各組大鼠，取脾臟和胸腺，采用生理鹽水沖洗后瀝干水分，記錄各組大鼠脾臟和胸腺質量，計算臟器指數。臟器指數＝器官質量/大鼠體質量，單位為mg·100 g－1。

1.7 酶 聯 免 疫 吸 附 測 定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平實驗結束后采用戊巴比妥鈉（40 mg·kg－1）腹腔注射麻醉后進行腹主動脈取血，3 500 r·min－1低溫離心10 min，分離血清，－20 ℃保存備用。按照ELISA 試劑盒說明書操作，檢測各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平。

1.8 HE 染色觀察各組大鼠滑膜組織病理形態表現實驗結束后分離大鼠踝關節，剔除周圍組織，取包埋后的踝關節進行石蠟切片，隨后將切片進行二甲苯脫蠟，HE 染色后光鏡下觀察各組大鼠踝關節滑膜組織病理形態表現。

1.9 Western blotting 法檢測各組大鼠滑膜組織中NF-κB、IκB-α、IKK-β、COX-2 和TNF-α 蛋白表達水平大鼠取血后，分離左足關節滑膜組織，置入EP 管中，液氮中保存。將40 mg 大鼠滑膜組織勻漿，并在RIPA 裂解緩沖液中裂解。12 000 r·min－1、4 ℃ 離心10 min，收集上清，采用BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，－80 ℃保存備用。制備SDS PAGE 凝膠，電泳后轉膜至PVDF 膜上，封閉，孵育一抗和二抗。采用ECL 化學發光法于成像系統中進行曝光顯影，采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平= 目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1.10 統計學分析采用SPSS 21.0 統計軟件進行統計學分析。各組大鼠AI 評分，足腫脹程度，臟器指數，血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平及滑膜組織中NF-κB、IκB-α、IKK-β、COX-2 和TNF-α蛋白表達水平均符合正態分布，以±s 表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠AI評分 與對照組比較，模型組大鼠AI 評分明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，地塞米松組、低劑量防風組和高劑量防風組大鼠AI 評分明顯降低（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠AI 評分Tab.1 AI scores of rats in various groups (n=10，ˉ±s）

表1 各組大鼠AI 評分Tab.1 AI scores of rats in various groups (n=10，ˉ±s）

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.01 vs model group.

Group Control Model Dexamethasone Low dose of Saposhnikoviae Radix High dose of Saposhnikoviae Radix AI score 0.00±0.00 2.40±0.49*1.00±0.00△1.00±0.00△1.40±0.49△

2.2 各組大鼠足腫脹程度與對照組比較，模型組大鼠足腫脹程度明顯加重（P＜0.01）。與模型組比較，地塞米松組、低劑量防風組和高劑量防風組大鼠足腫脹程度明顯減輕（P＜0.05 或P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠足腫脹程度Tab.2 Swelling degrees of feet of rats in various groups(n=10，ˉ±s，l/cm）

表2 各組大鼠足腫脹程度Tab.2 Swelling degrees of feet of rats in various groups(n=10，ˉ±s，l/cm）

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group.

Group Control Model Dexamethasone Low dose of Saposhnikoviae Radix High dose of Saposhnikoviae Foot circum ference Before treatment 2.49±0.09 3.03±0.19*3.04±0.24*3.01±0.17*After treatment 2.44±0.05 2.76±0.21*2.30±0.10△△2.54±0.05△Radix 3.04±0.21*2.56±0.09△

2.3 各組大鼠臟器指數與對照組比較，模型組大鼠胸腺指數明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，地塞米松組、低劑量防風組和高劑量防風組大鼠胸腺指數明顯降低（P＜0.01）。各組大鼠脾臟指數比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠臟器指數Tab.3 Organ indexes of rats in various groups （n=10，ˉ±s，mg·100 g－1)

表3 各組大鼠臟器指數Tab.3 Organ indexes of rats in various groups （n=10，ˉ±s，mg·100 g－1)

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.01 vs model group.

Group Control Model Dexamethasone Low dose of Saposhnikoviae Radix High dose of Saposhnikoviae Radix Thymus index 0.004 7±0.003 2 0.013 1±0.002 9*0.005 6±0.003 1△0.012 3±0.002 3△0.011 0±0.003 1△Spleen index 0.017 6±0.001 2 0.017 6±0.002 5 0.017 7±0.001 9 0.015 3±0.001 9 0.017 0±0.002 1

2.4 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平與對照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6 水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，地塞米松組、低劑量防風組和高劑量防風組大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平明顯降低（P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平Tab.4 Levels of TNF-α, IL-1β, and IL-6 in serum of rats in various groups [n=10，ˉ±s，ρB/(ng·L－1)］

表4 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平Tab.4 Levels of TNF-α, IL-1β, and IL-6 in serum of rats in various groups [n=10，ˉ±s，ρB/(ng·L－1)］

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.01 vs model group.

Group Control Model Dexamethasone Low dose of Saposhnikoviae Radix High dose of Saposhnikoviae Radix IL-6 23.85±1.68 70.93±8.31*38.10±2.76△59.34±6.53△46.88±5.08△TNF-α 30.46±2.48 85.67±9.25*45.58±5.63△65.72±7.52△60.45±6.83△IL-1β 48.36±3.67 105.62±15.71*60.92±5.78△77.23±8.03△69.55±7.36△

2.5 各組大鼠滑膜組織病理形態表現對照組大鼠滑膜組織未見異常；模型組大鼠踝關節滑膜組織增生并伴有大量炎癥細胞浸潤；地塞米松組、低劑量防風組和高劑量防風組大鼠踝關節滑膜組織增生程度減輕且炎癥細胞數減少。見圖1。

圖1 各組大鼠踝關節滑膜組織形態表現（HE，×200）Fig.1 Morphology of synovial tissue of ankle joint of rats in various groups（HE，×200）

2.6 各組大鼠滑膜組織中NF-κB、IκB-α、IKK-β、COX-2 和TNF-α 蛋白表達水平與對照組比較，模型組大鼠滑膜組織中NF-κB、IKK-β 、COX-2 和TNF-α 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01），IκB-α蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，地塞米松組、低劑量防風組和高劑量防風組大鼠滑膜組織中NF-κB、IKK-β、COX-2 和TNF-α 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），IκB-α 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）。見圖2 和3。

圖2 各組大鼠滑膜組織中NF-κB、IκB-α、IKK-β、COX-2 和TNF-α 蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of NF-κB,IκB-α,IKK-β,COX-2, and TNF-α proteins in synovial tissue of rats in various groups

圖3 各組大鼠滑膜組織NF-κB(A)、IκB-α(B)、IKK-β(C)、COX-2(D)和TNF-α(E)蛋白表達水平Fig.3 Expression levels of NF-κB(A), IκB-α(B), IKK-β(C), COX-2(D), and TNF-α(E) proteins in synovial tissue of rats in various groups

3 討 論

類風濕性關節炎病理學表現為滑膜組織增生、炎癥細胞浸潤、血管翳形成、關節軟骨損傷和骨侵蝕［10-12］。因此，減輕滑膜炎癥反應和抑制滑膜異常增生是治療類風濕性關節炎的有效方法［13］。類風濕性關節炎大鼠模型是一種可靠且與人類病理狀態相似的動物模型［14］。本研究結果顯示：與對照組比較，模型組大鼠踝關節均出現明顯腫脹，AI 評分明顯升高，滑膜組織增生并伴有大量炎癥細胞浸潤，表明類風濕性關節炎模型制備成功，而地塞米松組和不同劑量防風組能夠明顯減輕大鼠關節腫脹程度，降低AI 評分，抑制滑膜組織增生，降低炎癥細胞數量，表明防風能夠有效緩解大鼠類風濕性關節炎癥狀。脾臟和胸腺作為機體兩大免疫器官在免疫應答中發揮重要作用［15-16］。本研究結果顯示：模型組大鼠胸腺指數升高，經防風給藥后大鼠胸腺指數降低，表明防風能夠緩解由類風濕性關節炎引起的免疫器官腫大，因此認為防風野生品能夠通過抑制機體過度免疫應答對類風濕性關節炎起到治療作用。TNF-α、IL-1β 和IL-6 被認為是類風濕關節炎中重要的促炎細胞因子，參與關節組織炎癥形成和關節破壞［17-18］。研究［19-21］顯示：類風濕性關節炎患者血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β 高于正常水平，且類風濕性關節炎嚴重程度與TNF-α、IL-6和IL-1β 水平呈正相關關系。本研究結果顯示：防風野生品能夠降低類風濕性關節炎大鼠血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平，減輕體內炎癥反應，表明防風野生品對類風濕性關節炎具有治療作用，該作用與防風野生品抑制機體異常免疫應答及降低炎性因子水平有關。

NF-κB 在多種自身免疫性疾病中被活化，其中包括類風濕性關節炎［22-23］。NF-κB 被激活后能夠通過調控細胞因子、黏附分子和趨化因子等途徑參與機體炎癥反應，激活后的NF-κB 釋放入核還能夠繼續誘導下游COX2、TNF-α、IL-6 和IL-1β 等促炎細胞因子的產生，進一步加劇炎癥反應［24-28］。本研究結果顯示：與對照組比較，模型組大鼠滑膜組織中NF-κB 和IKK-β 蛋白表達水平升高，IκB-α 蛋白表達水平降低，表明在大鼠滑膜組織中NF-κB信號通路被激活，而不同劑量防風組大鼠滑膜組織中NF-κB 和IKK-β 蛋白表達水平較模型組明顯降低，IκB-α 蛋白表達水平較模型組明顯升高，表明大鼠滑膜組織NF-κB 信號通路的激活得到有效抑制。

綜上所述，防風野生品對類風濕性關節炎有較好的治療效果，其通過降低血清中促炎細胞因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平，抑制滑膜組織中NFκB 信號通路的過度激活，從而發揮治療作用。