基于轉錄組學探討氣陰兩虛型2 型糖尿病病證結合大鼠模型證候表現與差異表達基因的關系

黃曉巍, 張思琪,, 張譯心, 劉 博, 王 鑫, 紀鳳蘭, 楊潤澤,, 徐惠波, 丁 濤

（1.長春中醫藥大學藥學院中藥藥理學實驗室，吉林 長春 130117；2.吉林省中醫藥科學院藥效毒理評價中心，吉林 長春 130012；3.吉林大學中日聯誼醫院藥物臨床試驗機構，吉林 長春 130033）

病證結合動物模型是連接中醫藥臨床研究和基礎研究的紐帶，是基于疾病模型對動物宏觀體征進行動態觀察，并結合微觀指標判別建立的符合臨床證候特點的動物模型。目前在探索建立病證結合動物模型的評價標準時通常結合經典生化指標進行綜合評價，但部分證候模型的發生機制尚不明確。轉錄組學技術能夠從分子水平上篩選證候相關基因，并結合生物信息學方法探索基因相互調控規律，為證候發生和演變的物質基礎提供新思路，如常見的陰虛證必然存在與細胞生長、凋亡和糖脂代謝有關基因的變化［1-4］。消渴靈片主要由黃芪、黃連和麥冬等11 味中藥組成，具有滋補腎陰、生津止渴和益氣降糖的功效，可以改善2 型糖尿病患者氣陰兩虛證候表現。本課題組前期研究［5］依據《中藥新藥臨床研究指導原則》［6］中患者臨床表現，初步建立氣陰兩虛型2 型糖尿病病證結合動物模型［6］，以消渴靈片作為該模型的佐證藥，初步證實該病證結合動物模型基本符合氣陰兩虛型2 型糖尿病的臨床證候特點。本研究在此基礎上采用高通量測序技術，對氣陰兩虛型2 型糖尿病相關證候基因進行研究，從mRNA 表達水平篩選差異基因，結合宏觀表征和生化指標探討氣陰兩虛型2 型糖尿病證候特征與差異表達基因的關聯性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥物、主要試劑和儀器SPF 級雄性SD 大鼠49 只，體質量150～170 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，動物生產許可證號：SCXK（遼）-2015-0001。消渴靈片（云南白藥集團股份有限公司），鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）（美國Sigma 公司）。普通飼料（北京科澳協力飼料有限公司），高糖高脂飼料（KK 鼠料，北京華阜康生物科技股份有限公司），檸檬酸鈉和檸檬酸（北京化工廠），環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、環磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）、CD4 和CD8試劑盒（美國RD 公司），RNA 超快速文庫制備試劑盒、Poly（A）mRNA 磁性分離試劑盒、多重寡核苷酸（引物1）和多重寡核苷酸（引物2）（美國新英格蘭生物實驗室有限公司），RNA 6000 Pico 芯片、DNA 試劑盒和RNA 6000 Nano 芯片（美國安捷倫科技有限公司），QubitTMRNA 寬范圍（BR）、QubitTMDNA 寬范圍（BR）和QubitTMDNA 高靈敏度試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司），KAPA SYBR FAST qPCR 預混液、DNA 定量標準品和引物預混試劑盒（美國KAPA Biosystem 公司）。pH 計［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司，型號PB-10］，血糖儀（中國深圳家康科技有限公司，型號BGM506），大鼠抓力測定儀（山東省醫學科學院濟南益延科技發展有限公司，型號YLS-13A），多導生物記錄儀（澳大利亞ADInstruments 公司，型號PowerLab/8S），低速臺式離心機（北京時代北利離心機有限公司，型號DT5-3），數碼相機（日本富士公司，型號HS11），酶標儀（美國Bio Tek 公司，型號ELx800），全自動生化分析儀（長春迪瑞實業有限公司，型號CS-600B），歐姆龍紅外額式體溫計［歐姆龍健康醫療（中國）有限公司，型號MC-872］，96 孔熱循環器（上海伯樂生命醫學產品有限公司，型號B01-02），生物分析儀2100（美國安捷倫科技有限公司，型號J06-02），QUBIT 2.0 熒光計（美國賽默飛世爾科技公司，型號Q32871），高通量PCR 儀（上海伯樂生命醫學產品有限公司，型號B01-01）。

1.2 實驗動物分組、造模和給藥隨機選取18 只雄性SD 大鼠作為空白組（喂食普通飼料），其余大鼠高糖高脂喂養聯合腹腔注射35 mg·kg－1STZ 建立2 型糖尿病大鼠模型。于實驗第6 周根據血糖和體質量均衡原則將造模成功的31 只大鼠分為模型組（n=14）和藥物佐證組（n=17），模型組大鼠繼續高糖高脂飼料喂養，藥物佐證組大鼠灌胃消渴靈2.2 g·kg－1·d－1，實驗進行至第21 周。

1.3 大鼠一般狀態的采集方法和評分參照《中藥新藥臨床研究指導原則》［6］中氣陰兩虛型2 型糖尿患者臨床研究證候表現，分別采用體質量、進食量、飲水量、精神狀態評分、運動評分、足溫、抓力、脈搏幅度、呼吸頻率和舌象積分指標評價模型大鼠口渴喜飲、多食易饑、倦怠乏力、氣短懶言、五心煩熱和舌紅脈細的證候表現，運動和精神狀態評分具體方法見參考文獻［5］。

1.4 各組大鼠體質量、進食量、飲水量、足溫、抓力、脈搏幅度、呼吸頻率和舌象積分檢測每4 周稱量1 次大鼠體質量，每3 周記錄1 次大鼠24 h 進食量和飲水量。分別于第0 周和第21 周檢測各組大鼠抓力、呼吸頻率、脈搏幅度和足溫，于第21 周檢測各組大鼠舌體顏色，具體測定方法見參考文獻［5］。

1.5 各組大鼠空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）水平檢測于實驗第0 周和第21 周進行尾靜脈采血，采用血糖儀直接檢測各組大鼠FBG 水平。

1.6 各組大鼠血清中血脂指標水平檢測于第21 周大鼠腹主動脈采血，靜置30 min后，3 000 r·min－1離心15 min，取上層血清，采用氧化酶法檢測各組大鼠血清中甘油三酯（triglyceride，TG）和總膽固醇（total cholesterol ，TC）水平，直接法檢測各組大鼠血清中低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-c）和高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-c）水平。

1.7 酶 聯 免 疫 吸 附 測 定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測各組大鼠血清中CD4、CD8、cAMP 和cGMP 水平各組選取8 只大鼠，于第21 周大鼠腹主動脈采血，靜置30 min 后，3 000 r·min－1離心15 min，取上層血清，根據試劑盒操作方法檢測血清中CD4、CD8、cAMP 和cGMP 水平。檢測步驟如下：在預先包被CD4、CD8、cAMP 和cGMP 抗體的包被鎖孔中，依次加入標本、標準品和辣根過氧化物酶標記的檢測抗體，經過溫育并徹底洗滌。采用底物TMB 顯色，TMB 在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的CD4、CD8、cAMP 和cGMP 水平呈正相關關系。采用酶標儀于波長450 nm 處檢測吸光度（A）值。以A 值代表各組大鼠血清中CD4、CD8、cAMP 和cGMP 水平。

1.8 轉錄組學檢測大鼠差異表達基因組織樣品制備：取3 組大鼠肝組織樣品放入離心管中，用液氮速凍，－80 ℃冰箱凍存。采用Quibt RNA 試劑盒對肝組織中總RNA （Total RNA）定量，依據RIN≥7，28S 和18S 的RNA 比值≥1.5∶1，采用Agilent 2100 檢測RNA 完整性，選取質控合格的RNA 用于后續分析。建庫：經mRNA 純化和片段化、一鏈合成、二鏈合成、末端修復和加dA 尾、Adaptor 連接、PCR 擴增及PCR 產物質控后混合文庫。測序：采用illumina 測序平臺檢測獲取原始基因序列，再經過濾和統計后得到用于后續分析的基因序列，將得到的基因序列與參考基因序列比對、分類、組裝和定量。采用DESeq 軟件計算模型組與空白組和模型組與藥物佐證組組間差異表達情況，將差異倍數|log2FC|≥1 且顯著性水平P≤0.05的基因判定為差異表達基因，組間的差異基因分布情況以火山圖表示。

1.9 統計學分析采用SPSS 22.0 統計軟件進行統計學分析。各組大鼠精神狀態評分、運動評分、體質量、進食量、飲水量、足溫、抓力、脈搏幅度、呼吸頻率、舌象積分、FBG 和血清中TC、TG、LDL-c、HDL-c、CD4、CD8、cAMP 及cGMP 水平均符合正態分布，以±s 表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用兩獨立樣本LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般狀態指標在第21 周時，與空白組比較，模型組大鼠體質量明顯降低（P＜0.01），進食量、飲水量和足溫明顯升高（P＜0.01），精神狀態評分、運動評分和舌象積分明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01），抓力和脈搏幅度明顯減小（P＜0.01），呼吸頻率差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，藥物佐證組大鼠體質量、進食量和飲水量差異無統計學意義（P＞0.05），精神狀態評分、運動評分和舌象積分明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01），足溫明顯降低 （P＜0.01），抓力和脈搏幅度明顯增大（P＜0.01），呼吸頻率有升高趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1～4。

表1 各組大鼠體質量Tab.1 Body masses of rats in various groups( ±s，m/g）

表1 各組大鼠體質量Tab.1 Body masses of rats in various groups( ±s，m/g）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs blank group.

Group n Body mass 21 612.71±62.93 462.57±73.30**486.79±67.55(week) 1 254.09±9.32 255.14±14.65 246.83±9.56 5 9 Blank Model Drug evidence 18 14 17 463.67±40.55 424.60±39.23*435.32±28.63 519.73±48.51 436.36±53.88**440.85±46.28 13 555.86±65.17 447.32±63.67**467.01±56.26 17 599.91±62.44 460.39±72.43**471.45±61.51

表2 各組大鼠日進食量和飲水量Tab.2 Daily food intakes and water intakes of rats in various groups（±s）

表2 各組大鼠日進食量和飲水量Tab.2 Daily food intakes and water intakes of rats in various groups（±s）

*P＜0.01 vs blank group.

Group n Food intakes (g·d－1)9 Blank Model Drug evidence 18 14 17(week) 6 29.11±0.62 33.89±0.98*33.55±1.54 27.55±2.18 37.54±4.45*38.49±0.89 12 24.43±2.96 35.63±5.56*35.01±1.16 15 26.48±4.55 36.69±5.78*37.19±3.06 18 29.07±1.11 35.05±4.83*37.55±2.73 21 23.18±1.96 34.10±3.69*33.30±2.96 Group n Water intake (mL·d－1)21 42.19±10.92 155.60±12.61*154.41±25.52 18 14 17 9 Blank Model Drug evidence(week) 6 47.63±7.90 156.19±11.26*156.42±7.69 46.31±3.13 189.49±21.61*185.39±10.72 12 34.81±12.27 168.18±31.42*150.34±7.09 15 37.75±23.39 178.39±33.98*183.47±22.98 18 48.13±8.19 174.88±25.54*158.53±27.88

表3 各組大鼠精神狀態評分、運動評分、足溫、抓力、呼吸頻率和脈搏幅度Tab.3 Mental state scores, sport scores, foot temperatures, griping force, respiratory rates,and pulse amplitudes of rats in various groups（±s）

表3 各組大鼠精神狀態評分、運動評分、足溫、抓力、呼吸頻率和脈搏幅度Tab.3 Mental state scores, sport scores, foot temperatures, griping force, respiratory rates,and pulse amplitudes of rats in various groups（±s）

*P＜0.01 vs blank group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group.

Group n Mental state score(week) 21 0.11±0.32 1.86±0.36*1.41±0.51△Griping force(m·g－1)Sport score 21 0.11±0.32 1.93±0.27*1.35±0.49△△Foot temperature(θ/℃)0 32.47±3.27 30.76±1.36 31.10±1.51 0 Blank Model Drug evidence 18 14 17 21 29.92±1.36 31.88±1.94*29.53±1.51△△21 1 994.56±1.39 1 590.20±78.57*1 722.35±101.37△△Group n Blank Model Drug evidence Respiratory rate (times·min－1)(week) 0 96.04±12.90 94.49±17.82 102.19±18.84 21 0.018±0.006 0.008±0.003*0.017±0.011△△18 14 17 21 97.23±19.29 95.54±20.96 108.65±20.34 1 136.96±118.12 1 123.04±106.44 1 117.39±122.89 Pulse amplitude(U·V－1)0 0.013±0.005 0.014±0.005 0.021±0.017

表4 各組大鼠舌象積分Tab.4 Tongue image integral of rats in various groups（±s）

表4 各組大鼠舌象積分Tab.4 Tongue image integral of rats in various groups（±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs blank group；△P＜0.01 vs model group.

Group Blank Model Drug evidence Blue 27.00±2.41 38.15±5.97**21.71±6.15△n 18 14 17 Red 88.90±5.19 98.86±9.47*82.67±4.51△Green 22.38±6.76 30.53±6.93*13.87±6.02△

2.2 各組大鼠FBG水平和血清中TC、TG、LDL-c及HDL-c 水平與空白組比較，模型組大鼠FBG 水平和血清中TC、TG 及LDL-c 水平明顯升高（P＜0.01），HDL-c 水平差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，藥物佐證組大鼠FBG 水平和血清中TC、TG、LDL-c 及HDL-c 水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表5 和6。

表5 各組大鼠FBG 水平Tab.5 FBG levels of rats in various groups[±s,сB/(mmol·L－1)]

表5 各組大鼠FBG 水平Tab.5 FBG levels of rats in various groups[±s,сB/(mmol·L－1)]

*P＜0.01 vs blank group.

Group n Blank Model Drug evidence Fasting blood glucose(week) 0 4.12±0.48 4.16±0.44 4.10±0.42 21 5.46±0.44 20.09±5.36*17.61±3.77 18 14 17

表6 各組大鼠血清中TC、TG、LDL-c 和HDL-c 水平Tab.6 Levels of TC, TG, LDL-c, and HDL-c in serum of rats in various groups [±s,сB/(mmol·L－1)]

表6 各組大鼠血清中TC、TG、LDL-c 和HDL-c 水平Tab.6 Levels of TC, TG, LDL-c, and HDL-c in serum of rats in various groups [±s,сB/(mmol·L－1)]

*P＜0.01 vs blank group.

Group Blank Model Drug evidence HDL-c 0.99±0.16 1.05±0.28 0.96±0.25 n 18 14 17 TC 1.96±0.40 8.38±2.06*8.35±4.72 TG 1.53±0.44 13.28±5.56*12.69±4.97 LDL-c 0.73±0.11 6.44±1.91*5.60±3.50

2.3 各組大鼠血清中CD4、CD8、cAMP 和cGMP水平與空白組比較，模型組大鼠血清中CD4 水平和CD4/CD8 比值均明顯降低（P＜0.01），CD8水平差異無統計學意義（P＞0.05），cAMP 水平及cAMP/cGMP 比值均明顯升高（P＜0.01），cGMP水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，藥物佐證組大鼠血清中CD4 水平及CD4/CD8 比值均明顯升高（P＜0.01），CD8 和cAMP 水平差異無統計學意義（P＞0.05），cGMP 水平明顯升高（P＜0.01），cAMP/cGMP 比值明顯降低（P＜0.01）。見表7。

表7 各組大鼠血清中CD4、CD8、cAMP 和cGMP 水平及CD4/CD8 和cAMP/cGMP 比值Tab.7 Levels of CD4,CD8,cAMP,cGMP, and CD4/CD8 and cAMP/cGMP in serum of rats in various groups(n=8，±s）

表7 各組大鼠血清中CD4、CD8、cAMP 和cGMP 水平及CD4/CD8 和cAMP/cGMP 比值Tab.7 Levels of CD4,CD8,cAMP,cGMP, and CD4/CD8 and cAMP/cGMP in serum of rats in various groups(n=8，±s）

*P＜0.01 vs blank group；△P＜0.01 vs model group.

Group CD4/CD8 cAMP/cGMP Blank Model Drug evidence CD4[ρB/(μg·L－1)]85.88±11.78 66.25±10.15*84.34±10.25△CD8[ρB/(μg·L－1)]47.05±6.82 42.03±3.51 41.40±4.78 0.13±0.01 0.22±0.03*0.15±0.01△1.83±0.17 1.57±0.18*2.04±0.20△cAMP[сB/nmol·L－1)]12.18±1.85 14.67±0.83*13.96±1.33 cGMP[сB/nmol·L－1)]92.35±17.15 68.98±9.14*91.18±8.78△

2.4 各組大鼠差異表達基因與空白組比較，模型組大鼠差異表達基因共922 個，上調基因520 個（紅色），下調基因402 個（綠色）。見圖1A。與模型組比較，藥物佐證組大鼠差異表達基因共136 個，上調基因68 個（紅色），下調基因68 個（綠色）。見圖1B。

圖1 各組大鼠差異表達基因Fig.1 Differential expressed genes of rats in various groups

與空白組比較，模型組大鼠有520 個上調差異表達基因，其中涉及代謝的基因為早期生長應答因子2（early growth response factor 2，Egr2），參與細胞增殖和免疫調節的基因有Ppp2r2b、胰島素樣生長因子結合蛋白1 （insulin-like growth factor binding protein 1，Igfbp1）、血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶4 （a disintegrin and metallopeptidase with thrombospondin motfis 4，Adamts4）、Rgs16、Gadd45b、Rasgef1b、Egr2、Fosb、Slc25a22、Bcl6 和Wfdc6a，目前生物學過程不明確的基因有AABR07065768.3、AABR07027447.1、AABR07051548.2、AABR07061134.1、RF00100、AABR07065782.1、LOC100911994、Serhl2、AABR07065750.3、RF00560、AABR07051716.2、RF00405、RF00026、AABR07029863.2 和RF00398，藥物佐證組有27 個下調基因。見表8。與空白組比較，模型組大鼠有402 個下調表達基因，其中涉及代謝的基因有G0/G1開關2（G0/G1swich 2，G0s2）、中線1 相互作用蛋白 1 （midline 1 interaction protein 1，Mid1ip1）、Angptl8 和Fgf21，參與細胞增殖和免疫調節的基因有螺旋-環-螺旋家族成員e40 （basic helix-1oop-helix familye 40，Bhlhe40）、Irx5、Ier5、Mdk、Hyls1、Spata2L 和Rpp3，目前生物過程不明確的基因有RF00420、Mir3554、RF00425、RF00601、RF00019 和RF00026，藥物佐證組有17 個上調基因。見表9。

表8 模型組大鼠差異表達基因Tab.8 Differential expressed genes in model group

3 討 論

病證結合是傳統醫學診療疾病常采用的模式，也是證候本質研究的重要方法。病證結合動物模型是探索中醫理論的載體，對于探討疾病病理變化和中醫證候特征具有較大優勢。因此，建立符合臨床特點的病證結合動物模型和評價標準并結合現代技術探尋證候機制，能夠為豐富中醫證候的現代化研究提供更多的理論依據。

傳統醫學將糖尿病歸類于“消渴病”，糖尿病患者多見氣陰兩虛，基本病機為陰津虧損，燥熱偏盛，陰虛日久，傷津耗氣，而致氣陰兩虛［7-8］。消渴靈具有益氣養陰、生津止渴和益氣降糖的功效，可用于改善氣陰兩虛型2 型糖尿病患者的證候表現。本研究結果顯示：與空白組比較，模型組大鼠出現精神萎靡、倦怠乏力、消瘦、渴而多飲、煩熱、饑而欲食及舌質紅脈虛弱的表現；藥物佐證組大鼠灌胃21 周后，與模型組比較，其精神狀態有所好轉，倦怠乏力和舌質紅脈虛弱癥狀明顯改善，證實模型組從生理特征方面基本體現了氣陰兩虛型2 型糖尿患者的臨床特點。

機體證候變化時，除生理指標外，生化指標也會出現變化。CD4 和CD8 水平是反映氣虛證候的重要標志［9-10］。本研究結果顯示：與空白組比較，模型組大鼠血清中CD4 水平降低，在佐證藥消渴靈干預后模型組大鼠CD4 水平升高，表明模型組大鼠證候表現與免疫功能低下有關。環核苷酸cAMP 和cGMP 是相互拮抗的2 種物質，為生物體內的第二信使，共同調控機體能量代謝水平［11］。當機體出現陰虛表現時，cAMP 水平升高，cAMP/cGMP 比值升高，因此二者常作為反映陰虛的重要指標［12-14］。研究［15］表明：cAMP 通過蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）信號促進糖異生相關蛋白磷酸化，促進糖異生。本研究結果顯示：與空白組比較，模型組大鼠FBG 水平和血清中cAMP 水平及cAMP/cGMP 比值升高，cGMP 水平降低，TC、TG 和LDL-c 水平升高，表明模型組大鼠出現了糖脂代謝異常，結合上述消瘦及渴而多飲等生理表現，大鼠反映出糖尿病的狀態；藥物佐證組大鼠灌胃21 周后，與模型組比較，藥物佐證組大鼠血清中cGMP 水平升高，cAMP/cGMP 比值降低，內分泌功能的失衡得以改善。進一步證實模型組動物狀態基本體現了氣陰兩虛型2 型糖尿病的證候特點。

肝臟是機體物質代謝樞紐，是機體的主要代謝器官［16］。本研究結果顯示：與空白組比較，模型組大鼠主要上調表達基因有Igfbp1、Adamts4 和Egr2 等，主要下調表達基因有Bhlhe40、Mid1ip1和G0s2 等。其中Igfbp1 在自身性免疫疾病中高表達，還可通過腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）刺激Igfbp1 與胰島素樣生長因子1 （insulin-like growth factor-1，IGF-1）結合，導致B 淋巴細胞增殖分化受限，降低機體免疫力［17-18］。Adamts4 可增加腫瘤細胞的浸潤程度進而使腫瘤發生遷移，而腫瘤的發生發展多伴隨機體免疫功能異常，即免疫力下降［19-20］。研究［21］顯示：Igfbp1 除參與免疫調節外，對機體葡萄糖穩態的調節也起重要作用，Igfbp1 過表達能夠抑制IGF-1 的降糖作用使FBG 水平升高；Mid1ip1 是由碳水化合物反應元件結合蛋白調節葡萄糖反應的基因之一，并且通過負調控AMP 活化蛋白激酶（AMPactivated protein kinase，AMPK）減少脂質的沉積［22-23］；G0s2 對脂質降解具有抑制作用［24］；Egr2表達上調可促進脂質沉積［25-26］。本研究結果顯示：模型組大鼠血糖和血脂水平升高，可能與上述基因水平的變化有關聯，表明氣陰兩虛型2 型糖尿病大鼠模型的證候表現也體現在機體的代謝紊亂。本研究結果表明：佐證藥消渴靈對氣陰兩虛型2 型糖尿病大鼠模型的證候生理體征表現及免疫功能的改善明顯，對能量代謝指標cAMP 和cGMP 水平也有一定調控作用，但對血糖和血脂水平改變效果不明顯。提示中藥對疾病的治療多體現在整體宏觀的調節，增加機體對疾病的抵抗能力。

綜上所述，氣陰兩虛型2 型糖尿病病證結合大鼠模型的證候表現可能與Egr2、Igfbp1 和Adamts4基因上調及G0s2、Mid1ip1 和Bhlhe40 基因下調有關聯。