水消毒副產物鹵代苯醌的結構與毒性分析

杜海英, 姜永莉, 韋英慣,3, 李金華, 盧日峰

（1.吉林大學公共衛生學院衛生毒理學教研室，吉林 長春 130021；2.吉林國際旅行衛生保健中心長春海關口岸門診部，吉林 長春 130062；3.廣西壯族自治區河池市疾病預防控制中心，廣西 河池 547000）

鹵代苯醌（halobenzoquinones，HBQs）是一類新型未受控水消毒副產物（disinfection byproducts，DBPs），在消毒處理后的飲用水和泳池水中均有檢出［1-2］。QIN 等［3］于2009 年首次在氯和氯胺消毒飲用水中檢出2，6-二氯-1，4-苯醌（2，6-dichloro-1，4-benzoquinone，2，6-DCBQ）。目前，在消毒水中已測得的HBQs 有12 種［1］。流行病學和定量構效關系研究［4］表明：HBQs 是一類具有致癌風險的DBPs。HBQs 可觀察到的有害效應最低水平 （lowest observed adverse effect levels，LOAELs）較常見的DBPs 如三鹵代甲烷和鹵代乙酸低1 000 倍［5］，表明HBQs 具有更強的毒性。HBQs 的毒性特征與其結構密切相關。HBQs 是一類結構多樣的化合物，取代基團的種類、數量和取代位置均會影響其毒性［6］。目前，關于HBQs 的研究尚不多見。因此，針對HBQs 類化合物定量結構-毒 性 關 系 （quantitative structure-toxicity relationship，QSTR）的進一步研究具有重要意義。本研究選取水DBPs 中的5 種HBQs，通過細胞毒性檢測獲取細胞生長的半數抑制濃度（median inhibitory concentration，IC50），探討不同取代基HBQs 的QSTR，分析影響HBQs 細胞毒性的結構參數，為預測HBQs 潛在的健康風險提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人肝癌HepG2 細胞由吉林大學公共衛生學院衛生毒理學實驗室保存。2，6-DCBQ（CAS#697-91-6）、2，5-二溴-1，4-苯醌（2，5-dibromo-1，4-benzoquinone，2，5-DBBQ）（CAS#1633-14-3）和中性紅攝取試驗（neutral red uptake，NRU）試劑盒（美國Sigma 公司），2，6-二溴-1，4-苯醌（2，6-dibromo-1，4-benzoquinone，2，6-DBBQ）（CAS#19643-45-9）和2，6-二氯-3-甲基-1，4- 苯 醌 （2，6-dichloro-3-methyl-1，4-benzoquinone，DCMBQ）（CAS#40100-98-9，加拿大TRC 公司），2，3，6-三氯-1，4-苯醌（2，3，6-trichlorocyclohexa-1，4- benzoquinone，TCBQ）（CAS#634-85-5，上海艾康睿醫藥科技有限公司），MTS 檢測試劑盒（美國Promego 公司），DMEM培養基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（美國Gibco 公司）。熒光酶標儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 細胞培養和分組取對數生長期HepG2 細胞制備單細胞懸液，細胞終濃度為1×104mL－1，細胞懸液以每孔100 μL 的密度接種于96 孔細胞培養板，每組5 個平行孔，繼續培養24 h 后，棄原液，采用不同濃度HBQs 溶液作用細胞。HBQs 原液由甲醇（methanol，MeOH）溶解配制，稀釋后HBQs 溶液中MeOH 濃度均低于1.33%。采用含10%FBS 的DMEM 培養基稀釋至實驗所需濃度。實驗設空白對照組（10%FBS+DMEM 培養基）和陰性對照組（10%FBS+DMEM 培養基+1.33% MeOH）。

1.3 MTS 法檢測人肝癌HepG2 細胞存活率人肝癌HepG2 細胞給予不同濃度HBQs 培養24 h 后，于96 孔細胞培養板中每孔加入20 μL MTS 溶液，繼續培養4 h，室溫下震蕩10 min，采用熒光酶標儀于490 nm 波長處檢測吸光度（A）值，計算細胞存活率。每個作用濃度重復試驗 3 次，以log［HBQ］為橫坐標，細胞存活率為縱坐標繪制劑量-反應曲線。細胞存活率=（實驗組A 值－空白對照組A 值）/（陰性對照組A 值－空白對照組A 值）×100%。

1.4 NRU 法檢測人肝癌HepG2 細胞存活率人肝癌HepG2 細胞給予不同濃度HBQs 培養24 h 后，于96 孔培養板中每孔加入1%中性紅溶液20 μL，37 ℃孵育2 h，棄原液，PBS 緩沖液沖洗1 次，每孔加入50 μL 助溶劑（1%乙酸溶于50%MeOH），震蕩混勻10 min，采用熒光酶標儀于540 nm 波長處檢測A 值，計算細胞存活率。每個作用濃度重復試驗3 次，繪制劑量-反應曲線。細胞存活率=（實驗組A 值－空白對照組A 值）/（陰性對照組A 值－空白對照組A 值）×100%。

1.5 HBQs 對人肝癌HepG2 細胞的細胞毒性檢測采用OriginPro 8.5 統計軟件計算不同濃度HBQs 作用24 h 時各組細胞IC50，即細胞存活率達到50%時抑制劑的濃度，并計算lgIC50。以各組細胞IC50代表HBQs 對人肝癌HepG2 細胞的細胞毒性。

1.6 HBQs 結構參數的選擇和計算根據參考文獻［6］預測可能會影響HBQs 細胞毒性的結構參數，包括辛醇-水分配系數（logP）、解離常數（pKa）、摩爾折射率（R）、摩爾表面積（S）、摩爾體積（V）、偶極矩（μ）、最高占據軌道能量（EHOMO）和最低未占軌道能量（ELUMO）。采用量子化學計算模塊MOPAC 計算各HBQs 的結構參數。

1.7 QSTR 模型構建采用單因素線性回歸分析方法，根據每種HBQs 的lgIC50和HBQs 結構參數構建QSTR 模型，分析每種HBQs 的lgIC50與HBQs 結構參數的相關性。

1.8 統計學分析采用SPSS 18.0 統計軟件和GraphPad Prism 5 軟件進行統計學分析和繪圖。每種HBQs 的IC50與HBQs 結構參數相關性分析采用單因素線性回歸分析方法。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 MTS 法和NRU 法檢測HBQS 的作用濃度

MTS 法確定HBQs 的作用濃度：2，6-DCBQ為75、100、125、150、175、200、225 和250 μmol·L－1，DCMBQ 為175、200、225、250、275、300 和325 μmol·L－1，TCBQ 為200、225、250、275、300 和325 μmol·L－1，2，5-DBBQ 為75、100、125、150、175 和200 μmol·L－1，2，6-DBBQ為200、225、250、275、300 和325 μmol·L－1。NRU 法確定HBQs 的作用濃度：2，6-DCBQ 為25、50、75、100 和125 μmol·L－1，DCMBQ 為125、150、175、200、225 和250 μmol·L－1，TCBQ 為175、200、225、250、275 和300 μmol·L－1，2，5-DBBQ 為75、100、125、150 和175 μ mol·L－1，2，6-DBBQ 為125、150、175、200 和225 和250 μmol·L－1。

2.2 MTS 法檢測人肝癌HepG2 細胞存活率和IC50各組HepG2 細胞存活率隨HBQs 濃度的升高明顯降低，呈現劑量-反應關系。見圖1。5 種HBQs 的 IC50見表1。以IC50代表細胞毒性，IC50越低，HBQs 的細胞毒性越大。5 種HBQs 對HepG2細胞毒性作用為 2，6-DCBQ＞2，5-DBBQ＞DCMBQ＞TCBQ＞2，6-DBBQ。

表1 MTS 法檢測HBQs 作用于HepG2 細胞的IC50Tab.1 IC50 of HBQs on HepG2 cells detected by MTS method（n=3）

圖1 MTS 法檢測各組HepG2 細胞存活率與HBQs 的劑量-反應曲線Fig.1 Dose-response curves of survival rates of HepG2 cells and HBQs in various groups detected by MTS method

2.3 NRU 法檢測人肝癌HepG2 細胞存活率和IC50各組HepG2 細胞存活率，隨HBQs 濃度的升高明顯降低，呈劑量-反應關系，見圖2。5 種HBQs 的 IC50見表2。5 種HBQs 對HepG2 細胞毒性作用為2，6-DCBQ＞2，5-DBBQ＞DCMBQ＞2，6-DBBQ＞TCBQ。

表2 NRU 法檢測HBQs 作用于HepG2 細胞的IC50Tab.2 IC50 of HBQs on HepG2 cells detected by NRU method（n=3）

圖2 NRU 法檢測各組HepG2 細胞存活率與HBQs 的劑量-反應曲線Fig.2 Dose-response curves of survival rates of HepG2 cells and HBQs in various groups detected by NRU method

2.4 HBQs 的結構參數采用量子化學計算模塊MOPAC 計算5 種HBQs 的結構參數，HBQs 結構參數見表3。

表3 HBQs 的結構參數Tab.3 Structural parameters of HBQs

2.5 單因素線性回歸分析QSTR 模型MTS 法和NRU 法檢測HBQs 的lgIC50與HBQs 結構參數之間相關性較低（R2＜0.5），差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。由于DCMBQ 包含1 個甲基取代基和2 個鹵素取代基，而其他HBQs 僅包含鹵素取代基，DCMBQ 與其他HBQs 在結構上存在差異，因此從總體數據中剔除了DCMBQ，再對4 種HBQs的lgIC50與HBQs 結構參數進行單因素線性回歸分析，MTS 法和NRU 法檢測4 種HBQs 的lgIC50與HBQs結構參數之間相關性較低（R2＜0.5），差異無統計學意義（P＞0.05）。見表5。

表4 MTS 和NRU 法檢測HBQs 的lgIC50 與HBQs 結構參數的相關性Tab.4 Correlations between lgIC50 of HBQs and structural parameters of HBQs detected by MTS and NRU methods

表5 MTS 和NRU 法檢測剔除DCMBQ 后HBQs 的lgIC50與HBQs 結構參數的相關性Tab.5 Correlations between lgIC50 of HBQs and structural parameters of HBQs after removal of DCMBQ detected by MTS and NRU method

3 討 論

人肝癌HepG2 細胞有較完整的代謝酶，是進行毒理學試驗特別是遺傳毒物檢測中常用的細胞。目前關于HBQs 及其代謝產物尚未完全闡明，有研究［5］表明HBQs 具有潛在的遺傳毒性和致癌性。因此，本研究采用HepG2 細胞探討HBQs 的細胞毒性作用，結果表明：5 種HBQs 對HepG2 細胞的作用濃度范圍差異較大，其檢測到最低有效作用濃度的差異較大，表明5 種HBQs 的細胞毒性存在顯著差異。采用MTS 法和NRU 法檢測每種HBQs 細胞毒性作用大小的順位結果基本一致，其差異在于2，6-DBBQ 和TCBQ 的細胞毒性大小不同，可能與兩種方法的檢測機制不同有關。

本研究結果顯示：與2，6-DBBQ 比較，2，5-DBBQ 對HepG2 細胞的毒性作用更大，表明在HBQs 的同分異構體中，鹵素原子不同的取代位置可影響HBQs 類化合物的毒性，其毒性大小與鹵代原子的數量亦有相關性。ZUO 等［7］研究顯示：CHO-K1 細胞經HBQs 染毒6、12 和24 h 后，2，5-DBBQ 和2，5-DCBQ 的細胞毒性均明顯高于相應的2，6-HBQ 異構體；且氯代HBQs 的細胞毒性隨1、2、3或4個氯取代基的存在而變化。LECURIEUX等［8］研究發現：在比較相同的異構結構時，HBQs 的氯代、溴代和碘代細胞毒性呈遞減趨勢，即二碘-HBQ ＞二溴- HBQ ＞二氯-HBQ。此結果與報道的其他DBPs 的細胞毒性一致，如鹵乙酸，其中碘乙酸＞溴乙酸＞氯乙酸［9-11］，該毒性順位存在于多種哺乳動物和人類細胞系中，證實HBQs 的異構結構、取代原子種類和數量可以明顯影響其產生的細胞毒性作用。

化學物質的理化性質可影響其在細胞內的吸收、代謝、生物轉化和在細胞內外的轉運。本研究選取8 種可能會影響HBQs 細胞毒性的結構參數，并采用量子化學計算模塊MOPAC 計算HBQs 的結構參數。ELUMO代表電子的親和度，與自由基代謝物形成的還原電位相關性較大［12-14］。LIU 等［15］使用雙參數多線性回歸分析評估ELUMO與HBQs 細胞毒性的相關性，結果表明兩者之間有較好的相關性。與ELUMO比較，EHOMO具有供電子能力，且與氧化電位相關性較大［16］。ELUMO和EHOMO均可代表氧化還原電位［17］。在芳香鹵代DBPs 的發育毒性比較研究［18］中發現：EHOMO是影響毒性比較重要的理化參數。反映分子的平均電荷分離和電子分布，S 和R均可用來描述分子的三維結構［19］。QSTR 研究［20］顯示：R 與BQ 化合物誘導的人肝細胞毒性呈中度相關。logP 描述了物質在油質與水質兩相中的分配特點。PLEWA 等［10］研究發現：logP 與DBPs 的細胞毒性和遺傳毒性均具有較大相關性。但也有研究［7，21］認為logP 與細胞毒性不相關，在QSTR 研究中，最常使用的定量分析方法是線性回歸分析［22］。本研究通過單因素多元線性回歸分析，采用MTS 法和NRU 法測得HBQs 的lgIC50與結構參數之間相關性較低，未能建立起QSTR。這可能是由于樣本數較少，難以對結構參數進行較為準確的估計和計算，使分析結果產生較大的偏差。此外，在計算結構參數前，需要將化合物的結構圖規則化，否則會因手繪角度的差別而造成計算出的參數產生偏差，以致準確值難以重現，使結構參數值的計算結果不夠準確和數據分析結果無統計學意義。

綜上所述，HBQs 類化合物中鹵素原子的取代位置和種類可影響其對HepG2 細胞的毒性作用，苯環上鹵素的取代基數量也可影響其細胞毒性，并呈現鹵素取代越多其毒性越小的趨勢。