miR-93-5p 靶向下調ROCK2 表達對類風濕性關節炎成纖維樣滑膜細胞增殖、遷移和侵襲的影響

楊 舟, 林書典, 詹宇威, 肖 璐, 符克英, 黃小蝶

（海南省人民醫院 海南醫學院附屬海南醫院風濕免疫科，海南 海口 570000）

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是以關節滑膜炎為主要特征的系統性疾病。作為滑膜的主要組成細胞，成纖維樣滑膜細胞（fibroblastlike synoviocytes，FLSs）在RA 患者滑膜組織中具有腫瘤細胞的特點，呈增殖、遷移和侵襲能力異常，可誘發致炎因子和蛋白酶的分泌，導致關節內軟骨和骨的破壞及滑膜炎癥［1-2］。Rho 相關螺旋卷曲蛋白激酶（Rho associated coiled-coil containing protein kinases，ROCK）作為小型Rho 三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）酶的主要下游效應蛋白，是細胞黏附、遷移、收縮和增殖等過程的多功能調節劑，參與癌癥、糖尿病和RA 等各種疾病的發生發展［3］。ROCK2 作為ROCK 蛋白家族成員之一，已被證實在RA 中高表達，并促進RA-FLSs的增殖、遷移和侵襲［4］。近年來，微小RNA（microRNA，miRNA）常作為各種疾病的治療靶點。miR-93-5p 是炎癥抑制因子，可抑制骨關節炎軟骨細胞凋亡和炎癥反應［5］。過表達miR-93-5p 可通過靶向下調ROCK2 表達進而抑制糖尿病腎病細胞增殖和纖維化并加速細胞凋亡［6］。目前有關miR-93-5p 與RA 關系的研究尚未完全闡明，因此本研究探討miR-93-5p 對RA-FLSs 增殖、遷移和侵襲的影響，并初步闡明其作用機制，旨在為臨床RA 的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇2020 年1 月—2021 年6 月在海南省人民醫院風濕免疫科接受治療的RA 患者（RA 組）37 例和接受關節置換手術的關節創傷患者（對照組）30 例作為研究對象，收集新鮮滑膜組織樣本。所有RA 患者均符合美國風濕病學會（american college of rheumatology，ACR）1987 年RA 診斷標準［7］，所有關節創傷患者無關節炎病史、未用過激素和慢作用藥物等。所有患者均簽訂知情同意書，并獲得海南省人民醫院倫理委員會批準。

1.2 細胞、主要試劑和儀器293T 細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。DMEM 完全培養基、Ⅰ型膠原酶、Matrigel 基質膠和結晶紫購自美國Sigma 公司，LipofectamineTM2000 轉染試劑購自美國Thermo Fisher 公司，TaqMan miRNA 逆轉錄試劑盒、TaqMan miRNA 定量PCR 試劑盒、Golden MLV 反轉錄酶和RAPA3G Probe qPCR MasterMix購自哈爾濱新?；驒z測有限公司，miR-93-5p mimics 及其陰性對照mimics NC 和ROCK2 過表達質粒載體（OE-ROCK）及其空載質粒載體（OENC）購自廣州銳博生物科技有限公司，抗體CD14-PE、CD55-PE、CD68-FITC 及同型陰性對照抗體購自美國BD 公司，Vimentin 抗體（免疫熒光）、ROCK2 抗體、Ki-67 抗體、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體、基質金屬蛋白酶（matrix metallopeptiase，MMP）-2抗體、MMP-9 抗體和GAPDH 抗體購自英國Abcam 公司，BeyoClickTMEdU-488 細胞增殖檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，CCK-8試劑盒和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，Transwell小室（孔徑8.0 μm）購自美國Corning 公司。流式細胞儀（型號：AttuneTMNxT）、CO2培養箱（型號：HeracellTMVios 250i）和多功能酶標儀（型號：Varioskan LUX）購自美國Thermo Fisher 公司，實時熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀（型號：CFX96-Connect 96）購自美國Bio-Rad 公司，激光共聚焦顯微鏡（型號：DMIL LED）購自日本Nikon 公司。

1.3 RA-FLSs 的分離、培養和鑒定將RA 組患者滑膜組織于無菌條件下剪碎，并加入1 % Ⅰ型膠原酶消化2 h，吸取組織塊轉移至培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養箱培養2 h。取出培養瓶加入DMEM 完全培養基，繼續置于CO2培養箱中培養；每隔2 d 換液1 次，發現有細胞爬出后，去除組織塊，繼續培養至細胞密度達80 %以上，采用0.25 %胰蛋白酶消化細胞，并按1∶3 比例進行傳代。采用免疫熒光法和流式細胞術鑒定所培養的細胞為RA-FLSs。免疫熒光法：將第3 代RA-FLSs培養于細胞爬片上，待細胞生長至80 %時，棄去培養基，PBS 緩沖液洗滌2 次，加入4 %多聚甲醛室溫固定30 min，PBS 緩沖液洗滌2 次，加入0.5 %Triton X-100 室溫通透20 min，PBS 緩沖液洗滌2 次，加入5 %BSA 溶液于37 ℃封閉1 h，棄去封閉液，加入一抗Vimentin 抗體，4 ℃條件下孵育過夜，PBS 緩沖液洗滌2 次，加入熒光二抗，于37 ℃孵育1 h，PBS 緩沖液洗滌2 次，加入500 μL含DAPI 抗熒光淬滅封片液，激光共聚焦顯微鏡拍照并記錄。流式細胞術：將第3 代RA-FLSs 消化調整密度為1×106mL－1的細胞懸液，取100 μL 細胞懸液加入至各個檢測管中，分別加入熒光標記的CD14-PE、CD55-PE 和CD68-FITC 抗體及同型陰性對照抗體，避光孵育30 min，1 500 r·min－1離心5 min，棄上清，將細胞沉淀加入PBS 緩沖液重懸后，流式細胞術檢測RA-FLSs 表面抗原表達情況。

1.4 細胞轉染和分組將第3 代RA-FLSs 以每孔2×105個細胞的密度接種于6 孔細胞培養板上，細胞密度生長至80 %時，按照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書操作進行轉染。將RA-FLSs 分為空白組、mimics NC 組（轉染miR-93-5p mimics NC）、mimics 組（轉染miR-93-5p mimics）、OENC 組（轉染ROCK2 過表達空載質粒）、OEROCK2 組（轉染ROCK2 過表達質粒）、mimics+OE-NC 組（共轉染miR-93-5p mimics 和ROCK2 過表達空載質粒）和mimics+OE-ROCK2 組（共轉染miR-93-5p mimics 和ROCK2 過表達質粒）。

1.5 RT-qPCR 法檢測2 組患者滑膜組織和各組RA-FLSs 中miR-93-5p 及ROCK2 mRNA 表達水平將2 組患者滑膜組織和各組RA-FLSs 裂解，提取總RNA，各取2 μg 滑膜組織和細胞中總RNA，反轉錄為cDNA，配置RT-qPCR 反應體系，進行RT-qPCR 反應，引物序列：miR-93-5p F 5′-GAGTGTCAAAGTGCTGTTCGTG-3′，miR-93-5p R 5′-GCAG GGTCCGAGGTATTC-3′；U6 F 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6 R 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；ROCK2 F 5′-GAACGTCAGGATGCAGATGG-3′，ROCK2 R 5′-GCCAAAGAGTCCCGTTCATC-3′；β-actin F 5′-CCCTGGAGAAGAGCTACGAG-3′，β-actin R 5′-GGAAGGAAGGCTGGAAGAGT-3′。反應條件：95 ℃ 熱啟動5 min；95 ℃變性5 s；55 ℃退火10 s，72 ℃延伸 30 s，循環40 次。以U6 作為miR-93-5p 的內參，β-actin 作為ROCK2 mRNA 的內參，采用2－△△Ct法計算目的基因mRNA 表達水平。

1.6 CCK-8 法檢測各組RA-FLSs 增殖活性取各組對數生長期RA-FLSs 進行細胞計數，并將其調整至密度為5×104mL－1的細胞懸液。于96 孔細胞培養板中每孔加入100 μL RA-FLSs 懸液，置于培養箱中過夜。分別培養24 和48 h，取出細胞培養板，加入CCK-8 溶液，繼續培養4 h 后置入酶標儀，于波長450 nm 處檢測各孔吸光度（A）值，同時設置調零孔（每孔100 μL 培養基），每組設定4 個復孔。以A 值代表各組細胞增殖活性。

1.7 EdU 染色檢測各組RA-FLSs 中EdU 陽性細胞率將各組對數生長期RA-FLSs 接種至96 孔細胞培養板上，待細胞貼壁后，每孔加入100 μL EdU 培養基（50 μmol·L－1）孵育2 h，PBS 緩沖液清洗2 次，加入4 %多聚甲醛固定液室溫孵育30 min，含0.5 %Triton X-100 的PBS 處理10 min，PBS 緩沖液清洗后，加入Apollo 染色反應液，室溫避光脫色搖床孵育30 min，再以Hoechst33342 反應液復染進行DNA 染色。染色完成立即置于顯微鏡下觀察細胞染色情況，并隨機選取5 個視野進行計數，計算各組RA-FLSs 中EdU 陽性細胞率。EdU陽性細胞率=EdU 陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.8 Transwell 小室實驗檢測各組RA-FLSs 遷移和侵襲數遷移實驗：將RA-FLSs 制成密度為5×105mL－1的細胞懸液，取100 μL 加入Transwell 上室，下室加入600 μL 含10 %血清的培養基，于37 ℃、5 % CO2培養箱中培養24 h，取出小室，用棉簽拭去上室細胞，加入70% 甲醛固定1 h，0.1 %結晶紫溶液染色30 min，取出小室內聚碳酸酯膜，移至載玻片上，用中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察細胞遷移情況，并隨機選取5 個視野，計數遷移細胞數并取其平均值。侵襲實驗：將Matrigel膠置于4 ℃冰箱過夜，已融化的Matrigel 膠采用無血清的培養基稀釋至300 mL·L－1，取100 μL 均勻涂抹在聚碳酸酯膜上表面，室溫放置3 h 成膠狀，后續操作同遷移實驗，于顯微鏡下隨機選取5 個視野，計數穿膜細胞數，并取其平均值作為侵襲細胞數。實驗重復3 次。

1.9 Western blotting 法檢測各組RA-FLSs 中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平收集各組細胞，加入RIPA 裂解液裂解后，13 000 r·min－1離心10 min，收集上清，置于酶標儀中測定蛋白濃度。將檢測蛋白樣品置于沸水浴中10 min，使蛋白充分變性，取30 μg 總蛋白上樣行10% SDS-PAGE 電泳，采用濕式電轉PVDF膜，轉膜結束后，標記Marker，并進行麗春紅染色后剪膜，TBST 溶液洗膜2 次，將膜完全浸沒5 %脫脂奶粉封閉液內室溫輕搖1 h，將封閉后的膜放入雜交袋中，分別加入一抗ROCK2 抗體（1∶1 000）、Ki-67 抗體（1∶1 000）、PCNA 抗體（1∶1 000）、MMP-2抗體（1∶1 000）、MMP-9抗體（1∶1 000）和GAPDH 抗體（1∶1 000），室溫孵育10 min，4 ℃過夜。次日，室溫孵育30 min，TBST 溶液洗膜5 次，加入二抗（1∶10 000）室溫輕搖40 min，TBST 溶液洗膜5 次，滴加增強型化學發光液（enhanced chemiluminescence，ECL）至膜上反應2 min，于凝膠成像系統中觀察拍照。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1.10 miR-93-5p 與ROCK2 的靶向關系驗證和細胞中雙熒光素酶活性檢測采用TargetScan 7.2 在線網站預測miR-93-5p 和ROCK2 的靶向結合位點。根據結合位點序列，設計合成ROCK2-3′-UTR 野生型（ROCK2-WT）和ROCK2-3′-UTR 突變型（ROCK2-MUT）片段序列，并分別構建至熒光素酶報告載體中，得到ROCK2-WT 和ROCK2-MUT熒光素酶報告質粒。采用Lipofectamine 2000 試劑分別將miR-93-5p mimic 和mimic NC 與ROCK2-WT 或ROCK2-MUT 質粒共同轉染對數生長期293T 細胞。轉染48 h 后，將已充分裂解的細胞按照雙熒光素酶報告檢測試劑盒說明書進行操作，并采用酶標儀測定細胞中螢火蟲和海腎熒光素酶活性，計算熒光素酶活性。熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.11 統計學分析采用SPSS 22.0 統計軟件進行統計學分析。2 組患者滑膜組織和各組細胞中miR-93-5p 及ROCK2 mRNA 表達水平，各組細胞增殖活性、EdU 陽性細胞率、遷移和侵襲細胞數、細胞中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平及細胞中熒光素酶活性均符合正態分布，以±s 表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 RA-FLSs 鑒定免疫熒光法檢測結果顯示：Vimentin 蛋白表達呈陽性。流式細胞術檢測結果顯示：第3 代RA-FLSs 表面CD55 呈陽性表達，陽性表達率為（95.4%±4.9%），CD14 和CD68 呈陰性表達，陰性表達率為（4.1%±1.3%）和（3.3%±1.0%）。由此證實所分離的細胞是RAFLSs。見圖1。

圖1 免疫熒光法檢測RT-FLSs 中Vimentin 表達（×400）Fig.1 Expressions of Vimentin in RT-FLSs detected by immunofluorescence method（×400）

2.2 2 組患者滑膜組織中miR-93-5p 和ROCK2 mRNA 表達水平與對照組（1.00±0.02 和1.00±0.01）比較，RA 組患者滑膜組織中miR-93-5p 表達水平（0.26±0.05）明顯降低（P＜0.01），ROCK2 mRNA 表達水平（5.87±0.30）明顯升高（P＜0.01）。

2.3 各組 RA-FLSs 中 miR-93-5p 和 ROCK2 mRNA 及蛋白表達水平與空白組［（1.00±0.02）、（1.00±0.01）和 （1.00±0.05）］和mimics NC 組［（1.00±0.02）、（1.00±0.01）和（1.00±0.05）］比較，mimics 組細胞中miR-93-5p表達水平（8.06±0.05）明顯升高（P＜0.01），ROCK2 mRNA （0.19±0.05）和蛋白（0.11±0.03）表達水平明顯降低（P＜0.01）。見圖2。

圖2 miR-93-5p mimics 轉染后RA-FLSs 中ROCK2 蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expression of ROCK2 protein in RA-FLSs after transfected with miR-93-5p mimics

2.4 各組RA-FLSs 細胞增殖活性和EdU 陽性細胞率培養24 和48 h 時，與mimics NC 組比較，mimics 組細胞增殖活性和EdU 陽性細胞率明顯降低（P＜0.01），OE-ROCK2 組細胞增殖活性和EdU 陽性細胞率明顯升高（P＜0.01），而OE-NC組上述指標差異均無統計學意義（P＞0.05）。培養24 和48 h 時，與mimics 組比較，mimics+OEROCK2 組細胞增殖活性和EdU 陽性細胞率明顯升高（P＜0.01），而mimics+OE-NC 組細胞上述指標差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖3～5。

圖3 CCK-8 法檢測各組細胞增殖活性Fig.3 Proliferation activity rates of cells in various groups detected by CCK-8 method

圖4 EdU 染色檢測各組EdU 陽性細胞（×400）Fig.4 EdU positive cells in various groups detected by EdU staining（×400）

圖5 各組EdU 陽性細胞率Fig.5 Rates of EdU positive cells in various groups

2.5 各組RA-FLSs 的遷移和侵襲數與mimics NC 組比較，mimics 組RA-FLSs 的遷移和侵襲數明顯減少（P＜0.01），OE-ROCK2 組RA-FLSs 的遷移和侵襲數明顯增加（P＜0.01），而OE-NC 組RA-FLSs 的遷移和侵襲數差異均無統計學意義（P＞0.05）。與mimics 組比較，mimics+OE-ROCK2 組RA-FLSs 的遷移和侵襲數明顯增加（P＜0.01），而mimics+OE-NC 組RA-FLSs 的遷移和侵襲數差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖6 和7。

圖6 Transwall 小室實驗檢測各組遷移細胞數Fig.6 Numbers of migration cells in various groups detected by Transwell champer assay

圖7 Transwell 小室實驗檢測各組細胞侵襲細胞數Fig.7 Numbers of invasion cells in various groups detected by Transwell champer assay

2.6 各組RA-FLSs 中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平與mimics NC 組比較，mimics 組細胞中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），OE-ROCK2 組細胞中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01），OE-NC 組細胞中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。與mimics 組比較，mimics+OE-ROCK2 組細胞中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01），mimics+OE-NC 組細胞中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖8。

圖8 Western blotting 法檢測各組細胞中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig.8 Electrophoregram (A) and histogram(B) of expressions of ROCK2,Ki-67,PCNA,MMP-2, and MMP-9 proteins in cells in various groups detected by Western blotting method

2.7 miR-93-5p 與ROCK2 的靶向關系驗證

TargetScan7.2 在線網站分析結果顯示：miR-93-5p 與ROCK2 -3′-UTR 之間存在靶向結合位點，提示miR-93-5p 可靶向調控ROCK2。雙熒光素酶報告結果顯示：轉染miR-93-5p mimic 可明顯降低ROCK2-WT 組細胞中熒光素酶活性（P＜0.01），但ROCK2-MUT 組細胞中熒光素酶活性差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖9。

圖9 ROCK2-WT(A)和ROCK2-MUT(B)組細胞中熒光素酶活性Fig.9 Luciferase activies in cells in ROCK2-WT (A) and ROCK2-MUT (B) groups

3 討 論

FLSs 作為RA 的主要效應細胞，可產生各種致病介質，如趨化因子和MMP，促進炎癥反應和骨壞死［8-9］。研究［10-12］發現：在RA-FLSs 中出現多種miRNA 表達異常，miRNA 在FLSs 和破骨細胞中表達失調，促進MMP 分泌，引起炎癥和細胞外基質降解，破壞關節。miR-124a 在RA 患者滑膜組織中呈低表達，通過靶向調控AKT2 基因抑制RAFLSs 的增殖、遷移和侵襲［13］。而miR-93-5p 作為一種細胞增殖、遷移和侵襲的抑制基因，常用于治療各種癌癥疾病，目前其在RA 疾病中的作用尚未完全闡明［14］。本研究結果顯示：RA-FLSs 中Vimentin 表達呈陽性，細胞表面CD55 呈陽性表達，而CD14 和CD68 呈陰性表達，提示所分離的細胞是RA-FLSs。進一步研究發現：過表達miR-93-5p 可抑制RA-FLSs 的增殖、遷移和侵襲，而抑制miR-93-5p 表達則促進RA-FLSs 增殖、遷移和侵襲，提示miR-93-5p 可能參與RA 的發生。

本研究結果顯示：miR-93-5p 在RA 患者滑膜組織中低表達，ROCK2 在RA 患者滑膜組織中高表達。miR-93-5p mimics 轉染后，RA-FLSs 中miR-93-5p 高表達，而ROCK2 低表達。雙熒光素酶報告基因實驗證實：miR-93-5p 靶向負調控ROCK2。ROCK2 是一種參與細胞黏附和收縮過程中細胞骨架重組的蛋白質［15］。ROCK2 參與RA 疾病的發生，表現為上調ROCK2 促進FLSs 增殖、遷移和侵襲［16-17］。本研究結果顯示：過表達miR-93-5p 能顯著降低RA-FLSs 增殖、遷移和侵襲能力，而過表達ROCK2 呈現相反效果。共轉染miR-93-5p mimics 和OE-ROCK2 后，ROCK2 可以明顯逆轉單一過表達miR-93-5p 對RA-FLSs 的增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用。提示過表達miR-93-5p 通過下調ROCK2 表達，從而降低RA-FLSs 的增殖、遷移和侵襲能力。

細胞的增殖、遷移和侵襲能力受多種機制調控［18］。陳盛燁等［19］認為：下調腎癌細胞中Ki-67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達，可抑制細胞的增殖、遷移和侵襲。Ki-67 和PCNA 是細胞增殖標記蛋白，MMP-2 和MMP-9 是細胞遷移和侵襲標記蛋白，調控多種癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力［20］。研究［21-22］顯示：在癌細胞中降低ROCK2 表達水平可引起Ki-67 和MMP-2 表達下調，進而抑制癌細胞的遷移和侵襲。本研究進一步分析miR-93-5p 靶向ROCK2 表達影響RA-FLSs 增殖、遷移和侵襲能力機制的結果顯示：過表達miR-93-5p 后RA-FLSs 中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平明顯降低，而過表達ROCK2后，RA-FLSs 中ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2和MMP-9 蛋白表達水平明顯升高。提示ROCK2表達與細胞增殖、遷移和侵襲相關蛋白表達呈正相關關系。同時，過表達ROCK2 可以明顯逆轉過表達miR-93-5p 引起的ROCK2、Ki-67、PCNA、MMP-2 和MMP-9 蛋白表達水平降低。提示過表達miR-93-5p 可能通過靶向下調ROCK2 表達進而調控細胞增殖、遷移和侵襲等標記蛋白并影響RAFLSs 的增殖、遷移和侵襲能力。

綜上所述，RA 患者滑膜組織中miR-93-5p 呈低表達，ROCK2 呈高表達，過表達miR-93-5p 可抑制RA-FLSs 增殖、遷移和侵襲，其機制可能與靶向下調ROCK2 表達有關。