二甲雙胍對H9C2 心肌細胞肥大的改善作用及其機制

黃德盛, 趙亞楠, 陳 云, 孫藝瑤, 覃偉林, 劉謀杰, 謝菊華

（1.沈陽醫學院組織胚胎學教研室，遼寧 沈陽 110034；2.中國醫科大學附屬第一醫院心內科，遼寧 沈陽 110034）

心肌細胞肥大是心肌細胞對傷害性刺激的代償性反應。在成年人心臟中，心肌細胞再生能力有限，每年的周轉率不足1%，因此在心臟容量超負荷等刺激下，心肌細胞無法通過細胞增殖適應壓力性應激，而是通過形態學增大來維持心臟泵血功能［1］。目前臨床上尚缺乏特效藥物治療心肌細胞肥大。二甲雙胍是臨床糖尿病治療的一線用藥，研究［2-3］顯示：二甲雙胍在降低血糖水平的同時還具有改善心肌細胞肥大、抑制動脈粥樣硬化及降低心肌梗死后心衰發生率或死亡風險等心血管保護作用，但其具體機制尚未完全闡明。

心臟是人體能量高需求器官，心肌細胞中的線粒體約占整個細胞的1/3［4］。且線粒體并非孤立的，而是相互聯通、處于分裂和融合平衡中，即線粒體動力學平衡［5-7］。與線粒體分裂有關的蛋白主要為動力相關蛋白1 （dynamin-related protein 1，Drp1），與線粒體融合有關的標志性蛋白主要有神經萎縮蛋白1 （optic atrophy 1，OPA1）、線粒體融合蛋白（mitofusin，MFN）1 和MFN2，分別介導線粒體內膜和外膜的融合，以連接線粒體和穩定膜電位，發揮細胞功能［8-9］。研究［10］發現：上調糖尿病心肌病大鼠心肌組織中OPA1 蛋白的表達可增加線粒體融合、恢復線粒體功能并改善心臟功能，提示加強線粒體融合可以作為治療心肌疾病的潛在治療策略。

臨床流行病學調查［11］顯示：未接受二甲雙胍治療的2 型糖尿病患者白細胞中總活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平和線粒體中ROS 水平均明顯升高，線粒體膜電位降低，MFN1、MFN2 和OPA1 mRNA 及蛋白表達水平降低。同時動物實驗［12］發現：二甲雙胍能夠通過調控線粒體動力學平衡和改善大鼠心肌缺血再灌注損傷的線粒體功能發揮心臟保護作用。為深入了解二甲雙胍的心臟保護作用及其可能的分子機制，本研究通過異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）作用于H9C2 心肌細胞以建立心肌細胞肥大模型，探討二甲雙胍對ISO 誘導的H9C2 細胞中線粒體形態及主要融合蛋白OPA1 和MFN2 的影響，為二甲雙胍對心血管疾病的多重保護作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器H9C2 心肌細胞 （中國科學院上海細胞庫提供）。低糖DMEM 和特級胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）均購自美國Hyclone 公司，ISO 購自美國Sigma 公司。CO2培養孵箱購自美國Thermo Fisher 公司，正置熒光顯微鏡和組織切片機購自德國Leica 公司，實時熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀購自美國Bio-Rad 公司。

1.2 心肌細胞肥大模型制備、細胞分組和處理無菌操作下培養H9C2 細胞。待細胞已鋪滿培養皿底，可傳代培養或凍存。細胞生長密度為約50%～70%時，棄去原培養液，饑餓處理24 h 后，對照組細胞不給予特殊處理，部分細胞給予50 μmol·L－1ISO 干預細胞24 h 作為ISO 組，建立心肌細胞肥大模型。Western blotting 法檢測2 組H9C2 細胞中腦納肽（brain natriuretic peptide，BNP）蛋白表達水平以驗證細胞模型，BNP 蛋白表達水平升高即為造模成功［13］。ISO 處理同時給予2 mmol·L－1二甲雙胍作用0.5 h、1.0 h、4.0 h、8.0 h 和24.0 h，分別收集細胞或直接保存以進行后續相應實驗。將細胞分為對照組、ISO 組、ISO+二甲雙胍組和二甲雙胍組。

1.3 CCK-8 法檢測各組細胞活力細胞接種4～6 h 后在細胞培養液中加入1/10 體積的CCK-8 溶液，充分混勻后于37 ℃恒溫箱內培養30 min。酶標儀于波長450 nm 處檢測各孔吸光度（A）值，操作時注意避免氣泡產生，每組3～5 個復孔，取平均值計算各組細胞活力。細胞活力= ［實驗組A 值－空白組A 值）］/［對照組A 值－空白組A 值］×100%。

1.4 結晶紫染色觀察各組心肌細胞形態表現和橫截面積于12 孔細胞培養板中接種細胞，各組細胞給藥結束后采用4%多聚甲醛固定1 h。隨后滴加1%結晶紫，室溫靜置2 h，顯微鏡下拍照并記錄，觀察各組心肌細胞形態表現。每孔隨機選取5 個視野，每個視野隨機選取10 個H9C2 細胞，采用Image J 軟件分析各組心肌細胞橫截面積，并取平均值。

1.5 RT-qPCR 法檢測各組心肌細胞中心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）mRNA 表達水平

PCR 引物均由北京鼎國采用Primer 5.0 設計并合成。提取各組細胞總RNA，采用核酸分析儀檢測波長260 nm 和280 nm 處的A 值以檢測RNA 純度。反轉錄為cDNA，并根據RT-qPCR 試劑盒說明書配制反應體系。ANP 引物序列：上游引物，5′-CCTGGACTGGGGAAGTCAAC-3′；下游引物，5′-GTCAATCCTACCCCCGAAGC-3′；GAPDH上游引物，5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物，5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。采用 2－ΔΔCt法計算目的基因mRNA 表達水平。

1.6 線粒體熒光探針觀察各組心肌細胞線粒體形態表現細胞給予藥物處理后，根據說明書配制 1 mmol·L－1Mito-Tracker Green 儲存液。取37 ℃預熱的1∶5 000 比例Mito-Tracker Green 儲存液加入至細胞培養液，共孵育30 min。去除染色工作液后加入新鮮培養液并采用熒光顯微鏡觀察各組細胞線粒體形態表現。鏡下線粒體呈明亮的強綠色熒光。

1.7 Western blotting 法檢測各組心肌細胞中OPA1 和MFN2 蛋白表達水平將提取的H9C2 細胞或凍存的心肌組織置入蛋白裂解液內提取蛋白。采用BCA 法測定蛋白濃度。依次配制SDS-聚丙烯酰胺分離膠和濃縮膠，上樣、電泳、轉膜和封閉，隨后一抗4 ℃孵育過夜，二抗孵育1.0～1.5 h，ECL 發光顯色，并采用Image J 軟件分析各蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1.8 統計學分析采用SPSS 22.0 統計軟件進行統計學分析。各組H9C2 細胞橫截面積和細胞活力，H9C2 細胞中ANP mRNA 表達水平及BNP、OPA1 和MFN2 蛋白表達水平均符合正態分布，以±s 表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 心肌細胞肥大模型鑒定50 μmol·L－1ISO 作用于H9C2 細胞24 h 后，與對照組［（1.00±0.11）和（1.00±0.04）］比較，ISO 組細胞橫截面積［（1.71±0.10）］增加（P＜0.05），細胞中BNP 蛋白表達水平（1.96±0.22）升高（P＜0.05），提示50 μmol·L－1ISO 作用于H9C2 細胞24 h 可以成功建立心肌細胞肥大模型。見圖1 和2。

圖1 ISO 處理后2 組H9C2 心肌細胞形態表現（結晶紫，×400）Fig.1 Morphology of H9C2 cardiomyocytes in two groups after treated with ISO(Crystal violet,×400)

圖2 2 組H9C2 細胞中BNP 蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of BNP protein in H9C2 cells in two groups

2.2 各組心肌細胞活力CCK-8 法檢測各組心肌細胞活力結果顯示：二甲雙胍作用8 h 時，細胞活力恢復效果最佳，故選取2 mmol·L－1二甲雙胍，作用時間為8 h。見圖3。

圖3 各組H9C2 心肌細胞活力Fig.3 Viabilities of H9C2 cardiomyocytes in various groups

2.3 各組心肌細胞中ANP mRNA 表達水平和線粒體形態表現RT-qPCR 法檢測結果顯示：與對照組比較，ISO 組細胞中ANP mRNA 表達水平升高（P＜0.05）。與ISO 組比較，二甲雙胍+ISO 組和二甲雙胍組細胞中ANP mRNA 表達水平降低（P＜0.05）。見圖4。線粒體熒光探針檢測結果顯示：對照組細胞中線粒體呈綠色熒光，多為短棒狀，少數線粒體絲線狀相連；與對照組比較，ISO 組H9C2 細胞中點狀線粒體明顯增加，ISO+二甲雙胍組和二甲雙胍組細胞中點狀線粒體明顯減少。見圖5。

圖4 各組H9C2 心肌細胞ANP mRNA 表達水平Fig.4 Expression levels of ANP mRNA in H9C2 cardiomyocytes

圖5 各組H9C2 心肌細胞線粒體形態表現（Bar=5 μm）Fig.5 Morphology of mitochondrium in H9C2 cardiomyocytes in various groups （Bar=5 μm）

2.4 各組心肌細胞中OPA1 和MFN2 蛋白表達水平與對照組比較，ISO 組細胞中線粒體融合標志性蛋白OPA1 和MFN2 蛋白表達水平降低（P＜0.05）。與ISO 組比較，ISO+二甲雙胍組和二甲雙胍組細胞中OPA1 和MFN2 蛋白表達水平升高（P＜0.05）。見圖6。

圖6 各組細胞中OPA1 和MFN2 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B，C）Fig.6 Electrophoregram(A) and histograms(B,C) of expressions of OPA1 and MFN2 proteins in cells in various groups

3 討 論

心肌細胞肥大一般可分為生理性和病理性心肌細胞肥大。生理性心肌細胞肥大一般發生在運動員和孕婦人群，其主要特征是一旦刺激緩解，心肌細胞肥大是可逆的［14］。而病理性心肌細胞肥大則是心肌細胞不可逆的病理性重塑，如高血壓和慢性瓣膜疾病所導致的心肌細胞肥大，易增加患者不良心血管事件的風險，嚴重者可誘發心力衰竭［15］。因此，有效改善或減輕病理性心肌細胞肥大對高血壓和慢性瓣膜疾病等疾病的治療有重要意義，同時構建簡單易操作且成功的心肌細胞肥大體內外模型對常見心血管疾病的基礎研究和臨床防治較為重要。本研究結果顯示：H9C2 細胞橫截面積明顯增加是心肌細胞肥大最常見指標之一，BNP 蛋白表達水平升高提示ISO 作用H9C2 細胞24 h 可以成功模擬心肌細胞肥大，為后續心肌細胞肥大的發病機制及藥物干預研究提供了基礎。

線粒體是心肌細胞能量產生的重要場所，在調節細胞內信號轉導和維持細胞穩態等方面發揮了重要作用。線粒體功能障礙與高血壓和動脈粥樣硬化等常見心血管疾病有密切關聯［16-18］。本課題組前期研究［19］發現：自發性高血壓心肌細胞肥大大鼠線粒體膜電位降低，過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α 表達下調，表明心肌細胞肥大與線粒體功能失調有關，維持線粒體功能和穩態對改善心肌細胞肥大具有重要意義。但心肌細胞中線粒體相互聯通，保持高度動態的線粒體動力學平衡［20-22］。通過融合分裂，線粒體可以在細胞內根據需求重新分布，滿足細胞的各種能量及生物信號轉導需求，保障細胞新陳代謝和生物體正常運轉。

線粒體動力學平衡是維持心臟功能所必需的，該平衡被打破會導致線粒體結構改變及功能障礙，誘發各種心肌疾病［23-25］。研究［26-28］顯示：線粒體動力學平衡失調在心力衰竭和缺血再灌注損傷等多種疾病的發生發展中發揮了重要作用。研究［29］發現：抑制線粒體動力相關蛋白的活性能夠減少心肌梗死小鼠線粒體過度分裂而減輕梗死區域心肌纖維化，改善心臟功能。LIU 等［30］發現：上調糖尿病心肌病大鼠心肌組織中OPA1 蛋白的表達能增加線粒體融合，恢復線粒體功能，改善心臟功能。本研究結果顯示：ISO 誘導的H9C2 細胞中點狀線粒體明顯增加，同時線粒體融合相關蛋白OPA1 和MFN2 蛋白表達水平降低。提示ISO 誘導的H9C2心肌細胞肥大與心肌細胞線粒體融合減少有關。線粒體融合減少可能是ISO 誘導心肌細胞肥大的可能分子機制。

二甲雙胍是臨床糖尿病治療的一線用藥，近些年已被證實具有良好的心血管保護作用［31］。本研究結果顯示：二甲雙胍干預后，ISO 誘導的H9C2細胞中ANP mRNA 表達水平降低。給予二甲雙胍后，ISO 誘導的H9C2 細胞中點狀線粒體減少，線粒體融合相關蛋白OPA1 和MFN2 蛋白表達水平升高。提示二甲雙胍可能通過調控OPA1 和MFN2 蛋白表達，維持線粒體動力學平衡，從而減輕ISO 誘導的H9C2 心肌細胞肥大。

綜上所述，二甲雙胍對ISO 誘導的H9C2 心肌細胞肥大有改善作用，且其改善作用可能與上調OPA1 和MFN2 蛋白表達及促進心肌細胞線粒體融合有關。