circ_EFCAB2 在癲癇細胞模型中的表達及其作用機制

張舒雅, 孫洪英, 毛 戩, 孟晨曦, 巴格隆

（1.內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院神經內科，內蒙古 包頭 014010；2.內蒙古科技大學包頭醫學院第三附屬醫院老年病科，內蒙古 包頭 014030；3.內蒙古科技大學包頭醫學院第三附屬醫院功能科，內蒙古 包頭 014030）

癲癇是常見的神經系統慢性疾病，全世界約有7 000 萬人受該疾病的影響，患病人群主要集中在中低收入國家［1］。癲癇被認為是由中樞神經系統興奮性神經元和抑制性神經元失衡引起的神經網絡異常超同步放電，其典型臨床特征是反復發作性的癇樣發作和廣泛或局部的肌肉痙攣和抽搐［2-3］。癲癇的致死率和致殘率嚴重影響癲癇患者及其家庭，也給社會帶來了沉重的經濟負擔。隨著細胞生物學和分子生物學的不斷發展，越來越多的研究者對癲癇的發病機制進行了探索。環狀RNA （circular RNA，circRNA）是非編碼RNA （non-coding RNA，ncRNA）重要的組成部分，其結構上無信使RNA 的5′（cap）和3′ poly（A）結構，其通過外顯子、內含子或2 個外顯子-內含子的反向剪接和融合形成共價鍵后連接形成閉合環狀結構，通過充當微小RNA （microRNA，miRNA）分子海綿來調控基因表達［4-9］。近年來，部分circRNA 被強調為人類疾病的關鍵參與者，包括癲癇等疾病［10］。GONG 等［11］發現：在癲癇患者中，circ_0067835 mRNA 表達水平明顯降低，過表達circ_0067835 可通過充當miR-155 分子海綿調控叉頭框蛋白O3a（forkheacd box O3a，FOXO3a）基因的表達，從而抑制SH-SY5Y 細胞增殖并增加細胞凋亡。ZHENG 等［12］發現：circ_DROSHA 過表達可通過靶向miR-106b-5p 調控心肌細胞增強因子2C（myocyte enhancer 2C，MEF2C），減輕無鎂溶液誘導的TLE 細胞模型損傷。LIN 等［13］發現：circ_ANKMY2 通過miR-106b-5p/叉頭框蛋白P1（frokhead box P1，FOXP1）軸調控顳葉癲癇的進展。CHEN 等［14］發現：circ_0003170 通過調節miR-421/CCL2 軸在癲癇細胞模型中加重人海馬神經元損傷。研究［10］證實：在癲癇患者腦組織中circ_EFCAB2 mRNA 表達水平明顯升高，提示其具備成為診斷癲癇生物標志物和治療靶點的潛在可能性。然而，circ_EFCAB2 在癲癇發病機制中的作用尚不明確。本研究探討circ_EFCAB2 在體外癲癇細胞模型中的差異表達和亞細胞定位分析，闡明其可能的作用機制，為circ_EFCAB2 參與癲癇發病機制中作用的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人神經母細胞瘤LAN-5 細胞（上海百曄生物科技有限公司）。TRIzol試劑（美國 Sigma 公司），反轉錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司），實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTqPCR）試劑盒（美國 ABI 公司），核質分離試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司），核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）R 核酸外切酶（美國賽默飛公司），CCK-8 檢測試劑盒（上海初態生物科技有限公司），RPMI 1640 細胞培養基和DMEM 培養基（大連美侖生物技術有限公司）。酶聯免疫檢測儀（美國 Bio-Rad 公司），全自動PCR 擴增儀（美國ABI 公司），流式細胞儀和培養箱（美國賽默飛公司），－80 ℃超低溫冰箱（日本三洋公司），電子恒溫水浴箱（上海新苗醫療器械制造公司），微量移液器（德國艾本德科技公司）。

1.2 癲癇細胞模型制備和分組LA-N-5 細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。細胞系保存在必需培養基中，培養基含10%胎牛血清、10%青-鏈霉素。實驗分為對照組和模型組。對照組為LA-N-5 細胞中加入正常細胞外液，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養 3 h，更換為正常培養基繼續培養24 h。模型組即無鎂致癇組：建立體外顳葉癲癇細胞模型，將LA-N-5 細胞在無鎂細胞外液（145 mmol·L－1NaCl、2.5 mmol·L－1KCl、2 mmol·L－1氯化鈣、10 mmol·L－1葡萄糖、10 mmol·L－14-羥乙基哌嗪乙磺酸和0.001 mmol·L－1甘氨酸，pH 7.4）于37 ℃、5%CO2培養箱培養3 h，更換為正常培養基繼續培養24 h。使用電流鉗記錄癲癇細胞模型自發高頻率，癇樣放電頻率高于3 Hz 表明癲癇細胞模型建立成功。

1.3 RT-qPCR 法檢測2 組細胞中circ_EFCAB2 mRNA 表達水平采用 TRIzoI 法提取細胞中總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書操作將其逆轉錄為cDNA，配置PCR 反應體系并設置反應條件，其中反應體系為10 μL，以GAPDH 為內參，所用引物由蘇州金唯智生物科技有限公司設計合成，引物序列見表1。反應條件：95 ℃、10 s；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40 個循環。每組設置5 個復孔，采用2－△△Ct法計算細胞中circ_EFCAB2 mRNA 表達水平。實驗重復 3 次。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4 RNA 酶消化實驗和RT-qPCR 法檢測細胞中circ_EFCAB2 和線性EFCAB2 mRNA 表達水平癲癇細胞模型提取總RNA，52 μL DEPC 水重懸。將細胞分為2 組，一組進行RNase R 消化（RNase R 消化組），另一組作為對照（RNase R 未消化組）。RNase R 消化組加入3 μL 10×RNase R Reaction Buffer，0.1 μL 20 U·μL－1RNase R，未消化組加入3 μ L 10× RNase R Reaction Buffer，0.1 μL DEPC 水，37 ℃、1 h。采用RT-qPCR 法檢測2 組細胞中circ_EFCAB2 和線性EFCAB2 mRNA 表達水平。以GAPDH 為內參，采用 2－ΔΔCt法計算目的基因mRNA 表達水平，實驗重復3 次。

1.5 核質分離實驗檢測癲癇細胞中circ-EFCAB2 mRNA 表達水平癲癇模型細胞，按照核質分離試劑盒說明書操作。分離的RNA 采用RT- qPCR法檢測細胞中circ_EFCAB2 mRNA 表達水平。在細胞質和細胞核中分別以GAPDH 和U6 作為內參，采用 2－ΔΔCt法計算目的基因mRNA 表達水平，實驗重復3 次。

1.6 CCK-8 法檢測2 組細胞增殖能力于96 孔細胞板中接種細胞懸液，每孔100 μL，培養板置于培養箱中預培養2 h 細胞，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，培養箱內孵育4 h。酶標儀測定波長450 nm 處吸光度（A）值，以A 值代表細胞增殖能力。每組設置 5 個復孔，實驗重復3 次。

1.7 流式細胞術檢測2 組細胞凋亡率待測細胞消化離心，PBS 緩沖液洗滌細胞1 次，胰酶消化，重新懸浮于PBS 緩沖液中，預冷的PBS 緩沖液洗滌細胞2 次，加入 Annexin Ⅴ-APC 和 PI 染料，避光染色20 min，采用流式細胞術檢測細胞凋亡情況，采用FlowJo 軟件分析流式細胞術測得的原始數據。細胞凋亡率＝凋亡細胞數/細胞總數×100%。實驗重復3 次。

1.8 流式細胞術檢測2 組不同細胞周期細胞百分率待細胞生長至覆蓋率約為 80%時取待測細胞，消化離心，PBS 緩沖液洗滌細胞1 次，胰酶消化，重新懸浮于PBS 緩沖液中，4 ℃下將細胞固定在70%乙醇中過夜，加入PI 染料，避光染色30 min，流式細胞術檢測，實驗重復3 次。記錄激發波長488 nm 處紅色熒光，采用DNA MultiCycle 軟件進行統計學分析。

1.9 統計學分析采用SPSS 25.0 和 GraphPad Prism 6.0 統計軟件進行統計學分析。各組細胞中circ_EFCAB2 mRNA 和線性EFCAB2 mRNA 表達水平、細胞增殖能力、細胞凋亡率及不同細胞周期細胞百分率均符合正態分布，以±s 表示，組間樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 癲癇細胞模型鑒定全細胞電流鉗記錄方式下顯示：模型組細胞有自發高頻率的癇樣放電，頻率高于3 Hz，對照組細胞僅有少量的偶發動作電位，提示癲癇細胞模型建立成功。

2.2 2 組細胞中circ_EFCAB2 和線性EFCAB2 mRNA 表達水平與對照組（0.99±0.02）比較，模型組細胞中circ_EFCAB2 mRNA 表達水平（1.34±0.03）升高（P＜0.05）。

2.3 RNA 酶處理后2 組細胞中circ_EFCAB2 和線性EFCAB2 mRNA 表達水平與RNase R 未消化組比較，RNase R 消化組細胞中線性EFCAB2 mRNA 表達水平明顯降低（P＜0.01），circ_EFCAB2 mRNA 表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 2 組細胞中circ_EFCAB2 和線性EFCAB2 mRNA 表達水平Tab.2 Expression levels of circ_EFCAB2 and linear EFCAB2 mRNA in cells in two groups (n=3,±s)

表2 2 組細胞中circ_EFCAB2 和線性EFCAB2 mRNA 表達水平Tab.2 Expression levels of circ_EFCAB2 and linear EFCAB2 mRNA in cells in two groups (n=3,±s)

Group RNaseR undigestion RNaseR digestion tP Circ_EFCAB2 mRNA 1.002 7±0.091 9 1.329 3±0.498 0－0.97 0.434 Linear EFCAB2 mRNA 1.000 3±0.039 5 0.001 3±0.000 6 44.32 0.001

2.4 癲癇模型細胞中circ_EFCAB2 mRNA 表達水平癲癇細胞的細胞質中circ_EFCAB2 mRNA 表達水平為（47.13%±2.76%），在細胞核中表達水平為（52.87%±2.76%），組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.5 2 組細胞增殖能力CCK-8 法檢測結果顯示：轉染72 h 時，與對照組比較，模型組細胞增殖能力明顯降低（P＜0.01）。見圖1。

圖1 CCK-8 法檢測2 組細胞增殖能力Fig.1 Proliferation activities of cells in two groups detected by CCK-8 method

2.6 2 組細胞凋亡率與對照組（4.78%±0.64%）比較，模型組細胞凋亡率（21.11%±0.72%）明 顯 升 高 （P＜0.01）。見圖2。

圖2 流式細胞術檢測2 組細胞凋亡率Fig.2 Apoptotic rates of cells in two groups detected by flow cytometry

2.7 2 組不同細胞周期細胞百分率對照組S 期細胞百分率為（50.11%±3.44%），G1+G2期細胞百分率為（49.89%±3.44%）。與對照組比較，模型組S 期細胞百分率（23.20%±1.03%）明顯降低（P＜0.01），G1+G2期細胞百分率（76.80%±1.03%）明顯升高（P＜0.01）。見圖3。

圖3 2 組不同細胞周期細胞百分率Fig.3 Percentages of cells at different cell cycles in two groups

3 討 論

circRNA 在中樞神經系統中表達豐富且較為穩定［15-16］。circRNA 是由多種神經元特異性基因產生的，其可能參與大腦發育和突觸可塑性，circRNA表達異常可能與神經退行性疾病和急性中樞神經系統損傷后的繼發性腦損傷有關。因此，識別circRNA 在中樞神經系統疾病中的表達改變和功能作用，可能提供新的診斷工具和治療靶點。研究［10］顯示：采用高通量測序法檢測癲癇患者，發現442 個circRNA 異常表達，在癲癇患者腦組織中circ_EFCAB2 表達水平較正常人明顯上調。結合本課題組前期研究［17］證實：癲癇患者血清中circ_EFCAB2 表達水平明顯升高，提示circ_EFCAB2 與癲癇的發生發展可能存在相關性。circ_EFCAB2 可能是通過調節miRNA 海綿分子circRNA-miRNA 基因軸來調控癲癇的發生發展，且circ_EFCAB2 通過與miR-485P 相互作用增加氯通道6 的表達水平，其與電興奮性和離子穩態等多種生理過程有關［10］。

綜上所述，癲癇患者血清和癲癇細胞模型中circ_EFCAB2 mRNA 表達水平升高，circ_EFCAB2可能通過觸發神經元損傷，包括細胞周期阻滯、細胞凋亡和細胞增殖等方式促進癲癇的發生發展。這可能為癲癇提供了一種新的診斷標志位和治療靶點。