lncRNA MALAT1 對肝星狀細胞活化的調節作用及其機制

徐菱遙, 魏書堂, 董 勇, 孫正路, 趙俊波, 韓大正

（河南大學第一附屬醫院消化病科，河南 開封 475100）

肝纖維化是一種病理生理過程，由病毒性肝炎、代謝紊亂、酗酒、膽汁淤積和自身免疫性疾病等慢性肝損傷中持續傷口愈合反應所導致，是肝硬化的早期征兆，可導致肝功能衰竭或肝癌［1-2］。肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）被認為是肌成纖維細胞的主要前體，活化的HSC 產生大量的細胞外基質（extracellular matrix，ECM），ECM是肝纖維化的主要驅動力［3］。然而，肝纖維化中HSC 細胞活化的分子機制尚未完全闡明。

長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，lncRNA）可通過脂肪肝和膽汁淤積等多種過程在肝臟疾病中發揮作用［4-5］。肺腺癌轉移相關轉錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）調控相關機制誘導HSC失活，還可通過增加α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和Ⅰ型膠原蛋白 α1（collagen type Ⅰ alpha 1，COL1A1）等肝纖維化標志物表達促進HSC 活化［7-9］。主動脈內皮細胞中MALAT1 可競爭性結合微小RNA （microRNA，miR）-150-5p，MALAT1 是否靶向miR-150-5p 調控HSC 活化尚不清楚［8，10］。本研究通過生物學預測CXC 趨化因子配體14 （CXC chemokine ligand 14，CXCL14）可能是miR-150-5p 的靶標基因，且CXCL14 可明顯改善小鼠體內肝纖維化及抑制由HSC 增殖和釋放的COL1A1［11］。

轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）可激活HSC 并產生大量ECM 參與肝纖維化［12］。因此，本研究采用TGF-β1 誘導HSC 模擬肝纖維化狀態，探討MALAT1 對HSC 活化的調節作用及其機制，旨在為肝纖維化的臨床治療提供新的策略。

1 材料和方法

1.1 研究對象收集2020 年1 月—2021 年7 月于河南大學第一附屬醫院就診的25 例肝纖維化患者（輕度和重度肝纖維化組）和同期招募的25 例健康志愿者（健康組）和的臨床資料。根據基于4因子纖維化指數（fibrosis index based on four factors，FIB-4）評估肝纖維化診斷和分期［13］。將肝纖維化患者分為輕度肝纖維化組（FIB-4＜2，12 例）和重度肝纖維化組（2≤FIB-4＜4，13 例）。健康組研究對象丙氨酸氨基轉移酶和天冬氨酸氨基轉移酶活性正常，無肝病或酗酒史，無乙型肝炎、丙型肝炎或人類免疫缺陷病毒感染。研究方案符合《赫爾辛基宣言》制定標準，并獲得河南大學第一附屬醫院倫理委員會批準。所有參與者均簽署知情同意書，各組患者一般資料見表1。在輕度和重度肝纖維化組和健康組研究對象首次入院期間采集外周血樣本8 mL。由外周血中分離的血清儲存于－80 ℃環境中。

表1 各組研究對象一般資料Tab.1 General informations of subjects in various groups

1.2 細胞、主要試劑和儀器小鼠HSC 購自上海雅吉生物科技有限公司。RPMI-1640 培養基購自上海雅吉生物科技有限公司，1%青-鏈霉素和10%胎牛血清購自北京伊塔生物科技有限公司，人重組TGF-β1 細胞因子（7754-BH-005/CF）購自美國R&D Systems 公司，TRIzol 試劑和二抗Alexa Fluor 488 偶聯山羊抗小鼠IgG 購自美國Invitrogen公司，iScript? cDNA Synthesis 試劑盒購自美國伯樂生命醫學產品有限公司，SYBR Green Real-Time PCR Assay 試劑盒購自日本TAKARA 生物技術有限公司，一抗α-SMA、COL1A1、CXCL14和GAPDH 均購自英國Abcam 貿易有限公司，DAPI 和二抗HRP 標記的山羊抗小鼠IgG 或山羊抗兔IgG 均購自美國Sigma-Aldrich 貿易有限公司，雙熒光素酶檢測試劑盒購自美國GeneCopoeia 公司，CCK-8 Cell Counting Kit 購自南京VAZYME生物科技有限公司。7500 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTqPCR）儀購自美國應用生物系統公司，E-Gel Imager 凝膠成像系統購自美國賽默飛世爾科技公司，SpectraMax iD5 多功能微孔板讀板機購自美谷（上海）分子儀器有限公司，DMi8 倒置熒光顯微鏡購自徠卡顯微系統（上海）貿易有限公司。

1.3 細胞培養HSC 置于含1%青-鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基，37 ℃、5% CO2培養箱中培養。TGF-β1 誘導HSC，37 ℃環境中培養8～12 h，并與10 μg·L－1TGF-β1 共同孵育24 h［13］。

1.4 細胞轉染和分組將TGF-β1 誘導的HSC 以每孔5×105個細胞的密度接種于6 孔細胞培養板中，培養24 h。細胞分為TGF-β1+si-NC 組（轉染si-NC）、TGF- β1+si-MALAT1 組 （轉染 si-MALAT1）、TGF-β1+si-MALAT1+anti-miR-150-5p 組（轉染si-MALAT1 和anti-miR-150-5p）和TGF- β 1+si-MALAT1+CXCL14 組 （轉染si-MALAT1 和 CXCL14），轉染相應siRNA 1 μg si-NC 和si-MALAT1、miR-150-5p 抑制物20 nm anti-miR-150-5p 及重組載體2 μg CXCL14。同時，選擇未經TGF-β1 誘導的HSC 作為對照組，僅經TGF-β1 誘導的HSC 作為TGF-β1 組，培養48 h 后收獲細胞。

1.5 RT-qPCR 法檢測各組研究對象血清和HSC中 MALAT1 mRNA、miR-150-5p 和 CXCL14 mRNA 表達水平采用TRIzol 試劑提取HSC 和外周血樣品中總RNA，采用cDNA 合成試劑盒將總RNA 逆轉錄為cDNA，采用SYBR Green Real-Time PCR 試劑盒進行擴增。引物序列：MALAT1 F 5′-TGTGACGCGACTGGAGTATG-3′，MALAT1 R 5′-CAAAGGGACTCGGCTCCAAT-3′；miR-150-5p F 5′-CATGGCCCTGTCTCCCAAC-3′，miR-150-5p R 5′-GGCCTGTACCAGGGTCTGA-3′；α-SMA F 5′-CACCATCGGGAATGAACGCTTC-3′，α-SMA R 5′-CTGTCAGCAATGCCTGGGTA-3′；COL1A1 F 5′-GGTCATTCTCTTCGCAGACAG-3′，COL1A1 R 5′-CCACCGGATACTTGGTCTCCA-3′；CXCL14 F 5′-CGCTACAGCGACGTGAAGAA-3′，CXCL14 R 5′-GTTCCAGGCGTTGTACCAC-3′；U6 F 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6 R 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH F 5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCA-3′，GAPDH R 5′-GGAAGATGGTGATGGGATTT-3′。反 應 條 件 ：95 ℃、3 min；95 ℃、15 s，57 ℃、15 s，72 ℃、45 s，循環30 次；72 ℃、5 min。采用2－ΔΔCt法計算各組研究對象血清和細胞中MALAT1 mRNA、miR-150-5p 和CXCL14 mRNA 表達水平。

1.6 Western blotting 法檢測各組研究對象血清和HSC 中CXCL14 蛋白表達水平采用RIPA 裂解緩沖液于冰上進行HSC 和研究對象血清裂解以獲取總蛋白，通過SDS-PAGE 分離蛋白并轉移至PVDF 膜上。5%脫脂牛奶封閉膜1 h，4 ℃條件下與α-SMA、COL1A1、CXCL14 和GAPDH 一抗孵育過夜。采用含0.1% Tween-20 PBS 緩沖液洗滌膜3 次，將PVDF 膜和HRP 標記的山羊抗小鼠IgG或山羊抗兔IgG 在室溫下孵育2 h。采用ECL 化學發光試劑顯色。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1.7 CCK-8 法檢測各組HSC 增殖活性將HSC以每孔5×103個細胞的密度接種于96 孔細胞培養板中，37 ℃培養48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，4 h 后采用酶標儀于波長450 nm 處檢測各組HSC 吸光度（A）值。以A 值代表細胞增殖活性。

1.8 免疫熒光法檢測各組HSC 中α-SMA 和COL1A1 蛋白表達量將HSC 以每孔5×105個細胞的密度接種至底部帶有聚D-賴氨酸包被玻璃蓋玻片的12 孔細胞培養板中。4%多聚甲醛固定細胞10 min，PBS 緩沖液洗滌細胞3 次。細胞貼壁后，采用5% BSA 封閉液在室溫下放置1 h。隨后將細胞與靶向α-SMA 或COL1A1 的一抗于37 ℃下孵育30 min，然后將細胞與Alexa Fluor 488 偶聯山羊抗小鼠IgG 二抗于37 ℃下保持30 min。在室溫下進行DAPI 染色15 min，采用0.1% Tween-20 PBS 緩沖液沖洗細胞3 次，每次10 min。在熒光顯微鏡下捕獲圖像。綠色熒光占藍色熒光的比例即表示各組HSC 中α-SMA 或COL1A1 蛋白表達量。

1.9 miR-150-5p 與MALAT1 和CXCL14 3′-UTR基因的靶向關系檢測及HSC 中熒光素酶活性檢測采用http：//starbase.sysu.edu.cn/index.php 網站預測 miR-150-5p 與 MALAT1 和CXCL14 3′-UTR 的潛在結合位點。雙熒光素酶報告基因測定：含有野生型（WT）或突變體（MUT）miR-150-5p 預 測 的 結 合 位 點 中MALAT1 和CXCL14 3′-UTR 片段通過PCR 從基因組DNA 中擴增并克隆至psi-CHECK2 報告載體中，將 MALAT1/CXCL14 WT 或 MALAT1/CXCL14 MUT 報告載體與miR-150-5p 模擬物（miR-150-5p）或陰性對照（miR-NC）共轉染至HSC 中，48 h 后采用雙熒光素酶報告基因分析系統檢測各組HSC 中熒光素酶活性。

1.10 統計學分析采用SPSS 23.0 統計軟件進行統計學分析。各組研究對象血清和各組HSC 中MALAT1 mRNA、miR-150-5p 和CXCL14 mRNA表達水平，各組研究對象血清中CXCL14 蛋白表達水平，各組HSC 中α-SMA 和COL1A1 蛋白表達水平和細胞增殖活性及熒光素酶活性均符合正態分布，以±s 表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組研究對象血清和各組HSC 中MALAT1 mRNA、miR-150-5p 和CXCL14 mRNA 表達水平與健康組比較，輕度和重度肝纖維化組患者血清中MALAT1 mRNA 和CXCL14 mRNA 表達水平升高（P＜0.05），miR-150-5p 表達水平降低（P＜0.05）。與輕度肝纖維化組比較，重度肝纖維化組患者血清中MALAT1 mRNA 和CXCL14 mRNA表達水平升高（P＜0.05），miR-150-5p 表達水平降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組研究對象血清中MALAT1 mRNA、miR-150-5p 和CXCL14 mRNA 表達水平Tab.2 Expression levels of serum MALAT1 mRNA, miR-150-5p, and CXCL14 mRNA of subjects in various groups (±s)

表2 各組研究對象血清中MALAT1 mRNA、miR-150-5p 和CXCL14 mRNA 表達水平Tab.2 Expression levels of serum MALAT1 mRNA, miR-150-5p, and CXCL14 mRNA of subjects in various groups (±s)

*P＜0.05 compared with healthy group；△P＜0.05 compared with mild liver fibrosis group.

Group Healthy Mild liver fibrosis Severe liver fibrosis CXCL14 mRNA 1.04±0.04 1.57±0.09*2.03±0.14*△n 25 12 13 MALAT1 mRNA 1.02±0.04 2.59±0.14*4.18±0.22*△miR-150-5p 1.05±0.04 0.46±0.05*0.32±0.02*△

與對照組比較，TGF-β1 組HSC 中MALAT1 mRNA 和CXCL14 mRNA 表達水平均升高（P＜0.05），miR-150-5p 表達水平降低（P＜0.05）；與TGF-β1+si-NC 組比較，TGF-β1+si-MALAT1 組HSC 中MALAT1 mRNA 和CXCL14 mRNA 表達水平均降低（P＜0.05），miR-150-5p 表達水平升高（P＜0.05）。與TGF-β1+si-MALAT1 組比較，TGF- β1+si-MALAT1+anti-miR-150-5p 組HSC 中MALAT1 mRNA 表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），miR-150-5p 表達水平降低（P＜0.05），CXCL14 mRNA 表達水平升高（P＜0.05）；TGF-β1+si-MALAT1+CXCL14 組HSC中MALAT1 mRNA 和miR-150-5p 表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），CXCL14 mRNA 表達水平升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組HSC 中MALAT1、miR-150-5p 和CXCL14 mRNA 表達水平Tab.3 Expression levels of MALAT1, miR-150-5p and CXCL14 mRNA in HSC in various groups (±s)

表3 各組HSC 中MALAT1、miR-150-5p 和CXCL14 mRNA 表達水平Tab.3 Expression levels of MALAT1, miR-150-5p and CXCL14 mRNA in HSC in various groups (±s)

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with TGF-β1+si-NC group；#P＜0.05 compared with TGF-β1+si-MALAT1 group.

CXCL14 mRNA 1.01±0.05 2.89±0.20*2.61±0.16 1.42±0.11△1.89±0.12#2.05±0.15#Group Control TGF-β1 TGF-β1+si-NC TGF-β1+si-MALAT1 TGF-β1+si-MALAT1+anti-miR-150-5p TGF-β1+si-MALAT1+CXCL14 MALAT1 1.05±0.03 3.77±0.21*3.59±0.17 1.64±0.12△1.56±0.13 1.78±0.15 miR-150-5p 1.02±0.04 0.28±0.03*0.31±0.05 0.75±0.06△0.46±0.04#0.68±0.04

2.2 各組研究對象血清中CXCL14 蛋白表達水平和各組HSC 中CXCL14、α-SMA 及COL1A1 蛋白表達水平與健康組（0.29±0.03）比較，輕度和重度肝纖維化組患者血清中CXCL14 蛋白表達水平（0.56±0.05 和0.67±0.04）升高（P＜0.05）。與輕度肝纖維化組比較，重度肝纖維化組患者血清中CXCL14 蛋白表達水平升高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 Western blotting 法檢測各組研究對象血清中CXCL14 蛋白表達電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of serum CXCL14 protein in subjects in various groups detected by Western blotting method

與對照組比較，TGF-β1 組細胞中CXCL14、α-SMA 和COL1A1 蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與TGF-β1+si-NC組比較，TGF-β1+si-MALAT1組細胞中CXCL14、α-SMA 和COL1A1 蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與TGF-β1+si-MALAT1 組比較，TGF- β1+si-MALAT1+anti-miR-150-5p 組和TGF- β1+si-MALAT1+CXCL14 組細胞中CXCL14、α-SMA 和COL1A1 蛋白表達水平升高（P＜0.05）。見圖2 和表4。

圖2 Western blotting 法檢測各組HSC 中CXCL14、α-SMA 和COL1A1 蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of CXCL14 α-SMA, and COL1A1 proteins in HSC in various groups detected by Western blotting method

表4 各組HSC 中CXCL14、α-SMA 和COL1A1 蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of CXCL14, α-SMA, and COL1A1 proteins in HSC in various groups (±s)

表4 各組HSC 中CXCL14、α-SMA 和COL1A1 蛋白表達水平Tab.4 Expression levels of CXCL14, α-SMA, and COL1A1 proteins in HSC in various groups (±s)

*P＜0.05 compared with control group；△P＜0.05 compared with TGF-β1+si-NC group；#P＜0.05 compared with TGF-β1+si-MALAT1 group.

COL1A1 0.36±0.03 1.03±0.08*0.96±0.07 0.48±0.04△0.66±0.06#0.76±0.05#Group Control TGF-β1 TGF-β1+si-NC TGF-β1+si-MALAT1 TGF-β1+si-MALAT1+anti-miR-150-5p TGF-β1+si-MALAT1+CXCL14 CXCL14 0.31±0.02 0.89±0.06*0.80±0.07 0.44±0.03△0.59±0.04#0.65±0.05#α-SMA 0.28±0.02 0.95±0.07*0.88±0.06 0.50±0.03△0.65±0.05#0.71±0.06#

2.3 各組HSC 增殖活性與對照組（0.38±0.04）比較，TGF-β1 組HSC 增殖活性（0.87±0.06）升高（P＜0.05）。與TGF-β1+si-NC 組（0.82±0.05）比較，TGF- β1+si-MALAT1 組HSC 增殖活性（0.48±0.03）降低（P＜0.05）。與TGF- β 1+si-MALAT1 組比較，TGF- β 1+si-MALAT1+anti-miR-150-5p 組 和 TGF- β1+si-MALAT1+CXCL14 組HSC 增殖活性（0.61±0.05 和0.65±0.06）均升高（P＜0.05）。

2.4 各組HSC 中α-SMA 和COL1A1 蛋白表達量免疫熒光檢測結果顯示：各組HSC 中α-SMA和COL1A1 蛋白表達與Western blotting 法檢測結果一致。與對照組比較，TGF- β 1 組HSC 中α-SMA 和COL1A1 蛋白表達量增加。與TGF-β1+si-NC 組比較，TGF-β 1+si-MALAT1 組HSC 中α-SMA 和COL1A1 蛋白表達量減少。與TGF-β1+si-MALAT1 組比較，TGF- β 1+si-MALAT1+anti-miR-150-5p 組 和 TGF- β 1+si-MALAT1+CXCL14 組HSC 中α-SMA 和COL1A1 蛋白表達量增加。見圖3。

圖3 各組HSC 中α-SMA 和COL1A1 蛋白表達（免疫熒光，×200）Fig.3 Expressions of α-SMA and COL1A1 proteins in HSC in various groups(Immunofluorescence，×200)

2.5 miR-150-5p 與MALAT1 或CXCL14 靶向關系生物信息學預測MALAT1 或CXCL14 3′-UTR與miR-150-5p 存在靶向關系，且經雙熒光素酶報告基因測定，與miR-NC 組比較，與MALAT1 WT 或CXCL14 WT 共轉染的miR-150-5p 組細胞中熒光素酶活性降低（P＜0.05），與MALAT1 MUT 或CXCL14 MUT 共轉染的miR-150-5p 組細胞中熒光素酶活性差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4 和表5。

圖4 miR-150-5p 與MALAT1 或CXCL14 結合位點圖Fig.4 Binding site diagram between miR-150-5p and MALAT1 or CXCL14

表5 雙熒光素酶報告基因檢測miR-150-5p 與MALAT1 或CXCL14 靶向關系Tab.5 Target relationship between miR-150-5p and MALAT1 or CXCL14 detected by dual luciferase reporter gene(±s)

表5 雙熒光素酶報告基因檢測miR-150-5p 與MALAT1 或CXCL14 靶向關系Tab.5 Target relationship between miR-150-5p and MALAT1 or CXCL14 detected by dual luciferase reporter gene(±s)

Group miR-NC miR-150-5p CXCL14 MUT 1.01±0.05 0.97±0.04 MALAT1 WT 1.05±0.02 0.32±0.04*MALAT1 MUT 0.98±0.05 0.94±0.04 CXCL14 WT 1.02±0.04 0.41±0.03*

3 討 論

肝纖維化會增加肝硬化的發病率［2］。研究［3］顯示：通過抑制HSC 活化和減少ECM 沉積或加速ECM 降解是治療肝纖維化的有效手段。研究［4-5］顯示：lncRNA 在肝纖維化的發展中發揮重要作用，lncRNA 可參與多種疾病的發生發展。然而，lncRNA 在肝纖維化中的作用尚未完全闡明。本研究結果顯示：MALAT1 的高表達與肝纖維化有關，MALAT1 敲低抑制TGF-β1 誘導HSC 活化，表現為抑制HSC 細胞增殖活性和α-SMA 和COL1A1 蛋白表達。

JI 等［14］于2003 年在非小細胞肺癌中發現MALAT1，MALAT1 位于人類染色體11q13.1 和小鼠染色體19qA，長度約為8 700 nt。研究［15-16］證實：MALAT1 是各種人類癌癥的腫瘤促進因子，包括胃癌和乳腺癌等。MALAT1 沉默有助于抑制腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡［17］。WANG 等［8］報道：肝纖維化患者血清中MALAT1 mRNA 表達水平較高，與肝纖維化程度呈正相關關系。MALAT1 表達的敲低抑制了HSC 活化［9］。本研究結果顯示：MALAT1 可作為HSC 活化的激動劑，體外MALAT1 的敲低通過抑制細胞增殖逆轉了TGF-β1 干預對HSC 的影響。MALAT1 可能作為競爭性內源RNA （competitive endogenous RNA，ceRNA）參與miR-150-5p 對CXCL14 的調節。

部分lncRNA 可能參與ceRNA 調控回路。MALAT1 在腎纖維化疾病和腦缺血再灌注損傷中負調節miR-145［18-19］。本研究證實了miR-150-5p 與MALAT1 的直接結合能力。miR-150-5p 在各種纖維化疾病中發揮重要作用。研究［20-21］顯示：miR-150-5p 抑制腎纖維化和心臟纖維化。DU 等［22］發現：間充質干細胞中miR-150-5p 通過靶向CXCL1在體內和體外明顯降低纖維化因子水平，并降低HSC 活化水平，進而減輕肝纖維化。此外，CXCL14 參與肝纖維化的發病，可作為肝纖維化的潛在遺傳靶點［23］。CXCL14 沉默可抑制HSC 活化［11］。本研究結果顯示：CXCL14 蛋白表達受MALAT1/miR-150-5p 的調節，抑制miR-150-5p 或過表達CXCL14 可明顯逆轉敲低MALAT1 對HSC增殖和纖維化標志物α-SMA 和COL1A1 蛋白表達的影響，表明敲低MALAT1 可能通過miR-150-5p/CXCL14 軸抑制TGF-β1 誘導HSC 活化。

綜上所述，在肝纖維化患者中CXCL14 表達上調，MALAT1 靶向調節CXCL14，形成MALAT1/miR-150-5p/CXCL14 通路調節TGF-β1 誘導HSC活化。MALAT1 調控HSC 活化的機制可能為肝纖維化的發病機制和可能的靶向治療提供新的依據。