Ghrelin 通過調節(jié)MAPK/ERK 通路對脂肪間充質干細胞神經元分化的影響

楊賀然, 李興江, 胡嘉航, 李彥偉

（1.牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院檢驗科，黑龍江 牡丹江 157000；2.牡丹江醫(yī)學院解剖教研室，黑龍江 牡丹江 157000；3.牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院影像科，黑龍江 牡丹江 157000）

脂肪間充質干細胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）是由脂肪組織中分離出的一種具有多種分化潛能的成體干細胞［1］。誘導ADSCs 向神經元分化對修復周圍神經損傷有重要意義［2］。研究［3］顯示：生長素釋放肽等小分子在神經干細胞向神經元分化過程中起重要作用。Ghrelin 是在胃中產生的促生長激素釋放多肽，具有較強的促進生長激素分泌和釋放作用，可穿越血腦屏障，通過激活下丘腦促生長激素分泌啟動食欲信號的傳導和調節(jié)［4］。研究［5］顯示：Ghrelin 可促進腦室下區(qū)增殖和增加腦嗅球中酪氨酸羥化酶表達以增加多巴胺神經元數量，還可促進腦神經干細胞增殖和增加腦神經干細胞中神經球直徑及酪氨酸羥化酶表達，促進多巴胺能神經元分化。提示Ghrelin 可在下丘腦以外的中樞神經系統(tǒng)和神經元過程中發(fā)揮關鍵作用，高度分化的ADSCs 可在體外培養(yǎng)和誘導下向脂肪細胞及神經元分化［6］。研究［7］顯示：10－9mol·L－1Ghrelin 作用于ADSCs，可促進ADSCs 向脂肪細胞分化，提示Ghrelin 有促進ADSCs 分化作用，但Ghrelin 促進ADSCs 向神經元分化尚未見報道。

絲裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是生物體內重要的信號轉導酶，參與介導細胞生長、發(fā)育、分裂和分化等多種生理過程。MAPK 可激活其亞族-細胞外信號調節(jié) 激 酶 （extracellular signal-regulated kinase，ERK）來調控細胞生存和增殖并介導胞外信號向胞內傳導等［8］。研究［9］顯示：MAPK 及ERK 是啟動胚胎干細胞向神經元、脂肪細胞和成骨細胞定向分化及成熟的關鍵調控因子［9］。研究［10］證實：Ghrelin 可通過調控MAPK 和ERK 通路誘導骨髓來源的間充質干細胞向軟骨分化，提示Ghrelin 有促進干細胞定向分化的作用，這可能與調控MAPK/ERK 促進增殖及分化通路有關。本研究從MAPK/ERK 通路方面，探討Ghrelin 影響ADSCs 向神經元分化的可能機制，為Ghrelin 在干細胞組織修復領域的開發(fā)應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人ADSCs 購自上海雅吉生物科技有限公司。MTT 試劑盒（上海歌凡生物科技有限公司），Ghrelin（南京肽業(yè)生物科技有限公司），MAPK 抑制劑U0126（北京百奧萊博科技有限公司），Ghrelin 受體阻斷劑D-賴氨酰3 生長激素釋放肽6（D-Lys3-growth hormone releasing peptide-6，D-Lys3-GHRP-6）（北京孚博生物科技有限公司），MAPK、磷酸化MAPK（phosphorylated MAPK，p-MAPK）、ERK、磷 酸 化 ERK（phosphorylated ERK，p-ERK）、神經元特異性核蛋白（neuronal-specific nuclear protein，NeuN），微管蛋白（tubulin，Tuj-1）、神經絲蛋白（neurofilament protein，NF）、生長激素促分泌受體（growth hormone secretagogue receptor，GHSR）和神經元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）抗體（美國Abcam 公司），NF-200（上海齊康生物科技有限公司），胎肝激酶1（fetal liver kinase 1，F(xiàn)lk1）購自美國Santa Cruz 公司。倒置顯微鏡和熒光顯微鏡均購自廣州市明美光電技術有限公司，電轉膜儀購于南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、分組和處理ADSCs 于37 ℃水浴復蘇后，置于含10%胎牛血清的DMEM （高糖）培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細胞生長至80%～90%融合時開始傳代。取第3 代ADSCs 細胞，以2×106mL－1的密度接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，并設置為空白組、神經分化誘導劑組、Ghrelin 組（給予600 μg·L－1Ghrelin）、U0126 組（給予40 ng·L－1U0126）、Ghrelin+U0126 組（給予600 μ g·L－1Ghrelin+40 ng·L－1U0126）和D-Lys3-GHRP-6 （給予10－10g·L－1D-Lys3-GHRP-6）組，每組6 個復孔。空白組正常培養(yǎng)；神經分化誘導劑組參照文獻［11］采用含終濃度為40 μg·L－1堿性成纖維細胞生長因子的DF12 神經誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)12 d；Ghrelin組和U0126 組參照文獻［10］分別在神經分化誘導劑組基礎上向培養(yǎng)基中加入終濃度為600 μg·L－1Ghrelin 和40 ng·L－1U0126 干預培養(yǎng)；Ghrelin+U0126 組在神經分化誘導劑組基礎上向培養(yǎng)基中加入Ghrelin，并加入U0126 干預培養(yǎng)；D-Lys3-GHRP-6組在神經分化誘導劑組基礎上參照文獻［12］操作向培養(yǎng)基中加入終濃度為10－10g·L－1D-Lys3-GHRP-6培養(yǎng)，各組干預培養(yǎng)12 d 后進行后續(xù)試驗。

1.3 倒置顯微鏡觀察各組ADSCs 病理形態(tài)表現(xiàn)取處理后的各組ADSCs，采用4%多聚甲醛固定，于倒置顯微鏡下觀察各組ADSCs病理形態(tài)表現(xiàn)。

1.4 免疫熒光法檢測各組細胞中NF-200 和Tuj-1陽性表達率取處理后的各組細胞，棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液清洗，采用4%多聚甲醛固定后，分別加入Tuj-1 和NF-200 一抗（1∶200）孵育過夜，次日滴加lexa-Flour488 標記的羊抗兔IgG 室溫孵育3 h 后，滴加抗熒光淬滅封片液，然后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照，Image-Pro Plus 6.0 軟件檢測各視野下NF-200 和Tuj-1 陽性表達率。陽性表達率=Flour488 染色細胞數/4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI）染色細胞數×100%。

1.5 Western blotting 法檢測各組細胞中MAPK/ERK 通路蛋白和細胞分化標志蛋白表達水平取處理后的各組細胞，棄去培養(yǎng)基，加入細胞裂解液勻漿后，取勻漿液提取蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，取50 μg 蛋白，加入2 倍體積的電泳加樣緩沖液，采用電轉膜儀進行轉膜反應，5%脫脂奶粉封閉及洗膜后，分別滴加1∶2 000 一抗（MAPK、p-MAPK、ERK、p-ERK、NSE、NeuN、Tuj-1、NF、GHSR、Flk1和CD29）抗體及1∶1 500 β-actin內參抗體，4 ℃孵育過夜，洗膜3次后，滴加羊抗兔辣根過氧化物酶二抗（1∶2 000）室溫孵育120 min，洗膜后，滴加化學發(fā)光液顯色，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組細胞中NF-200 和Tuj-1 陽性表達率，NSE、NeuN、Tuj-1、NF、GHSR、Flk1 和CD29蛋白表達水平及p-MAPK/MAPK 和p-ERK/ERK 比值均符合正態(tài)分布，以xˉ±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，樣本均數組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組ADSCs 病理形態(tài)表現(xiàn)細胞培養(yǎng)第10 天，空白組ADSCs 呈長梭形和螺旋狀融合；神經分化誘導劑組細胞胞體收縮，長梭形胞體向類圓形轉變，突起長度延長及類似神經元樣細胞數增多。Ghrelin 組細胞胞體突起進一步增多，類圓形細胞數目進一步增多。U0126 組和D-Lys3-GHRP-6 組僅有少量細胞胞體收縮及類圓形轉變。與Ghrelin 組比較，Ghrelin+U0126 組細胞胞體收縮及類圓形轉變減少。見圖1。

圖1 各組ADSCs 病理形態(tài)表現(xiàn)（Bar=50 μm）Fig.1 Pathomorphology of ADSCs in various groups (Bar=50 μm)

2.2 各組ADSCs 中NF-200 和Tuj-1 陽性表達率綠色表示NF-200 和Tuj-1 陽性表達。與空白組比較，神經分化誘導劑組細胞中NF-200 和Tuj-1陽性表達率升高（P＜0.05）。與神經分化誘導劑組比較，Ghrelin 組細胞中NF-200 和Tuj-1陽性表達率升高（P＜0.05），U0126 組和D-Lys3-GHRP-6 組細胞中NF-200 及Tuj-1 陽性表達率降低（P＜0.05）。與Ghrelin 組比較，U0126 組、D-Lys3-GHRP-6 組和Ghrelin+U0126 組細胞中NF-200 和Tuj-1 陽性表達率降低（P＜0.05）。見圖2 和表1。

表1 各組ADSCs 中NF-200 和Tuj-1 陽性表達率Tab.1 Positive expression rates of NF-200 and Tuj-1 in ADSCs in various groups (n=6，±s，η/%)

表1 各組ADSCs 中NF-200 和Tuj-1 陽性表達率Tab.1 Positive expression rates of NF-200 and Tuj-1 in ADSCs in various groups (n=6，±s，η/%)

*P＜0.05 vs blank group；△P＜0.05 vs neural differentiation inducer group；#P＜0.05 vs Ghrelin group.

Group Blank Neural differentiation inducer Ghrelin U0126 D-Lys3-GHRP-6 Ghrelin+U0126 NF-200 0.61±0.06 4.43±0.26*Tuj-1 0.41±0.04 3.92±0.28*9.73±0.42△1.71±0.10△#1.92±0.16△#4.06±0.88#8.46±0.40△2.06±0.14△#2.07±0.16△#4.69±0.32#

圖2 各組ADSCs 中NF-200 和Tuj-1 表達（免疫熒光，Bar=50 μm）Fig.2 Expressions of NF-200 and Tuj-1 in ADSCs in various groups（Immunofluorescence,Bar=50 μm）

2.3 各組ADSCs 中NSE、NeuN、Tuj-1 和NF 蛋白表達水平與空白組比較，神經分化誘導劑組細胞中NSE、NeuN、Tuj-1 和NF 蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與神經分化誘導劑組比較，Ghrelin 組細胞中NSE、NeuN、Tuj-1 和NF 蛋白表達水平升高（P＜0.05），U0126 組和D-Lys3-GHRP-6 組細胞中NSE、NeuN、Tuj-1 及NF 蛋白表達水平降低（P＜0.05）。與Ghrelin 組比較，U0126 組、D-Lys3-GHRP-6 組和Ghrelin+U0126 組細胞中NSE、NeuN、Tuj-1 及NF 蛋白表達水平降低（P＜0.05）。見圖3 和表2。

表2 各組ADSCs 中NSE、NeuN、Tuj-1 和NF 蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of NSE, NeuN, Tuj-1, and NF proteins in ADSCs in various groups （n=6，±s）

表2 各組ADSCs 中NSE、NeuN、Tuj-1 和NF 蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of NSE, NeuN, Tuj-1, and NF proteins in ADSCs in various groups （n=6，±s）

*P＜0.05 vs blank group；△P＜0.05 vs neural differentiation inducer group；#P＜0.05 vs Ghrelin group.

Group Blank Neural differentiation inducer Ghrelin U0126 D-Lys3-GHRP-6 Ghrelin+U0126 NF 1.17±0.09 1.83±0.18*2.55±0.20△1.30±0.13△#1.31±0.14△#1.81±0.18#NSE 1.11±0.08 1.42±0.14*2.33±0.22△1.30±0.10△#1.29±0.12△#1.66±0.14#NeuN 1.07±0.08 1.77±0.17*2.44±0.21△1.24±0.14△#1.22±0.14△#1.79±0.15#Tuj-1 1.07±0.09 1.56±0.15*2.68±0.20△1.29±0.10△#1.26±0.11△#1.57±0.15#

圖3 各組ADSCs 中NSE、NeuN、Tuj-1 和NF 蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of NSE,NeuN, Tuj-1, and NF proteins in ADSCs in various groups

2.4 各組ADSCs 中GHSR、Flk1 和CD29 蛋白表達水平與空白組比較，神經分化誘導劑組細胞中GHSR 蛋白表達水平升高（P＜0.05），F(xiàn)lk1 和CD29 蛋白表達水平降低（P＜0.05）。與神經分化誘導劑組比較，Ghrelin 組細胞中GHSR 蛋白表達水平升高（P＜0.05），F(xiàn)lk1 和CD29 蛋白表達水平降低（P＜0.05），U0126 組和D-Lys3-GHRP-6 組細胞中GHSR 蛋白表達水平降低（P＜0.05），F(xiàn)lk1 和CD29 蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與Ghrelin 組比較，U0126 組、D-Lys3-GHRP-6 組和Ghrelin+U0126 組細胞中GHSR 蛋白表達水平降低（P＜0.05），F(xiàn)lk1 和CD29 蛋白表達水平升高（P＜0.05）。見圖4 和表3。

表3 各組ADSCs 細胞中GHSR、Flk1 和CD29 蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of GHSR, Flk1，and CD29 proteins in ADSCs in various groups（n=6，±s）

表3 各組ADSCs 細胞中GHSR、Flk1 和CD29 蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of GHSR, Flk1，and CD29 proteins in ADSCs in various groups（n=6，±s）

*P＜0.05 vs blank group；△P＜0.05 vs neural differentiation inducer group；#P＜0.05 vs Ghrelin group.

Group Blank Neural differentiation inducer Ghrelin U0126 D-Lys3-GHRP-6 Ghrelin+U0126 CD29 1.18±0.07 0.50±0.04*0.12±0.01△0.99±0.09△#0.91±0.08△#0.49±0.04#GHSR 1.00±0.09 1.74±0.17*2.56±0.20△1.29±0.11△#1.28±0.13△#1.76±0.17#Flk1 1.04±0.08 0.55±0.14*0.17±0.01△0.97±0.09△#0.92±0.09△#0.51±0.05#

圖4 各組ADSCs中GHSR、Flk1和CD29蛋白表達電泳圖Fig.4 Electrophoregram of expressions of GHSR,Flk1,and CD29 proteins in ADSCs in various groups

2.5 各組ADSCs 中MAPK/ERK 通路蛋白表達水平與空白組比較，神經分化誘導劑組細胞中p-MAPK/MAPK 和p-ERK/ERK 比值升高（P＜0.05）。與神經分化誘導劑組比較，Ghrelin 組細胞中p-MAPK/MAPK 和p-ERK/ERK 比值升高（P＜0.05），U0126 組及 D-Lys3-GHRP-6 組細胞中p-MAPK/MAPK 和p-ERK/ERK 比值降低（P＜0.05）。與Ghrelin 組比較，U0126 組、D-Lys3-GHRP-6 組和Ghrelin+U0126 組細胞中p-MAPK/MAPK 和p-ERK/ERK 比值降低 （P＜0.05）。見圖5 和表4。

表4 各組ADSCs 中p-MAPK/MAPK 和p-ERK/ERK 比值Tab.4 Ratios of p-MAPK/MAPK and p-ERK/ERK in ADSCs in various groups（n=6，±s）

表4 各組ADSCs 中p-MAPK/MAPK 和p-ERK/ERK 比值Tab.4 Ratios of p-MAPK/MAPK and p-ERK/ERK in ADSCs in various groups（n=6，±s）

*P＜0.05 vs blank group；△P＜0.05 vs neural differentiation inducer group；#P＜0.05 vs Ghrelin group.

Group p-ERK/ERK p-MAPK/MAPK 1.00±0.09 1.84±0.18*2.66±0.22△1.21±0.10△#1.26±0.12△#1.80±0.18#1.04±0.08 1.65±0.16*2.47±0.25△1.37±0.13△#1.32±0.13△#1.69±0.15#Blank Neural differentiation inducer Ghrelin U0126 D-Lys3-GHRP-6 Ghrelin+U0126

圖5 各組ADSCs中MAPK、p-MAPK、ERK 和p-ERK蛋白表達電泳圖Fig.5 Electrophoregram of expressions of MAPK,p-MAPK, ERK and p-ERK proteins in ADSCs in various groups

3 討 論

ADSCs 和骨髓間充質干細胞均存在干細胞分化潛能，具有多向分化能力且增殖速度快，在組織工程研究中具有重要作用。在周圍神經系統(tǒng)損傷后，ADSCs 有促神經修復及再生潛能，可進行跨胚層分化，分化為星形膠質細胞或神經細胞，加速神經發(fā)育［13］。ADSCs 誘導神經元分化具有操作簡單和無不良反應等特點，被認為在治療神經系統(tǒng)疾病方面有較大的潛力，尋找促進ADSCs 向神經元分化的有效藥物，對于提高干細胞移植和神經修復有重要意義。

Ghrelin 是GHSR 的內源性配體，在神經干細胞分化和神經修復方面發(fā)揮重要作用［14］。研究［15］顯示：GHSR 可在體內神經干細胞膜上表達，GHSR 途徑活化可誘導胚胎脊髓神經元前體細胞生長，提示作為GHSR 內源性配體的Ghrelin 也可能發(fā)揮促神經調控作用。HAN 等［16］采用Ghrelin 外源性干預，可使GHSR 基因敲除小鼠嗅球部分多巴胺能神經元數增加，且Ghrelin 基因敲除小鼠腦室室管膜下區(qū)和海馬齒狀回神經祖細胞的再生及增殖明顯減少，外源性給予Ghrelin 可明顯增加神經細胞數，提示Ghrelin 可作為神經再生調節(jié)因子，影響神經元分化。研究［17］顯示：Ghrelin 可促進骨髓間充質干細胞向成骨和成脂分化，ADSCs 較骨髓間充質干細胞更易獲得，但Ghrelin 促進ADSCs向神經元分化的研究尚未見報道。NF-200 和Tuj-1是與細胞骨架有關的蛋白，分別在成熟或未成熟神經元中表達。此外，NSE 和NeuN 也在成熟神經元中表達，這些蛋白均可作為神經元分化標志物。本研究結果顯示：神經分化誘導劑誘導ADSCs 向神經元分化過程中，加入Ghrelin 后，ADSCs 向神經元分化增強，提示Ghrelin 可作為神經分化誘導劑的輔助藥物而促進ADSCs 向神經元分化。

MAPK/ERK 通路是參與細胞分化的重要通路之一。研究［18］證實：MAPK 是將胞外信號傳入胞內并啟動胞內信號增殖和分化及轉錄的重要調節(jié)因子，胞外信號在激活酪氨酸激酶后，MAPK 可迅速感應胞外刺激信號，并迅速磷酸化同時刺激下游胞內調節(jié)因子ERK 活化。ERK 活化不僅可磷酸化胞內底物使微管相關蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP2）和突觸蛋白（synapticprotein，tau）等蛋白表達促進神經突觸再生，還可與糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）形成交叉串擾作用而促進Wnt 活化，發(fā)揮促分化作用［19］。WANG 等［20］發(fā)現(xiàn)MAPK/ERK 通路的活化可促進骨髓間充質干細胞向神經元分化。本研究結果顯示：神經誘導培養(yǎng)基誘導ADSCs 向神經元分化過程中，MAPK/ERK 通路被激活，采用ERK 阻斷劑U0126 阻斷MAPK/ERK 通路活化后，ADSCs向神經元分化明顯緩滯，提示MAPK/ERK通路活化參與ADSCs向神經元分化的調節(jié)。研究［10］顯示：Ghrelin 的配體GHSR 可通過促進MAPK/ERK通路活化，促進骨髓間充質干細胞向神經元分化。本研究結果顯示：采用Ghrelin 受體阻斷劑D-Lys3-GHRP-6 阻斷GHSR 表達后，ADSCs 中MAPK/ERK 通路被抑制，ADSCs 向神經元分化作用明顯減弱，提示Ghrelin 可促進MAPK/ERK 活化和ADSCs 向神經元分化。MAPK 抑制劑U0126 可明顯減弱Ghrelin 的促MAPK/ERK 活化及促ADSCs向神經元分化作用，提示Ghrelin促進ADSCs向神經元分化的作用可能與激活MAPK/ERK通路有關。

綜上所述，Ghrelin 可通過激活MAPK/ERK 通路，促進ADSCs 向神經元分化。這可能為Ghrelin在干細胞組織修復工程領域的研究提供參考。