槐耳清膏對(duì)乳腺癌他莫昔芬耐藥細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制

薛姣姣, 郝 磊, 張毓秀, 代賀陽, 張麗霞, 郭少偉, 張晶晶, 李 陽, 李慶霞

（1.河北省人民醫(yī)院腫瘤四科，河北 石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)研究生院，河北 石家莊 050000；3.南方醫(yī)科大學(xué)第七附屬醫(yī)院腫瘤防治科，廣東 佛山 528200；4.華北理工大學(xué)研究生院，河北 唐山063000；5.河北省人民醫(yī)院保健處，河北 石家莊 050000）

目前乳腺癌已成為全球發(fā)病率排名第一位的癌癥和全球第五大死亡原因［1］。乳腺癌中雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性患者約占70%，雌激素與ER 結(jié)合后使其活化，在乳腺癌擴(kuò)增基因1（amplified in breast cancer 1，AIB1）等共激活因子的輔助下啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄［2-3］。他莫昔芬（tamoxifen，TAM）是ER 陽性乳腺癌患者使用最多的抗雌激素藥物，其通過競(jìng)爭(zhēng)性干擾雌激素與ER 結(jié)合，而阻斷雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）的信號(hào)傳導(dǎo)［4］。臨床上接受TAM 治療的乳腺癌患者約有30%會(huì)出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥，從而導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［5］。AIB1 擴(kuò)增代表腫瘤分級(jí)較高、預(yù)后較差和TAM 耐藥［6］。survivin 在多種腫瘤組織中高表達(dá)，研究［7］發(fā)現(xiàn)：survivin 與乳腺癌內(nèi)分泌耐藥有關(guān)。通過調(diào)控ERα、AIB1 和survivin 蛋白可調(diào)節(jié)乳腺癌TAM 耐藥LCC2 細(xì)胞的增殖、凋亡及其對(duì)TAM 的耐藥性，可能對(duì)乳腺癌TAM 耐藥患者的治療提供一定的參考價(jià)值。

槐耳是常用的中藥材，槐耳清膏（Huaier aqueous extract，HAE）是槐耳的水溶性提取物，其主要組分是蛋白多糖，因其療效好和安全性高等特點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤的治療［8-9］。研究［10］報(bào)道：在ER 陽性乳腺癌中，HAE 可通過失活hedgehog 通路干擾ERα 信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制乳腺癌干細(xì)胞的自我更新活性。然而關(guān)于HAE 在乳腺癌TAM 耐藥方面的研究較少。本研究以MCF-7和LCC2 細(xì)胞為研究對(duì)象，探討HAE 調(diào)控ERα、AIB1 及survivin 蛋白對(duì)LCC2 細(xì)胞增殖、遷移和凋亡等功能的影響，為槐耳未來應(yīng)用于乳腺癌TAM耐藥的輔助治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器人乳腺癌TAM 敏感MCF-7 細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所饋贈(zèng)，人乳腺癌TAM 耐藥LCC2 細(xì)胞由美國托馬斯杰斐遜大學(xué)腫瘤生物學(xué)研究所饋贈(zèng)。HAE 購自江蘇啟東蓋天力藥業(yè)有限公司，將精確稱量的HAE 用DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配成20 g·L－1母液，采用孔徑為0.22 μm 的濾器過濾除菌后置于4 ℃冰箱保存供1 周內(nèi)使用［11］；TAM 購自美國Med Chem Express公司，Transwell 小室購自美國 Corning 公司，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自杭州聯(lián)科生物科技有限公司，MTT 和二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司，ECL 發(fā)光液購自上海Biosharp 有限公司，β-actin、ERα、AIB1 和survivin 多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter 公司，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購自芬蘭Labsystems 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組LCC2 細(xì)胞和MCF-7 細(xì)胞經(jīng)37 ℃水浴復(fù)蘇后，采用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM 高糖培養(yǎng)基重懸，并在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組（給予DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基）、TAM 組（給予2 μmol·L－1TAM）、TAM+HAE組（給予2 μmol·L－1TAM+4 g·L－1HAE）和0、2、4、8 及16 g·L－1HAE 組。

1.3 MTT 法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率消化細(xì)胞后，以每孔4×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后加入不同濃度HAE（0、2、4、8 和16 g·L－1）工作液200 μL，每組至少3 個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24 和48 h 后棄去藥液，每孔加入20 μL、0.5% MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），搖床震蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞于波長(zhǎng)490 nm 處吸光度（A）值，計(jì)算各組細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=［（實(shí)驗(yàn)組A值－空白組A 值）/（對(duì)照組A 值－空白組A 值）］×100%。

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移率消化收集細(xì)胞，采用含2.5% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基混勻后接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24 h 后采用200 μL 槍頭垂直劃線，加入0 和4 g·L－1HAE 工作液，并于0、24 和48 h 觀察拍照。采用Image J 軟件的Fiji 模塊分析圖像，測(cè)定各組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的遷移面積，并計(jì)算各組細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=［（遷移前面積－遷移后面積）/（遷移前面積）］×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率將LCC2 細(xì)胞以適當(dāng)濃度接種于6 cm 培養(yǎng)皿中，24 h 完全貼壁后加入0 和4 g·L－1HAE。培養(yǎng)48 h 后胰酶消化、1 500 r·min－1，離心5 min，收集細(xì)胞，預(yù)冷乙醇固定，染色30 min 后可上機(jī)檢測(cè)。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中DNA 含量判定各組在G0/G1期、S 期和G2/M 期細(xì)胞百分率。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率將LCC2細(xì)胞以適當(dāng)濃度接種于培養(yǎng)瓶，貼壁后加入0和4 g·L－1HAE，培養(yǎng)48 h 后用無水乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraaceticacid，EDTA）的胰酶消化、離心，收集細(xì)胞于1×Binding Buffer 中，Annexin Ⅴ-FITC/PI 染色，暗室孵育5 min 后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，并計(jì)算各組細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=（早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期凋亡細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.7 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組遷移細(xì)胞數(shù)接種細(xì)胞于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，采用含10%FBS 的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后更換為無血清藥物工作液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后棄去藥液，胰酶消化細(xì)胞，離心，空白培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)，Transwell 小室上室加入150 μL 2×104個(gè)細(xì)胞懸液，下室加入700 μL 含20%血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。經(jīng)甲醇固定、0.1%結(jié)晶紫染色和PBS 緩沖液洗滌后置于倒置顯微鏡下觀察并拍照，采用Image J 軟件自動(dòng)計(jì)數(shù)功能計(jì)算各組遷移細(xì)胞數(shù)。

1.8 Western blotting 法檢測(cè)各組細(xì)胞中ERα、AIB1 和survivin 蛋白表達(dá)水平收集培養(yǎng)好的細(xì)胞，RIPA 裂解含1% PMSF 和1% 蛋白磷酸酶抑制劑緩沖液裂解蛋白，采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，煮沸后取30 μg 蛋白上樣量進(jìn)行SDS-PAGE 電泳轉(zhuǎn)膜，再用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。孵育一抗：β-actin （1∶2 000）、ERα （1∶1 000）、AIB1 和survivin（1∶500）4 ℃過夜，1×TBST 溶液洗滌3 次，二抗（1∶5 000）孵育1 h，ECL 試劑發(fā)光顯影并拍照。采用Image J 軟件分析各組細(xì)胞蛋白條帶灰度值，以β-actin 和GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞存活率、細(xì)胞遷移率、不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率、細(xì)胞凋亡率、遷移細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞中ERα、AIBI 和survivin 蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組乳腺癌LCC2 細(xì)胞存活率作用24 h 時(shí)，與0 g·L－1HAE 組比較，4、8 和16 g·L－1HAE 組細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.01）；與4 g·L－1HAE組比較，8 g·L－1HAE 組細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。作用48 h 時(shí)，與0 g·L－1HAE 組比較，2、4、8 和16 g·L－1HAE組細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.01）；與4 g·L－1HAE組比較，8 g·L－1HAE 組細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）。與作用24 h 時(shí)比較，作用48 h 時(shí)，2、4、8 和16 g·L－1HAE 組細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.01）。HAE 作用48 h 的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）為7.13 g·L－1。HAE 呈時(shí)間和劑量依賴性抑制乳腺癌LCC2 細(xì)胞生長(zhǎng)，選擇4 g·L－1HAE 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。作用48 h時(shí)，與對(duì)照組（100%±0.0%）比較，TAM 組細(xì)胞存活率（102.00%±1.41%）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與TAM 組（102.00%±1.41%）和4 g·L－1HAE 組（76.00%±1.83%）比較，TAM+HAE 組細(xì)胞存活率 （69.50%±2.65%）明顯降低（P＜0.01）。

2.2 各組細(xì)胞遷移率作用24 h 時(shí)，與0 g·L－1HAE 組（18.36%±2.95%）比較，4 g·L－1HAE 組細(xì)胞遷移率（14.44%±2.48%）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。作用48 h 時(shí)，與0 g·L－1HAE 組（25.99%±4.05%）比較，4 g·L－1HAE 組細(xì)胞遷移 率 （16.21%±3.14%）降 低 （P＜0.05）。見圖2。

圖2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)2 組LCC2 細(xì)胞遷移情況Fig.2 Migration of LCC2 cells in two groups detected by cell scratch assay

2.3 各組不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率作用48 h 時(shí)，與0 g·L－1HAE組（14.40%±1.53%）比較，4 g·L－1HAE 組S 期細(xì)胞百分率（29.30%±4.60%）明顯升高（P＜0.01）。見圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)2 組不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率Fig.3 Percentages of LCC2 cells at different cell cycles in two groups detected by flow cytometry

2.4 各組乳腺癌LCC2 細(xì)胞凋亡率作用48 h 時(shí)，與0 g·L－1HAE 組（17.70%±7.15%）比較，4 g·L－1HAE 組（37.63%±5.39%）細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）。見圖4。

圖4 2 組LCC2 細(xì)胞凋亡率Fig.4 Apoptotic rates of LCC2 cells in two groups

2.5 各組乳腺癌LCC2 細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)作用48 h 時(shí)，與對(duì)照組（95.00 個(gè)±21.58 個(gè)）比較，TAM 組遷移細(xì)胞數(shù)（90.22 個(gè)±15.06 個(gè)）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與TAM 組（90.22 個(gè)±15.06 個(gè)）和4 g·L－1HAE 組（59.78 個(gè)±5.09 個(gè)）比較，TAM+HAE 組遷移細(xì)胞數(shù)（37.44 個(gè)±7.31 個(gè)）明顯減少（P＜0.01）。見圖5。

圖5 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組LCC2細(xì)胞的遷移情況（Bar=200 μm）Fig.5 Migration of LCC2 cells in various groups detected by Transwell chamber assay（Bar=200 μm）

2.6 各組乳腺癌MCF-7 和LCC2 細(xì)胞中ERα、AIB1 和survivin 蛋白表達(dá)水平與MCF-7 細(xì)胞比較，LCC2 細(xì)胞中ERα、AIB1 和survivin 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）。作用48 h時(shí)，與0 g·L－1HAE 比較，2、4、8 和16 g·L－1HAE 組MCF7 和LCC2 細(xì)胞中ERα、AIB1 及survivin 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。見圖6 和7。

圖6 MCF-7 和LCC2 細(xì)胞中ERα、AIB1 和survivin 蛋白表達(dá)電泳圖（A,C)和直條圖（B,D)Fig.6 Electrophoregrams(A,C) and histograms(B,D) of expressions of ERα, AIB1, and survivin proteins in MCF-7 and LCC2 cells

圖7 不同濃度HAE 組LCC2 細(xì)胞中ERα、AIB1 和survivin 蛋白表達(dá)電泳圖（A,C)和直條圖（B,D)Fig.7 Electrophoregrams(A,C) and histograms(B,D) of expressions of ERα, AIB1 and survivin proteins in LCC2 cells in different concentrations of HAE groups

3 討 論

TAM 耐藥是乳腺癌患者內(nèi)分泌治療長(zhǎng)期生存獲益的主要障礙，目前芳香化酶抑制劑、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抑制劑、CDK4/6 抑制劑和HDAC 抑制劑等新藥的出現(xiàn)改善了乳腺癌內(nèi)分泌耐藥患者的預(yù)后，但其較高的費(fèi)用及不良反應(yīng)，已嚴(yán)重影響了患者的依從性和治療效果。而中藥因其多途徑、多通路和多靶點(diǎn)的作用優(yōu)勢(shì)及特色在抗腫瘤治療中的作用日益顯著［12］。

HAE 在肝癌、肺癌、胃癌和乳腺癌等多種腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用［11］，但關(guān)于其在乳腺癌TAM耐藥中作用的研究較少。研究［13-14］證實(shí)：腫瘤細(xì)胞具有激活增殖、無限復(fù)制、侵襲轉(zhuǎn)移和逃避凋亡等特征。抗腫瘤藥物誘發(fā)腫瘤細(xì)胞死亡大多是通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)其凋亡和阻滯周期而實(shí)現(xiàn)［15-16］。本研究結(jié)果顯示：HAE 對(duì)LCC2 細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)和遷移抑制作用，并可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用。低劑量TAM 對(duì)LCC2 細(xì)胞的增殖和遷移無抑制作用，而HAE 與低劑量TAM 聯(lián)合作用后，LCC2 細(xì)胞增殖活性和遷移能力受到更好的抑制，且該抑制作用較HAE和TAM 單藥更明顯。提示HAE 與TAM 有協(xié)同作用，HAE 作用后，LCC2 細(xì)胞中某些TAM 耐藥通路或分子發(fā)生改變，在一定程度上增加了耐藥細(xì)胞對(duì)TAM 的敏感性。

ERα 是位于細(xì)胞核中的ER，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能，ERα 在乳腺癌組織中顯著高表達(dá)，約占70%，而在正常乳腺上皮組織中表達(dá)不足10%［17-18］。研究［19］顯示：ERα 可通過表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）/人表皮生長(zhǎng)因子受體2 （human epidermal growth factor receptor 2，HER2）信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，同時(shí)ERα 構(gòu)象改變可導(dǎo)致不依賴激素的腫瘤細(xì)胞增殖和內(nèi)分泌耐藥。ERα 還可通過激活膜起始的信號(hào)通路如絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated，ERK）和磷脂酰肌醇3（phospoinositide 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）等通路，促進(jìn)TAM 的激動(dòng)劑作用［20］。AIB1 是核受體共激活劑SRC 家族的成員，在乳腺癌中AIB1 和ER 相互作用促進(jìn)雌激素依賴性基因轉(zhuǎn)錄［21］。研究［22］表明：高水平AIB1 可能通過增強(qiáng)藥物的雌激素激動(dòng)劑活性導(dǎo)致TAM 耐藥性。survivin 是在多種惡性腫瘤中過表達(dá)的凋亡基因，主要起調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和抑制凋亡細(xì)胞死亡的作用［23］。研究［24］顯示：TAM 促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用是通過抑制survivin 基因表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。表明ERα、AIB1 和survivin 蛋白的高表達(dá)可介導(dǎo)TAM 耐藥，這與本研究結(jié)果一致。同時(shí)本研究結(jié)果顯示：不同濃度HAE 對(duì)LCC2 細(xì)胞中ERα、AIB1 和survivin 蛋白表達(dá)產(chǎn)生明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性。表明ERα、AIB1 和survivin 蛋白表達(dá)下調(diào)可能是介導(dǎo)HAE 對(duì)LCC2 細(xì)胞生物學(xué)行為改變和改善TAM 耐藥作用的機(jī)制。

綜上所述，HAE 可抑制LCC2 細(xì)胞增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡和細(xì)胞周期阻滯，改善細(xì)胞對(duì)TAM 的耐藥性，其機(jī)制可能是通過下調(diào)ERα、AIB1 和survivin 等蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。本研究為HAE 改善乳腺癌患者TAM 耐藥提供了新的依據(jù)，對(duì)于采用HAE 作為乳腺癌內(nèi)分泌耐藥患者的補(bǔ)充治療具有一定的臨床參考價(jià)值。