lncRNA HAND2-AS1 通過調節miR-21 表達對子宮內膜異位癥患者子宮內膜基質細胞遷移和侵襲的抑制作用

苗 卉, 苗聰秀, 李 娜, 韓 晶

（長治醫學院附屬和平醫院生殖遺傳科 長治醫學院生殖與遺傳研究所 長治醫學院生殖與遺傳重點實驗室 山西省衛健委生殖工程重點實驗室，山西 長治046000）

子宮內膜異位癥（endometriosis，EMT）是指子宮腔外存在子宮內膜組織（包括腺體和間質）的活躍生長［1］。EMT 在育齡女性中的患病率約為10%，但在慢病盆腔痛患者中，其患病率高達70%。異位子宮內膜（ectopic endometrium，EC）的周期性出血導致受累區域內的炎性滲透，并與周圍組織或器官產生粘連，并引發產生進行性加重的繼發性痛經、慢病盆腔痛和不孕癥等一系列臨床癥狀［2］。與惡性腫瘤相似，EMT 可廣泛侵襲性生長［1］。目前，腹腔鏡是診斷EMT 的金標準［3］。但由于腹腔鏡的侵入性，且EMT 缺乏敏感性和特異性的生物學標志物，使EMT 患者從癥狀出現到明確診斷的平均時間長達6～7 年［4］。延遲診斷不僅促進EMT 的進展，而且影響患者的治療，且EMT具有高復發率和低治愈率等臨床特點［5］。因此，需要進一步深入研究EMT 的發病機制和病理機制，以探索有效的臨床治療方法。

近年來，長鏈非編碼RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）已被證實在EMT 等的多種疾病中發揮重要作用［6］，多種lncRNAs 參與了EMT 的發生發展［7］。在EMT 患者EC 組織中表達減少的lncRNA LINC01541 可通過調控miR-506-5p 下調Wnt/β-catenin 通路的活化水平，抑制EC 組織中基質細胞（endometrial stromal cells，ESCs）的增殖、遷移和侵襲［8］。EMT 患者異常升高lncRNA MALAT1 可通過抑制miR-206 的表達上調EC 組織中ESCs 的增殖能力，減少細胞的凋亡，從而發揮促進疾病進展的作用［9］。但lncRNA HAND2-AS1在EMT 中的作用尚不清楚。研究［10-11］顯示：在EMT 患者EC 組織中過度表達的miR-21 是參與EMT 發病細胞信號轉導途徑的重要調節因子，且子宮內膜癌中miR-21 的過表達也與腫瘤細胞的增殖和侵襲能力有關聯。本課題組前期通過生物信息學分析發現lncRNA HAND2-AS1 與miR-21 間存在潛在結合位點，提示HAND2-AS1 可能通過調節miR-21 參與EMT 的發生發展。本研究探討HAND2-AS1 和miR-21 基因在EMT 中的異常表達及其作用，旨在進一步闡明EMT 發生發展的分子機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2020 年5 月—2021 年7 月在本院婦科接受手術治療的EMT 患者30 例作為EMT 組，另選取同時期在本院生殖科就診的輸卵管阻塞育齡女性30 例作為對照組。EMT 的診斷經臨床癥狀、腹腔鏡和組織病理學證實。納入標準：①處于月經周期增生期晚期的EMT 患者（即月經周期的第11～13 天）；②術前3 個月內未接受激素治療者。排除標準：①并發嚴重肝、心、肺、腎、內分泌或免疫等系統疾病者；②孕婦或哺乳期女性；③并發自身免疫性疾病或任何系統的惡性腫瘤者；④并發其他除EMT 以外的婦科疾病者。本研究經本院倫理委員會審批，并取得所有研究對象的書面知情同意書。收集2 組研究對象的年齡、體質量指數（body mass index，BMI）和卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、催乳素（prolactin，PRL）及雌二醇（estradiol，E2）水平。術中收集對照組研究對象的新鮮子宮內膜組織和EMT 患者的EC 組織，迅速置于液氮中，并于30 min 內運回實驗室進行后續研究。

1.2 細胞、主要試劑和儀器293T 細胞購自美國ATCC 細胞庫。DMEM/F12 培養基和1%青-鏈霉素混合液（美國Hyclone 公司），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和Ⅳ型膠原酶（美國Gibco 公司），pcDNA 空質粒和HAND2-AS1 過表達、miR-21 mimic 和陰性對照（mimic negative control，mimic-NC）質粒及含有HAND2-AS1 的3′非翻譯區的靶位序列的野生型（HAND2-AS1-WT）和定點突變（HAND2-AS1-MUT）質粒（北京義翹神州科技股份有限公司），雙熒光素酶報告載體（上海歐陸生物科技有限公司），TRIzol 試劑和Lipofetamin?2000 轉染試劑（美國Invitrogen 公司），反轉錄試劑盒ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix（日本Toyobo 公司），實時熒光定量PCR （realtime fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒RealStar Green（北京康潤誠業生物科技有限公司），雙熒光素酶報告基因分析系統（美國Promega 公司），CCK-8 試劑（美國Sigma 公司），Transwell 小室（美國Corning Costar 公司），Matrigel 基質膠（美國BD 公司），RT-qPCR 引物［生工生物工程（上海）股份有限公司）］。NanoDrop 2000 分光光度計（美國Thermo 公司），CFX96 TouchTMRT-qPCR 儀（美國BioRad 公司），NYW-96M 微板儀（德國BMG LABTECH 公司）。

1.3 細胞分離、培養、轉染和分組按照參考文獻［12］方法從2 組研究對象（n=10）子宮內膜組織中分離ESCs。首先，采用PBS 緩沖液充分洗滌組織以去除血污，無菌眼科剪將組織剪成約1 mm×1 mm×1 mm 小塊，采用含0.1% Ⅳ型膠原酶和0.25% 胰酶的無血清DMEM/F12 培養基于37 ℃水浴鍋中震蕩消化2 h，300 g 離心5 min，取上清液，依次經100 μm 和38.5 μm 的濾網過濾，取過濾液，再次300 g 離心5 min，取底層細胞沉淀，采用含10%FBS 和1%青-鏈霉素的DMEM/F12 培養基在37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。每2 d 更換1 次培養基，光鏡下觀察到ESCs 呈長梭形纖維狀細胞形態，取傳至3 代以后的ESCs 進行后續相關實驗。將對照組ESCs 按每孔1×105個細胞的密度接種于6 孔細胞培養板中，待細胞生長融合至80%時，按轉染試劑Lipofetamin?2000 使用說明書方法進行轉染，并將細胞分為pcDNA 組（轉染pcDNA 空質粒）、HAND2-AS1 組（轉染HAND2-AS1 過表達質粒）、mimic NC 組（轉染mimic NC）、miR-21 mimic 組 （轉染miR-21 mimic）、pcDNA+mimic NC 組（聯合轉染pcDNA空質粒和mimic NC）、HAND2-AS1+mimic NC 組（聯合轉染HAND2-AS1 過表達質粒和mimic NC）、pcDNA+miR-21 mimic 組（聯合轉染pcDNA 空質粒和 miR-21 mimic）和 HAND2-AS1+miR-21 mimic 組（聯合轉染HAND2-AS1 過表達質粒和miR-21 mimic），另設未轉染的細胞作為空白對照組。收集轉染48 h 后的細胞進行后續實驗。

1.4 RT-qPCR 法檢測2 組研究對象子宮內膜組織和ESCs 中HAND2-AS1 mRNA 和miR-21 表達水平采用TRIzol 法提取子宮內膜組織或ESCs 中總RNA。采用分光光度計測定提取的RNA 水平，按照反轉錄試劑盒ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix 說明書操作逆轉錄合成cDNA。以獲得的基因為模板，采用2×RealStar Green 混合試劑盒進行RT-qPCR 實驗。RT-qPCR 引物序列：HAND2-AS1 上游，5′-GGAGTCACAGGCAGTCGTAGA-3′，HAND2-AS1 下游，5′-GAAGGCACAGATCATTCATGG-3′；miR-21 上游，5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG-3′，miR-21下游，5′-CAATTCAGTTGAGGATTATGA-3′；U6 上游，5′-TCTGCCACCCGAGTGTAACCA-3′，U6 下游，5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6 為內參，采用2-ΔΔCt法計算HAND2-AS1 mRNA和miR-21 表達水平。

1.5 熒光素酶基因報告實驗檢測HAND2-AS1 和miR-21 的靶向關系采用生物信息學軟件（Starbase：http：//starbase.sysu.）預測miR-21 與HAND2-AS1 之間的潛在結合位點。將合成的HAND2-AS1-WT 和HAND2-AS1-MUT 克隆至熒光素酶報告載體中。取生長狀態良好的293T 細胞，以每孔1×104個細胞的密度接種至96 孔細胞培養板中，并將HAND2-AS1-WT、HAND2-AS1-MUT和miR-21 mimic 或mimic-NC 在Lipofetamin?2000作用下進行共轉染。轉染48 h 后，收集裂解后的細胞，在雙熒光素酶報告基因分析系統中采用熒光素酶分析試劑盒檢測樣品的熒光素酶活性。熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.6 CCK-8 法檢測各組ESCs 增殖活性取各組ESCs，以每孔6×103個細胞的密度接種于96 孔細胞培養板中，每組設6 個復孔。于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24、48 和72 h 后，向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，繼續孵育2 h 后，采用微板儀測定每孔于波長450 nm 處的吸光度（A）值，以A 值代表細胞增殖活性。

1.7 Transwell 小室實驗檢測各組ESCs 的遷移和侵襲能力取各組ESCs，常規消化后，1 000 g 離心15 min，重懸于無血清的DMEM/F12 培養基中，稀釋至2×105mL－1。分別取約200 μL 細胞懸浮液接種至Transwell 上室，侵襲實驗需在上室預先包被Matrigel 基質膠。將700 μL 含10%FBS 的DMEM/F12 培養基加入下室。置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養24 h，取出上室，棄細胞懸浮液，無菌PBS 緩沖液洗滌細胞，使用棉簽輕輕地清除未穿出細胞。室溫下采用4%多聚甲醛溶液固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，在光學顯微鏡下隨機選取5 個視野計數穿膜細胞數，并以遷移實驗和侵襲實驗中穿膜細胞數（即遷移和侵襲細胞數）代表各組ESCs 的遷移和侵襲能力。

1.8 統計學分析采用SPSS 21.0 統計軟件進行統計學分析。2 組研究對象年齡，BMI、血清中FSH、LH、PRL 和E2 水平及2 組研究對象子宮內膜組織和各組ESCs 中HAND2-AS1 mRNA 及miR-21 表達水平，遷移和侵襲細胞數及熒光素酶活性均符合正態分布，以xˉ±s表示，2 組間樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用LSD-t檢驗，相關性分析采用Pearson’s 相關系數分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 2 組研究對象一般資料2 組研究對象年齡、BMI 和血清中FSH、LH 及PRL 水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。與對照組比較，EMT 組患者血清中E2 水平升高（P＜0.05）。見表1。

表1 2 組研究對象一般資料Tab.1 General informations of subjects in two groups(n=30，±s）

表1 2 組研究對象一般資料Tab.1 General informations of subjects in two groups(n=30，±s）

Group Control EMT P Age(year)31.09±0.80 31.39±1.04 0.82 BMI(kg·m－2)23.70±0.70 22.67±0.86 0.39 FSH[λB/(IU·L－1)]5.98±0.31 7.74±0.85 0.13 LH[λB/(IU·L－1)]5.45±0.77 5.29±0.69 0.89 PRL[ρB/(μg·L－1)]16.55±3.61 21.66±3.39 0.33 E2[ρB/(ng·L－1)]35.21±3.53 51.59±5.08 0.03

2.2 2 組研究對象子宮內膜組織和ESCs 中HAND2-AS1 mRNA 及miR-21 表達水平及其相關性RT-qPCR 檢測結果顯示：與對照組（1.00±0.00 和1.00±0.00）比較，EMT 組患者EC 組織中HAND2-AS1 mRNA 表達水平（0.42±0.11）降低（P＜0.05），miR-21 表達水平（4.58±0.35）升高（P＜0.05）。與對照組（1.00±0.00 和1.00±0.00）比較，EMT 組ESCs 中HAND2-AS1 mRNA 表達水平（0.36±0.09）降低（P＜0.05），miR-21 表達水平（6.69±0.81）明顯升高（P＜0.01）。Pearson 相關系數分析結果顯示：在對照組中，HAND2-AS1 與miR-21 表達水平無明顯相關性（r=0.34，P＞0.05），在EMT 組中，HAND2-AS1 與miR-21 表達水平呈負相關關系（r=－0.57，P＜0.05）。

2.3 各組ESCs 中HAND2-AS1 mRNA 和miR-21表達水平與空白對照組比較，pcDNA 組ESCs 中HAND2-AS1 mRNA 表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），HAND2-AS1 組ESCs 中HAND2-AS1 mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.01）；與空白對照組比較，mimic NC 組ESCs 中miR-21 表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），miR-21 mimic 組ESCs 中miR-21 表達水平明顯升高（P＜0.01）；與空白對照組比較，HAND2-AS1+mimic NC 組ESCs 中 miR-21 表達水平降低 （P＜0.05），pcDNA+miR-21 mimic 組ESCs 中miR-21 表達水平明顯升高（P＜0.01），pcDNA+mimic NC 組和HAND2-AS1+miR-21 mimic 組ESCs 中miR-21 表達水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。與pcDNA+ miR-21 mimic 組比較，HAND2-AS1+miR-21 mimic 組ESCs 中miR-21 表達水平降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 RT-qPCR 法檢測各組ESCs 中HAND2-AS1 mRNA 和miR-21 表達水平Fig.1 Expression levels of HAND2-AS1 mRNA and miR-21 in ESCs in various groups detected by RT-qPCR method

2.4 各組細胞中HAND2-AS1 與miR-21 的靶向關系采用生物信息學軟件（Starbase：http：//starbase.sysu.edu.cn/）預測 HAND2-AS1 和miR-21 之間的潛在關系，HAND2-AS1 與miR-21間存在靶向結合位點。雙熒光素酶基因報告實驗結果表明：與mimic NC 組比較，miR-21 mimic 組HAND2-AS1-WT 的相對熒光素酶活性明顯降低（P＜0.01），HAND2-AS1-MUT 的熒光素酶活性差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 HAND2-AS1 miR-21 的靶向關系Fig.2 Targeting relationship between HAND2-AS1 and miR-21

2.5 各組ESCs 增殖活性與空白對照組比較，HAND2-AS1+mimic NC 組ESCs 增殖活性降低（P＜0.05），pcDNA+miR-21 mimic 組ESCs 增殖活性升高（P＜0.05），pcDNA+mimic NC 組和HAND2-AS1+miR-21 mimic 組ESCs 增殖活性差異均無統計學意義（P＞0.05）。與pcDNA+miR-21 mimic 組比較，HAND2-AS1+miR-21 mimic 組ESCs 增殖活性降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 CCK-8 法檢測各組ESCs 增殖活性Fig.3 Proliferation activities of ESCs in various groups detected by CCK-8 method

2.6 各組ESCs 的遷移和侵襲數與空白對照組比較，HAND2-AS1+mimic NC 組ESCs 的遷移和侵襲數均明顯降低（P＜0.01），pcDNA+miR-21 mimic 組ESCs 的遷移和侵襲數均升高（P＜0.05），pcDNA+mimic NC 組和 HAND2-AS1+miR-21 mimic 組ESCs 的遷移和侵襲數差異均無統計學意義（P＞0.05）。與pcDNA+ miR-21 mimic 組比較，HAND2-AS1+miR-21 mimic 組ESCs 的遷移和侵襲數均降低（P＜0.05）。見圖4～7。

圖4 Transwell 小室實驗檢測各組ESCs 的遷移情況（結晶紫，×200）Fig.4 Migration of ESCs in various groups detected by Transwell chamber assay(Crystal violet, ×200)

圖5 Transwell 小室實驗檢測各組ESCs 的侵襲情況（結晶紫，×200）Fig.5 Invasion of ESCs in various groups detected by Transwell chamber assay(Crystal violet, ×200)

圖6 各組ESCs 的遷移數Fig.6 Number of migration ESCs in various groups

圖7 各組ESCs 的侵襲數Fig.7 Number of invasion ESCs in various groups

3 討 論

盡管EMT 被歸類為良性疾病，但其也表現出惡性腫瘤的常見特征，如無限生長、周圍組織侵襲和破壞，以及局部或遠處轉移和易復發性等［13-14］。此外，EC 組織中ESCs 的遷移和侵襲特征與惡性腫瘤細胞幾乎相同［15］。然而，ESCs 增殖、遷移和侵襲特性的分子機制尚未完全闡明。目前臨床尚無針對EMT 的早期診斷工具或根治性治療方法。而造成這一現象的原因是EMT 發病機制的復雜性和癥狀的多樣性［16］。因此，確定EMT 的新治療靶點和生物學標志物具有重要意義。

lncRNAs 和miRNAs 參與多種生物學過程，如細胞增殖、分化、染色體重塑、表觀遺傳調節、轉錄修飾和轉錄后修飾等［17］。此外，miR-21 已被確定為多種腫瘤的關鍵調節因子［18］。既往研究［10］證實miR-21 在EMT 中呈異常高表達現象。本研究結果顯示：miR-21 在EMT 組織和細胞中表達上調，HAND2-AS1 和miR-21 具有靶向性關系。

研究［16］顯示：lncRNAs 可能在轉錄后水平上抑制miRNA 的表達，從而參與細胞增殖、遷移和侵襲等多種生物學行為。本研究結果顯示：HAND2-AS1 為miR-21 的上游靶點，在EMT 患者EC 組織和ESCs 中HAND2-AS1 表達明顯下調，且在EMT 患者EC 組織中HAND2-AS1 與miR-21的表達呈負相關關系。體外實驗進一步證實：HAND2-AS1 通過調節miR-21 抑制ESCs 的增殖、遷移和侵襲。HAND2-AS1 作為一種腫瘤抑制因子，已被證實在子宮內膜樣癌、宮頸癌和骨肉瘤等多種腫瘤組織中表達下調，且能抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移等惡性生物學行為［19-21］。如在子宮內膜癌組織中表達下調的HAND2-AS1 與患者的腫瘤分級、淋巴結轉移和復發呈負相關關系，且過表達HAND2-AS1 可明顯抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲［19］。在宮頸癌中，HAND2-AS1 表達下調同樣與患者的不良預后有關，HAND2-AS1 可通過與miR-21 競爭性結合以上調組織金屬蛋白酶抑制因子3 表達，抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡［20］。本研究結果表明：HAND2-AS1能通過調控miR-21 的表達抑制ESCs 的增殖、遷移和侵襲能力。

綜上所述，在EMT 患者EC 組織和ESCs 中表達下調的HAND2-AS1 可通過調控miR-21 抑制ESCs 的增殖、遷移和侵襲，從而參與EMT 的發生發展。提示HAND2-AS1/miR-21 軸可能是EMT診斷和治療的一個潛在有效的生物標志物。