蘆筍膽固醇C-22羥化酶基因 AoCYP90B27的克隆及表達模式分析

張永輝,劉正杰,2,成 欽,黎玉萍,毛自朝,2,黃 玲,林 春,2

(1.云南農業大學 農學與生物技術學院, 昆明 650201;2.云南農業大學 特色小宗作物研究中心,昆明 650201;3.四川省農業科學院 經濟作物育種栽培研究所,成都 610300)

蘆筍(AsparagusofficinalisL.)為天門冬科天門冬屬食藥同源的名貴蔬菜,具降血脂、降血壓、軟化血管和增強免疫力的功能[1-2]。研究發現蘆筍提取物對癌癥細胞,特別是食道癌、膀胱癌、肺癌等細胞有較顯著的抑制作用,被認定為優良的抗癌蔬菜[3-4]。目前已確定蘆筍中具抗癌、降脂活性的主要化合物是甾體及其皂苷[5-6],甾體皂苷在天門冬屬如蘆筍、天門冬(Asparaguscochinchinensis)、薯蕷(Dioscoreaopposite)和菝葜(Smilaxchina)等植物中含量豐富[7]。自首次從白蘆筍莖基部分離甾體皂苷以來,新的甾體皂苷不斷被分離[8]。蘆筍地上部主要含原薯蕷皂苷,而蘆筍地下部主要含有菝葜皂苷元、雅姆皂苷元及天冬寧,這些皂苷在蘆筍根盤(crown)和肉質貯藏根中含量最高[3]。在植物中,膽固醇是合成油菜素內脂(BRs)、甾體皂苷(steroidal sapnion)及甾體糖苷生物堿(SGAs)的關鍵中間物[9]。目前蘆筍中膽固醇合成及隨后的皂苷元合成及調控途徑的研究尚未見報道。通過對模式植物的研究確定甾體皂苷合成下游途徑主要包括膽固醇在細胞色素依賴氧化酶/羥化酶(Cytochrome 450,CYP450)和α-酮戊二酸依賴的氧化酶/羥化酶(2OGD)催化的膽固醇碳骨架不同位點的羥基化修飾[10-12],羥化膽固醇在甲基轉移酶[13]、?；D移酶[14]和糖基轉移酶[15-16]催化的羥基位點進行甲基化、乙?；吞腔刃揎椬罱K合成多樣的皂苷元。

皂苷包括甾體皂苷、三萜皂苷等廣泛分布于植物[17]和許多海洋物種中[18]。皂苷可作為抗真菌劑、光保護劑、活性氧清除劑,是植物天然免疫促進物質,能提高植物抗逆能力[19-20]。研究表明,皂苷含量更多的轉基因蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)在鹽脅迫下有更好的長勢[21]。在將5%皂苷作為生物引發劑處理大豆[Glycinemax(Linn.)Merr.]種子時,能提高大豆的抗氧化能力、滲透壓代謝進而賦予大豆更高的耐鹽性[22]。目前,甾體皂苷合成途徑中膽固醇羥化酶基因陸續被發現,在加州藜蘆(Veratrumcalifornicum)的甾體生物堿合成研究中,首次確定VcCYP90B27(GenBank:AJT59559.1)是專一催化膽固醇22α羥基化,形成 22(R)-羥基膽固醇的羥化酶[23]。在滇重樓(Parispolyphylla)甾體皂苷合成研究中,克隆了加州藜蘆的VcCYP90B27同源的PpCYP90B27(KX904822)基因,并確定為云南重樓中的膽固醇C-22羥化酶[24]。然而在蘆筍中至今未見克隆甾醇羥化酶基因及其在抗旱方面作用的報道。

本研究首先通過同源預測,蘆筍CYP450基因組家族及轉錄組測序的基因表達分析,預測到蘆筍中 3個 蘆筍膽固醇C-22羥化酶基因(AoCYP90B1N1、AoCYP90B2N1和AoCYP90B 2N2)。克隆其中的AoCYP90B1N1,命名為AoCYP90 B27,經生物信息學分析該基因編碼序列及啟動子序列的特征,通過qRT-PCR確定其在蘆筍不同組織部位的表達情況,進一步基于其啟動子元件中預測到脫落酸(Abscisic acid,ABA)、水楊酸(Salicylic acid,SA)和茉莉酸甲酯(Jasmonic acid methylester,MeJA)的相應元件等,通過ABA、SA、MeJA及PEG模擬干旱處理下,該基因根系表達模式分析,預測AoCYP90B27為蘆筍甾體皂苷合成下游膽固醇的22羥化酶基因,為蘆筍皂苷的合成以及基于皂苷合成的蘆筍抗逆優質品種培育提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

供試蘆筍材料為‘格爾夫’品種,種植于云南農業大學后山農場。在蘆筍母莖開花時期,取擬葉、母莖、根和花部位樣品,立即用液氮速凍,于-80 ℃冰箱保存備用。

Taq酶、TB GREEN Premix EXTaqⅡ熒光定量試劑盒、pMD18-T載體購置于TaKaRa公司; 瓊脂糖凝膠回收試劑盒、反轉錄試劑盒購置于天根生物有限公司。引物合成與測序由北京擎科生物技術有限公司完成,PEG 6000等其他分析純試劑從昆明云科生物技術有限公司購買。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘆筍的CYP450超基因家族分析 以Phytozone蘆筍基因組(AsparagusofficinalisV1.1)數據(https://data.jgi.doe.gov/refine-download/phytozome?organism= Aofficinalis & expanded=498)中最長轉錄本為基礎,提取出蘆筍基因組中全部的124個CYP450基因的編碼蛋白,用RAxML(https://github.com/stamatak/standard-RAxML)以最大似然法對所獲序列進行建樹,將建樹后獲得的結果在進化樹編輯網站ITOL(https://itol.embl.de/)上進行修飾,進行蘆筍CYP450超基因家族家族分析。

1.2.2 蘆筍基因組的AoCYP90B27基因的生物信息學分析 將獲得的CYP85部族的90B亞家族基因與已知功能的日本晴水稻(Oryzasativajaponicagroup)OsCYP724B1、番茄(Solanumlycopersicum)SlCYP724B1、胡楊(Populuseuphratica)PeCYP90B1、棉花(Gossypiumhirsutum)GhCYP90B1、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)MtCYP90B1、木豆(Cajanuscajan)CcCYP90B1、紫松果菊(Echinaceapurpurea)EpCYP90B1、擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtCYP90B1、玉米(Zeamays)ZmCYP90B1、滇重樓(Parispolyphylla)PpCYP90B27、加州藜蘆(Veratrumcalifornicum)VcCYP90B27、馬鈴薯(Solanumtuberosum)StCYP72A188、匍匐筋骨草(Ajugareptans)ArCYP71D443等C-22羥化酶基因用最大似然法RAxML構建系統發育樹。

利用Protparam在線軟件(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protpara)預測蛋白序列等電點和分子質量等理化性質;NCBI在線CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)預測氨基酸序列保守結構域;SOPM在線軟件(https://npsa-prabi.Ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl)預測蛋白質二級結構;SignalP 4.1 Server在線預測(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)信號肽;在線程序AlphaFold(https://colab.research.google.com/github/deepmind/alphafold/blob/main/notebooks/AlphaFold.ipynb)預測蛋白質的三級結構;參考蘆筍基因組在線測序信息https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/10978);MEME在線軟件(https://meme-suite.org/meme/)預測氨基酸序列的motif;調取AoCYP90B27起始密碼子上游2 000 bp的啟動子序列,使用PlantCARE在線軟件進行啟動子序列分析。

1.2.3 總DNA、RNA的提取及cDNA的合成 樣品總DNA和總RNA用提取試劑盒(中科雷鳴,北京)進行提取,根據反轉錄試劑盒(宇恒生物,蘇州)的操作流程制備cDNA,并于-20 ℃保存,用于后續試驗。

1.2.4AoCYP90B27基因的克隆 用AoCYP90B27(LOC109833124)CDS設計特異引物AoCYP90B27F和AoCYP90B27R(表1),以根部的cDNA進行RT-PCR擴增。將PCR產物與pMD18-T載體連接,連接產物轉化至大腸桿菌感受態細胞DH5α,挑取經PCR鑒定的陽性克隆,提取質粒后送樣測序。

表1 引物序列

1.2.5 實時熒光定量qRT-PCR分析 提取蘆筍根、母莖、擬葉、花,及上述不同時間的脅迫處理的總RNA,反轉錄合成第一條cDNA,根據Abdelrahman等[25]的方法,以蘆筍elongation factor 1-alpha(eEF1A)持家基因作為內參,用引物eEF1A F1、eEF1A RI和qAoCYP90B27F1、qAoCYP90B27R1進行樣品定量real-time PCR分析,重復3次,基因相對表達量采用2△△Ct法進行計算。

1.2.6 ABA、MeJA和SA激素及PEG模擬干旱處理蘆筍幼苗的方法 蘆筍種子溫水搓洗后溫水浸泡1～2 d,取出洗凈,置于溫室的培養皿中室溫萌發出苗。將發芽的蘆筍種子轉入育苗盤,置于光照培養箱中(光周期12 h、暗周期12 h)25 ℃培養30 d后移栽至小盆中,挑選長勢一致且健壯的蘆筍幼苗,用20% PEG作為模擬干旱處理幼苗,以及用100 μmol·L-1ABA、100 μmol·L-1MeJA和5 μmol·L-1SA對蘆筍的擬葉進行噴施處理,處理時間均為0、3、6、9、12、24 h,處理后取相同部位的根部用于qRT-PCR測定(方法同“1.2.5”),重復3次。

1.3 數據分析

用Excel 2016及R進行數據處理,用RAxML軟件進行最大似然法系統發育樹構建,用TBtools軟件進行motif、CDS結構可視化分析,用GraphPad Prism 8 軟件繪制圖,采用PyMOL軟件進行蛋白質三級結構可視化。

2 結果與分析

2.1 蘆筍CYP450基因家族中膽固醇C-22羥化酶的預測與篩選

蘆筍基因組的測定為膽固醇C-22羥化酶基因的篩選提供了良好的基礎[26]。通過蘆筍基因組家族分析,獲得 124個 CYP450 超家族基因,分屬 CYP450 的 71,72,85,86,89,78,711 等部族(clan),其中 71,72,85,86 部族含多家族。其中最具有代表性的是家族85,其中包含90B分支(圖1-A、1-B)。利用馬鈴薯、擬南芥、水稻等模式植物中甾醇醇C-22羥化酶序列,進行blast分析(identity>40%,evalue=1e-6,coverage= 0.8),獲得蘆筍甾體皂苷下游甾醇C-22羥 化 酶同源基因4個。再與功能確定的膽固醇C-22羥化酶基因進行進行同源分析,最終預測到3個羥化酶(AoCYP90B1N1、AoCYP90B2N1和AoCYP90B2N2)基因。候選基因AoCYP90BIN1與VcCYP9027B和PpCYP90B27親緣關系近,氨基酸同源性分別為79.8%和76.0%,構建的進化樹中也聚為同一分支(圖1-C),從而預測為膽固醇 C-22 位羥化酶。Motif結構域分析結果表明(圖1-C),進化樹所有基因都含有相同的motif 3和motif5,所有的CYP90B1基因都擁有6個motif,其中motif3中包含一個所有CYP450家族基因特有的半胱氨酸血紅素鐵配體標記(cysteine heme-iron ligand signature,FSGGPRLCPG),CDD分析結果表明AoCYP90B1N1和VcCYP90B27、PpCYP90B27也都被預測為CYP90-like基因家族成員。

A.蘆筍CYP450超基因家族分析;B.CYP85部族進化樹分析;C.候選基因與其他物種的22羥化酶的進化樹分析(前),motif分析(中),CDD(后)分析

2.2 AoCYP90B27基因的克隆、序列及啟動子順式作用元件分析

以‘格爾夫’根部cDNA為模板對AoCYP90B1N1基因進行克隆,凝膠電泳結果顯示在1 000～2 000 bp有一個單一目的條帶,基因擴增成功,命名為AoCYP90B27(圖2)。通過Prot-param在線軟件分析,AoCYP90B27的開放閱讀框全長1 443 bp,蛋白分子質量為54.5 ku,編碼52個帶正電荷的氨基酸殘基和54個帶負電荷氨基酸殘基,等電點4.99,不穩定系數為42.31,屬于不穩定蛋白。用在線TMHMM分析蛋白結構,第22～481位氨基酸位于細胞膜質側,在5～22位氨基酸之間存在一個跨膜結構螺旋區。信號肽預測發現在21～22位氨基酸位點存在一個信號錨的序列,AoCYP90B27是一個膜內蛋白,定位于細胞膜的胞質側。AoCYP90B27蛋白的三級結構與VcCYP90B27的RMSD(Root Mean Square Deviation,RMSD)有最小值0.302,與PpCYP90B27的RMSD值0.370次之,與擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtCYP90B1蛋白的晶體結構(PDB ID:6A15.1)RMSD有最大值0.646,說明AoCYP90B27蛋白的三級結構與VcCYP90B27相似(圖3-A～圖3-D)。

M.DNA marker,大小分別為2 000 bp、1 500 bp、1 000 bp、500 bp、250 bp、100 bp;1. AoCYP90B27基因擴增結果(1 443 bp)

A. AtCYP90B1三級結構(PDB ID:6A15.1);B. VcCYP90B27三級結構預測;C. PpCYP90B27三級結構預測;D. AoCYP90B27三級結構預測

通過PlantCARE在線軟件分析AoCYP90B27基因的啟動子上順式作用元件(表2)。該基因啟動子序列主要含有CAAT-box、TATA-box、CAAT-box等真核生物高度保守的調控元件、ATCT-motif、GATA-motif、G-box、GT1-motif、GTGGC-motif及Sp1等光響應元件,以及干旱相關的MYB結合位點MBS、ABRE、P-box與MeJA響應的調控元件CGTCA-motif、赤霉素響應元件TATC-box、水楊酸響應元件TCA-element等激素響應元件及厭氧響應元件ARE,說明AoCYP90B27可能受干旱、光和激素等多種環境信號的調控,預示蘆筍皂苷合成,可能調控根系適應或抵抗多年生的微生物土壤環境等生物學過程來調控其特定的根系生長發育過程。

表2 蘆筍 AoCYP90B27基因啟動子調控區元件

2.3 蘆筍 AoCYP90B27基因組織表達模式分析

基于課題組前期的轉錄組數據,對全部蘆筍CYP85家族的基因在兩性株蘆筍和雌株蘆筍的不同組織部位進行基因表達模式分析(圖4-A),結果表明,含有包括AoCYP90B27和AoCYP90B2N1基因在內甾醇C-22羥化酶家族基因在兩性株和雌株蘆筍的根、莖和花中差異表達,這2個基因均在根部表達量最高,母體莖次之。進一步通過qRT-PCR驗證AoCYP90B27基因在根、母體莖、花和擬葉的組織均能表達(圖4-B),結果表明,AoCYP90B27基因在根、母體莖、擬葉、花器官中表達量明顯不同,根系表達量最高,比其他地上部組織的表達量高17.98倍。母體莖、花和擬葉中的表達量均特別低,且地上部三者之間沒有顯著性差異,與蘆筍轉錄組測序數據中該基因的相對表達量的結果一致(圖4-A)。

HF1～HF3.兩性株花組織;HS1～HS3.兩性株莖組織;HR1～HR3.兩性株根組織;FF1～FF3.雌株花組織;FS1～FS3.雌株莖組織;FR1～FR3.雌株根組織;**表示差異極顯著(P<0.01),下同

2.4 干旱脅迫、ABA、MeJA、SA激素處理下 AoCYP90B27基因的表達情況分析

由于AoCYP90B27基因啟動子含有ABRE、P-box、CGTCA-motif、TATC-box、TCA-element等激素響應元件;MBS干旱響應元件和ARE厭氧響應元件。通過ABA、MeJA和SA激素及PEG模擬干旱處理蘆筍幼苗。結果表明,不同激素及干旱處理下,處理不同時間,蘆筍根部的AoCYP90B27基因的表達量存在明顯差異。PEG模擬干旱脅迫處理(圖5-A),AoCYP90B27基因的表達量隨處理時間的延長,表達量逐漸升高,于9 h表達量達最高,為4.392,之后快速下降。ABA處理(圖5-B),AoCYP90B27基因在12 h處理之前基因的相對表達量均在1以下小幅度波動,12 h處理時表達量達最大,之后表達量也呈現快速下降趨勢。MeJA激素處理下(圖5-C),該基因隨著處理時間的推進,表達量逐漸增加,24 h處理時基因表達量最高,高達7.985 5。SA激素處理下(圖5-D),隨處理時間的推進,基因表達量逐漸增加,于9 h時表達量最高,之后表達量下降,但處理24 h時表達量又有所增加,但與12 h的處理沒有顯著差異。

ns表示差異不顯著;*表示差異顯著(P<0.05)

3 討 論

CYP450s是介導多種生物途徑產生初級和次級代謝產物合成轉化的關鍵催化酶,如參與苯丙烷類、生物堿、皂苷、脂質、芥子油苷、植物激素、信號分子等合成與轉化[27]。在植物中, CYP450s一般分為A型或非A型[28-29]。A型起源于單一祖先,已被發現在次級代謝物和天然化合物或植物特異性化合物的合成中發揮重要作用,以適應生物和非生物脅迫條件[30]。而不同植物物種中的非A型細胞色素P450家族對生物和非生物耐鹽性起著重要作用[31], 如CYP85部族(clan)。本研究根據蘆筍基因組數據注釋信息一共挑選出124個CYP450基因,歸屬14個部族(clan),其中CYP85部族包括4個CYP90B亞家族基因。前人研究結果表明,CYP90B基因參與植物甾體皂苷及油菜素類脂的合成[32-33]。對AoCYP90B27和其他物種C-22羥化酶基因的進化樹分析結果表明,AoCYP90B27與VcCYP90B27、PpCYP90B27聚在同一分支上,有高于70%同源性;motif分析結果表明,在蘆筍基因組中,蘆筍CYP90B家族基因與其他物種的C-22羥化酶基因序列特征相似性較高;NCBI-CDD預測結果也將AoCYP90B27劃分為CYP90-like家族。因此,預示AoCYP90B27在甾體皂苷合成過程中能催化膽固醇C-22羥基化,響應生物和非生物 脅迫。

AoCYP90B27基因啟動子含有多個與光、干旱、激素ABA、MeJA、SA及防御響應誘導的結構元件。在外源ABA、MeJA、SA激素處理下,蘆筍根部AoCYP90B27基因被誘導表達,且表達模式存在差異。而在MeJA處理下基因的表達穩步提高,在24 h達到最大值, 這與前人報道的結果相似[34-35],MeJA可以誘導皂苷合成中CYP450家族基因的表達。組織特異性表達分析發現AoCYP90B27在蘆筍各個組織器官中均有表達, 但在根中表現出較高的差異表達,其次是母體莖。前人研究結果表明,皂苷是植物適應環境、抵抗逆境的一種物質基礎[36-37]。AoCYP90B27在根部的特異性表達和被干旱、MeJA、ABA、SA等激素誘導表達,說明AoCYP90B27在受干旱等非生物脅迫的誘導下會在根部過量表達,能使皂苷合成下游的膽固醇C-22羥化反應速率加快,促使多年生蘆筍根系皂苷的積累,以適應土壤固化環境的生長發育,進而提高蘆筍的抗旱能力。植物在受干旱、寒冷等非生物及生物脅迫下,調節體內的MeJA、ABA、SA含量,促進激素合成途徑基因的表達,快速響應來提升抗寒、抗旱能力[38-40]。在模擬干旱脅迫下,AoCYP90B27被干旱誘導表達,這與Zhou等[41]報道的結果一致。

本研究通過蘆筍基因組家族結合轉錄組分析,預測到屬于CYP450超基因家族的關鍵膽固醇C-22羥化酶AoCYP90B27基因,該基因啟動子含有ABA、MeJA、SA激素和干旱響應元件,通過基因表達模式及非生物脅迫處理,初步發現該基因受干旱脅迫及激素誘導在根中呈現不同的表達模式,推測AoCYP90B27在受到非生物脅迫的誘導下能被誘導表達,促使甾體皂苷的積累以提高多年生蘆筍根部適應土壤干旱環境或抵抗土壤中非生物脅迫的抗性,這個結論有待后期試驗進行驗證。