鮑魚內臟磷脂提取純化工藝及抗氧化特性研究

楊芝芝,趙曉丹,葉 佳,許 慧,陳繼承

福建農林大學 食品科學學院,福建 福州 350002

鮑魚是世界上珍貴的腹足類動物,被世界各國廣泛養(yǎng)殖[1]。中國是鮑魚生產大國,其產量從2010年的5.56萬t增加到2020年的30.35萬t[2]。研究表明,從鮑魚內臟中提取的磷脂富含多不飽和脂肪酸(PUFA),是重要的保健食品功能因子,具有良好的抗氧化活性[3-4]、抗腫瘤[5]、抗菌[6]、降血脂[7]、調節(jié)免疫[8]等功能。但目前對鮑魚的加工主要以肌肉為主,絕大部分的內臟被加工為飼料或丟棄,造成極大的資源浪費,因此如何將鮑魚加工下腳料進行高值化利用成為目前亟須解決的問題。

人體在代謝的過程中會產生超氧陰離子自由基(O2-·)、DPPH自由基和羥自由基(OH·)等,這些自由基不僅能使體內產生丙二醛等有害物質,造成機體衰老的同時還與腫瘤的發(fā)生密切相關[9]。在食品的加工過程中油脂極易發(fā)生氧化,不僅會破壞食品的外觀和質地,還會產生過氧化脂質等有毒有害化學物質[10]。目前越來越多抗氧化劑被應用于食品工業(yè),如BHA、TBHQ、BHT等人工合成抗氧化劑,雖具有良好的抗氧化活性,但使用時潛在的風險并不能完全消除,因此開發(fā)安全、高效的抗氧化劑是目前研究的熱點。

卵磷脂是磷脂的主要組分,是促進身體各個細胞正常新陳代謝的重要天然活性物質,具有極高的營養(yǎng)價值。目前,卵磷脂主要在蛋黃、大豆和動物及植物的組織中被發(fā)現,但由于PUFA的種類和含量較少且膽固醇水平相對較高,導致脂肪酸的組成不夠理想[11]。相較而言,鮑魚內臟磷脂中有大量ω-3、ω-6和ω-9型等PUFA,是食品和醫(yī)藥領域重要原料[12]。卵磷脂的提取方法根據物質性質不同也各有差異,但基本遵循先提取粗油脂后再分離的方法,目前卵磷脂提取方法有超聲波提取法[13-14]、溶劑法[15-16]、超臨界流體萃取法[11,17]等。其中溶劑法因方法簡單、易操作,而廣泛應用于卵磷脂的提取,本研究在溶劑法的基礎上結合單因素和正交試驗優(yōu)化提取工藝,研究鮑魚內臟磷脂的體外抗氧化活性和抗油脂氧化的能力,為進一步開發(fā)利用鮑魚內臟廢棄物提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

鮑魚、大豆油、菜籽油:福州永輝超市(大儒世家店)。丙酮、乙醇(95%)、抗壞血酸(Vc)等試劑均為分析純;抗氧化測定試劑盒、1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·):北京索萊寶科技有限公司;叔丁基對苯二酚(TBHQ):上海阿拉丁生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SC-3612低速離心機:科大創(chuàng)新股份有限中佳分公司;EYELA MG-2200氮吹儀:上海賽默生物科技發(fā)展有限公司;HWS-24型電熱恒溫水浴鍋:上海一恒科學儀器有限公司;UV-2601雙光束紫外可見分光光度計:北京瑞利分析儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

鮑魚清洗干凈后,剔除殼和肉部分,取出需要的內臟組織,然后搗碎、勻漿、凍干后磨粉,密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 粗脂肪的提取

先采用Floch法[18]提取鮑魚內臟中的粗脂肪,再用14%正己烷進行二次萃取,以上操作重復3次,通過旋轉蒸發(fā)濃縮樣液,計算最終得率。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 丙酮提取鮑魚內臟粗磷脂的試驗設計

取5 g鮑魚內臟粗脂肪,固定丙酮提取時間40 min、提取3次,液料比設為5∶1、7∶1、9∶1、11∶1、13∶1(mL/g),測定粗磷脂得率。

取5 g鮑魚內臟粗脂肪,固定液料比9∶1(mL/g)、丙酮提取3次,提取時間設為20、30、40、50、60 min,測定粗磷脂得率。

取5 g鮑魚內臟粗脂肪,固定液料比9∶1(mL/g)、丙酮提取時間40 min,提取次數設為1、2、3、4、5,測定粗磷脂得率。

磷脂含量采用鉬藍比色法測定,粗磷脂得率=(丙酮不溶物質量/粗脂肪質量)×100%。

1.3.3.2 乙醇純化鮑魚內臟磷脂的試驗設計

取3 g鮑魚內臟粗磷脂,設置乙醇與其液料比為6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1(mL/g),乙醇體積分數80%、85%、90%、95%、100%,提取溫度20、30、40、50、60 ℃,提取時間20、30、40、50、60 min,提取次數1、2、3、4、5,分別進行單因素試驗,測定磷脂得率。

1.3.4 響應面試驗設計

選取乙醇體積分數、提取時間、乙醇與粗磷脂的液料比作為影響因素設計響應面試驗,評價指標為磷脂得率,確定最佳工藝條件。

1.3.5 還原力的測定

采用普魯士藍法測定還原力。

1.3.6 羥自由基清除作用

測定方法參考試劑盒說明書,清除率=((D1-D2)/D1)×100%,其中,D1為對照吸光度,D2為樣品吸光度。

1.3.7 DPPH自由基清除作用

測定方法參考試劑盒說明書,DPPH自由基清除率= (D0-(D1-Ds)/D0)×100%,其中,D0為DPPH的吸光度,D1為樣品與DPPH混合液的吸光度,Ds為沒有DPPH樣液的吸光度。

1.3.8 超氧陰離子自由基清除作用

超氧陰離子自由基清除率測定方法(磺胺比色法)參考試劑盒說明書,計算方法同羥自由基清除率。

1.3.9 鮑魚內臟磷脂對不同油脂抗氧化能力測定

采用Schaal烘箱氧化法[19],過氧化值的測定參照GB/T 5538—2005。

1.4 數據處理與分析

試驗數據均以平均值±標準差表示,使用SPSS 23.0進行方差顯著性分析,使用Origin 8.0制圖。

2 結果與討論

2.1 丙酮提取鮑魚內臟粗磷脂單因素試驗

丙酮提取鮑魚內臟粗磷脂的單因素試驗結果見圖1。由圖1(a)和(b)可知,隨著液料比和提取次數的增加,粗磷脂得率逐漸減少,即增大液料比和提取次數,可以讓磷脂以外的非目標提取物溶解更徹底,但當液料比超過9∶1,提取次數超過3次后,粗磷脂得率逐漸平衡,說明丙酮提取能力已達到極限。由于丙酮自身的局限性,從減少其殘留角度考慮選擇液料比為9∶1 ,提取次數為3次。由圖1(c)可知,粗磷脂得率隨提取時間的延長而減少,在40 min時最小,然后又逐漸增加,說明提取時間過短,非目標物質未能與乙醇充分溶解;40 min后磷脂得率又開始增加,可能是反應時間過長導致磷脂氧化而使溶解物質量增加,不利于磷脂提取。因此選擇丙酮提取時間為40 min。

注:(a)—(c)分別為液料比、提取次數和提取時間對粗磷脂得率的影響。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),圖2同。

經過單因素試驗優(yōu)化后采用液料比9∶1,提取時間40 min,提取3次為最佳條件,粗磷脂得率為(26.75±0.87)%。

2.2 乙醇純化粗磷脂單因素試驗

乙醇純化粗磷脂的單因素試驗結果如圖2所示。由圖2(a)可知,隨著液料比增大磷脂得率明顯提高,但是在液料比達到10∶1后,磷脂得率基本穩(wěn)定,說明乙醇的提取能力已經達到最大,考慮生產成本等因素,選擇最佳液料比為10∶1。由圖2(b)可知,隨著乙醇體積分數的增大,磷脂得率逐漸提高,在乙醇體積分數為90%時達到最高,繼續(xù)提高乙醇體積分數,磷脂得率反而下降,可能是乙醇與磷脂反應過程中二者極性相似相溶,增加偏極性乙醇濃度,使得偏弱極性的磷脂更易與其相溶,導致磷脂提取率降低,因此選擇乙醇體積分數為90%。由圖2(c)可知,磷脂得率隨乙醇提取時間增加而增加,原因是乙醇純化磷脂的過程是固、液之間擴散的過程,延長提取時間有利于固、液充分混合;但在提取40 min后,磷脂得率反而下降,提取液中磷脂濃度隨時間的延長而升高,導致分子間傳質推動力減弱,得率下降,因此,選擇提取時間為40 min。從圖2(d)可知,磷脂得率在40 ℃時達到最大值,當溫度高于40 ℃時磷脂得率不斷下降,這是因為溫度過高導致磷脂氧化分解,因此選擇40 ℃為最佳提取溫度。

注:(a)—(d)分別為液料比、乙醇體積分數、提取時間和提取溫度對磷脂得率的影響。

2.3 乙醇純化粗磷脂響應面試驗

乙醇純化粗磷脂響應面試驗方案及結果見表1。

表1 乙醇純化粗磷脂響應面試驗方案及結果

使用Design Expert軟件,將表2中的數據進行多元回歸擬合,得到回歸方程:Y=29.01+1.91A+1.21B-1.27AC-5.59A2-4.34B2-4.14C2。從表2可以看出,整體模型的P<0.000 1,表明該模型極顯著,而失擬項P=0.597 2(P>0.05),失擬項不顯著,且該模型的R2=0.98,說明該模型與實際試驗擬合較好,可用于磷脂萃取試驗的理論預測。

表2 方差分析

由表2可知,影響磷脂得率的主次因素為A>B>C,即乙醇體積分數>浸提時間>乙醇與粗磷脂的液料比。各因素交互作用對磷脂得率的影響為AC>AB>BC,即乙醇體積分數和乙醇與粗磷脂的液料比的交互作用達顯著水平。通過軟件分析處理后獲得乙醇純化磷脂的最佳工藝條件:乙醇體積分數92%,浸提時間41 min,乙醇與粗磷脂的液料比10∶1,在此條件下,預測磷脂得率為29.11%。驗證在該處理條件下磷脂的得率,進行3次重復試驗,磷脂的實際得率為(28.72±0.68)%,接近預測值,表明上述模型是可靠的。

為再次驗證回歸模型的實用性,從乙醇體積分數、浸提時間和液料比中任意選取3組參數進行試驗,測定不同參數條件下的磷脂得率,分別為20.72%、27.28%、24.79%,同條件下的回歸方程預測值為22.04%、24.91%、21.43%。結果顯示,3組不同純化條件下驗證試驗所得的磷脂得率與回歸方程的預測值基本吻合,說明回歸模型可應用于鮑魚內臟磷脂純化試驗。

2.4 鮑魚內臟磷脂的抗氧化性研究

2.4.1 還原力

還原力是一種重要的抗氧化能力評價指標,與抗氧化性成正比關系[21]。圖3表明鮑魚內臟磷脂具有一定的還原力,且隨鮑魚內臟磷脂質量濃度的增加而增大。當樣品質量濃度為0.5 mg/mL時,在700 nm處的吸光度為0.516,相較于對照組Vc在700 nm處的吸光度1.723,鮑魚內臟磷脂的還原力略弱。

圖3 鮑魚內臟磷脂的還原力

2.4.2 羥自由基清除能力

羥自由基是極強的氧化劑,過量的羥自由基可使生物體內生物大分子如核酸、蛋白、脂質等發(fā)生氧化或過氧化,造成機體衰老甚至癌變[22-23]。鮑魚內臟磷脂對羥自由基的清除能力見圖4。羥自由基清除率隨著磷脂質量濃度的增加逐漸增大,由質量濃度與清除率關系式可得磷脂的IC50為1.37 mg/mL;Vc清除自由基能力與其質量濃度關系:y=0.172 6lnx+0.948,IC50為0.08 mg/mL,是磷脂的17倍。說明與Vc相比,鮑魚內臟磷脂的羥自由基清除能力較差。

圖4 鮑魚內臟磷脂對羥自由基清除作用

2.4.3 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基的有機溶液為紫色,最大吸收峰在波長517 nm處,當與自由基清除劑作用時,溶液由紫色變?yōu)辄S色,吸光度降低,因此可用其來評價抗氧化物的自由基清除能力[24-25]。如圖5所示,在1～300 μg/mL范圍內,鮑魚內臟磷脂對DPPH自由基的清除作用隨著磷脂質量濃度增加逐漸增大,300 μg/mL磷脂對DPPH·的清除率僅為48.63%,IC50為434.121 μg/mL;Vc清除自由基能力與其質量濃度關系:y=0.025 5lnx+0.729 2,IC50為8.99 μg/mL。說明鮑魚內臟磷脂對DPPH自由基具有一定的清除作用,但與Vc相比相對較弱。

圖5 鮑魚內臟磷脂對DPPH自由基清除作用

2.4.4 超氧陰離子自由基清除能力

超氧陰離子自由基是機體在代謝過程中產生的活性氧自由基,會導致脂質過氧化而加速機體衰老和病變[26]。鮑魚內臟磷脂對超氧陰離子自由基清除能力的測定結果如圖6所示,在0.01～1.5 mg/mL范圍內,超氧陰離子自由基清除率隨著磷脂質量濃度的增加而增加,其中IC50為0.36 mg/mL;Vc與其清除率之間的關系:y=0.401 6lnx+0.911 8,IC50為0.43 mg/mL。表明鮑魚內臟磷脂對超氧陰離子自由基有較強清除能力。

圖6 鮑魚內臟磷脂對超氧陰離子自由基清除作用

2.4.5 鮑魚內臟磷脂對不同油脂的抗氧化能力

圖7為不同添加量的鮑魚內臟磷脂和TBHQ在大豆油和菜籽油中的抗氧化能力。與空白組相比,鮑魚內臟磷脂對菜籽油、大豆油均有一定的抗氧化作用,且隨著質量濃度的增加,抗氧化作用越明顯。在兩種植物油中,磷脂添加量為0.5%時,POV較小,對油脂的抗氧化能力最強,與添加量0.02%的 TBHQ相比,二者對油脂的抗氧化作用相近,均呈現出一定的抗氧化能力。因此在生產過程中添加0.5%的磷脂能夠防止大豆油和菜籽油中過氧化脂質的產生,從而防止油脂發(fā)生腐敗變質。

圖7 鮑魚內臟磷脂對大豆油和菜籽油的抗氧化能力

3 結論

通過試驗得到了鮑魚內臟卵磷脂的最佳提取工藝條件,在該條件下磷脂得率高達(28.72±0.68)%。體外抗氧化性結果表明鮑魚內臟磷脂具有一定的羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基清除能力及還原力,這與鮑魚內臟脂質中含有豐富的不飽和脂肪酸密切相關;且在大豆油、菜籽油中均有一定的抗氧化作用,即添加0.5%的磷脂就可以對菜籽油和大豆油達到較好的抗氧化作用。本研究為更安全有效地利用鮑魚加工下腳料提供了方法,且為進一步開發(fā)利用鮑魚內臟廢棄物抗氧化性能提供科學的理論依據。但對不同品種鮑魚間磷脂的差異、純化對鮑魚磷脂抗氧化性的增效機理、鮑魚磷脂脂質體的特性都還待進一步研究。