干燥香榧假種皮精油揮發(fā)性成分、體外抗氧化活性及抑菌效果研究

劉思宇,史 瑛,陳啟和,2*

1.浙江大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)系,浙江 杭州 310058

2.浙江大學(xué) 長三角智慧綠洲創(chuàng)新中心,浙江 嘉興 314102

香榧(Torreyagrandis,T.grandis),又稱野榧、玉香果,屬于紅豆杉科榧屬植物。香榧是我國特有的一種珍貴經(jīng)濟(jì)干果類樹種,主要分布在浙、蘇、皖、閩和贛等地區(qū),浙江省諸暨市是香榧的主產(chǎn)地,有著“中國香榧之鄉(xiāng)”的美稱[1]。香榧果實(shí)因其獨(dú)特的風(fēng)味、極高的營養(yǎng)和藥用價(jià)值而深受人們的喜愛,成為市場受歡迎和有價(jià)值的干堅(jiān)果之一,并在全球范圍內(nèi)消費(fèi)[2]。

香榧果實(shí)由假種皮、外種皮和食用種子仁構(gòu)成,其中香榧假種皮是包裹在香榧果實(shí)外面的一層肉質(zhì)化結(jié)構(gòu),占新鮮果實(shí)質(zhì)量的50%～60%[3]。目前對(duì)于香榧果實(shí)的工業(yè)開發(fā)大多是將采摘的新鮮果實(shí)進(jìn)行晾曬,之后通過脫皮機(jī)將假種皮和種子分離,保留種子做進(jìn)一步的處理加工,而假種皮作為廢物被丟棄,既污染了環(huán)境又造成了資源的浪費(fèi)[4]。研究表明,香榧假種皮作為香榧加工過程中的下腳料,其富含萜類和芳香族等多種活性化合物,具有抗氧化、抑菌消炎、鎮(zhèn)咳和驅(qū)蟲等生物活性和藥用功能,是一種提取藥用活性精油和香料制品的天然原料[5]。香榧精油作為香榧假種皮的揮發(fā)性次級(jí)代謝產(chǎn)物之一,含有萜烯類、醇類、醛類、酮類和酯類等多種芳香活性成分,在清除自由基方面有較好的效果,具有體外抗氧化和抑菌活性,可作為提取高級(jí)芳香油和浸膏的天然優(yōu)質(zhì)原料[6-7]。

目前關(guān)于香榧屬植物的研究主要集中在香榧枝葉和假種皮等的化學(xué)組成及其生物活性等方面。關(guān)于香榧假種皮精油的報(bào)道多為比較不同提取方法和提取工藝對(duì)所得精油成分及含量的影響,開展香榧假種皮精油的化學(xué)物質(zhì)及生物活性功能的研究對(duì)于提高香榧假種皮的附加價(jià)值、合理開發(fā)利用我國特有的地方資源以及增加農(nóng)民經(jīng)濟(jì)收入具有積極的促進(jìn)作用。

作者采用水蒸氣蒸餾法對(duì)干燥的香榧假種皮進(jìn)行提取,利用GC-MS技術(shù)對(duì)提取得到的精油的揮發(fā)性成分及含量進(jìn)行分析,進(jìn)一步通過體外抗氧化試驗(yàn)探究了香榧假種皮精油對(duì)DPPH、ABTS和羥自由基的清除能力,評(píng)估了該精油對(duì)3種食源性致病菌(大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌)的抑制效果,以期為香榧假種皮資源的深加工和香榧精油的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

干燥香榧假種皮:浙江省諸暨市果園;無水乙醇、抗壞血酸(Vc)、過硫酸鉀:分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH):上海麥克林生化科技有限公司;2, 2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS):德國Sigma-Aldrich公司;Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、羥自由基清除能力檢測試劑盒:北京索萊寶科技有限公司。大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA 223s電子天平:德國賽多利斯有限公司;KDM水蒸氣蒸餾設(shè)備:天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠;7890B/5977A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀:美國安捷倫科技有限公司;紫外可見光分光光度計(jì):美國賽默飛世爾科技公司;GR-B2078DAH冰箱:韓國LG電子集團(tuán);OptiClean1300潔凈工作臺(tái):力康生物醫(yī)療科技控股有限公司;DK-S22電熱恒溫水浴鍋:上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;BPH-9162恒溫培養(yǎng)箱:上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 香榧假種皮精油的提取與配制

采用水蒸氣蒸餾法提取香榧假種皮精油。稱取干燥的香榧假種皮粉末100 g置于圓底燒瓶中,按料液比1∶10 (g/mL)加入去離子水,并加入沸石,組裝水蒸氣蒸餾裝置后開始加熱,循環(huán)提取6 h,收集提取器中的精油,用無水硫酸鈉干燥。提取的香榧假種皮精油密封儲(chǔ)藏在4 ℃冰箱中備用。將香榧假種皮精油按照一定比例溶于無水乙醇,混合均勻后得到質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的精油溶液。

1.3.2 香榧假種皮精油揮發(fā)性成分分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(GC-MS)分析香榧假種皮精油的揮發(fā)性成分,參考Hu等[8]的方法并稍加修改。氣相色譜條件:HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm),進(jìn)樣口溫度250 ℃,進(jìn)樣量1 μL,載氣為氦氣(99.999 5%),流速1 mL/min,分流比15∶1。升溫程序:起始溫度60 ℃,保持2 min,以5 ℃/min升至140 ℃,保持3 min,再以10 ℃/min升溫至280 ℃,保持2 min。質(zhì)譜條件:電子轟擊電離源(EI),離子源溫度230 ℃,能量電壓70 eV,質(zhì)量掃描范圍35～450m/z,全掃描模式。將獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院(NIST)、Willey質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中存儲(chǔ)的數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配鑒定精油揮發(fā)性成分,采用色譜峰面積歸一化法定量計(jì)算各成分的相對(duì)含量。

1.3.3 對(duì)ABTS自由基清除能力的測定

參考Zhu等[9]的方法并稍加修改。將7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L的過硫酸鉀等體積混合反應(yīng),并在室溫黑暗條件下靜置12 h,得到ABTS+儲(chǔ)備液。用無水乙醇稀釋ABTS+儲(chǔ)備液至734 nm處的吸光度為0.700±0.050,得到ABTS+工作液。在5 mL試管中加入1 mL ABTS+工作液和3 mL無水乙醇,混合均勻后置于室溫黑暗條件下反應(yīng)30 min,于734 nm處測定吸光度,記為A0。將1 mL ABTS+工作液、1 mL不同質(zhì)量濃度的精油樣品以及2 mL無水乙醇依次加入試管中,渦旋混勻后在室溫黑暗條件下反應(yīng)30 min,于734 nm處測定吸光度,記為A。用相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸(Vc)作為陽性對(duì)照,每個(gè)樣品做3個(gè)平行。

ABTS自由基清除率=(A0-A)/A0×100%。

1.3.4 對(duì)DPPH自由基清除能力的測定

參考Sun等[10]的方法并稍加修改。用無水乙醇配制 0.2 mmol/L 的DPPH工作液。在5 mL試管中加入1 mL DPPH溶液和1 mL無水乙醇,混合均勻后置于室溫黑暗條件下反應(yīng)30 min,于517 nm處測定吸光度,記為A0。將1 mL DPPH 溶液和1 mL不同質(zhì)量濃度的精油樣品加入試管中,渦旋混勻后在室溫黑暗條件下反應(yīng)30 min,于517 nm處測定吸光度,記為A。用相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸(Vc)作為陽性對(duì)照,每個(gè)樣品做3個(gè)平行。

DPPH自由基清除率=(A0-A)/A0×100%。

1.3.5 對(duì)羥自由基清除能力的測定

H2O2將鄰二氮菲-Fe2+水溶液中的Fe2+通過Fenton反應(yīng)氧化為Fe3+,并產(chǎn)生羥自由基,從而導(dǎo)致536 nm處的吸光度下降,而吸光度下降速率的抑制程度反映了樣本清除羥自由基的能力。參照試劑盒說明書進(jìn)行操作,將檢測試劑依次加入1.5 mL EP管中,充分混勻后加入150 μL不同質(zhì)量濃度的精油樣品,渦旋混勻后置于37 ℃水浴鍋中反應(yīng)60 min。在常溫條件下10 000 r/min離心10 min,取上清液測定536 nm處的吸光度。用不加樣品的蒸餾水體系作為空白組,不加樣品的反應(yīng)體系作為試驗(yàn)對(duì)照組,加樣品的反應(yīng)體系作為試驗(yàn)組,每個(gè)樣品做3個(gè)平行。

羥自由基清除率=(A-A1)/(A0-A1)×100%,

式中:A0、A1、A分別為空白組、對(duì)照組、試驗(yàn)組在536 nm處的吸光度。

1.3.6 香榧假種皮精油的抑菌試驗(yàn)

采用牛津杯法測定不同樣品對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的抑菌圈,評(píng)估不同質(zhì)量濃度的香榧假種皮精油的抑菌效果。參考曾琳等[11]的方法并稍加修改。挑取3株供試菌于LB固體培養(yǎng)基中分別進(jìn)行活化,然后挑取適量菌種接種于4 mL的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后將供試菌液稀釋至濃度為106CFU/mL。取150 μL各供試菌懸液于LB固體培養(yǎng)基中,用涂布棒涂布均勻,待微干后在平板表面放置牛津杯(直徑8 mm),將100 μL不同質(zhì)量濃度的香榧假種皮精油加入牛津杯,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用無水乙醇做空白對(duì)照,每組做3個(gè)平行,測量各抑菌圈直徑。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以“平均值±偏差”表示,采用Excel 2019、SPSS 26.0及Origin 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 香榧假種皮精油揮發(fā)性成分分析

通過GC-MS對(duì)干燥香榧假種皮精油的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析,精油的GC-MS總離子流圖如圖1所示。表1列出了香榧假種皮精油中的揮發(fā)性成分及其含量,共鑒定得到45種化合物,包括萜烯類、醇類、醛類和酮類等化合物。香榧假種皮精油中有19種萜烯類化合物(69.90%)、14種醇類(22.62%)、4種酮類(2.29%)、1種烷烴(2.34%)、4種醛類(1.51%)、1種酯類(0.49%)和2種其他化合物(0.85%)。萜烯是香榧假種皮精油中含量最豐富的芳香族化合物,具有揮發(fā)性香味的萜烯包括單萜烯和倍半萜烯,它們與風(fēng)味感知和消費(fèi)者接受度密切相關(guān),有研究表明高濃度萜烯的存在可能會(huì)導(dǎo)致精油出現(xiàn)苦味[12]。對(duì)萜烯含量的進(jìn)一步分析結(jié)果表明,單萜烯是前段精油的主要成分,倍半萜烯則在中段精油中占據(jù)主要地位,這與李彪等[6]的研究結(jié)果一致。

表1 干燥香榧假種皮精油的揮發(fā)性化合物及其含量

在香榧假種皮精油的揮發(fā)性成分中,3-蒈烯和D-檸檬烯是主要的化合物,其含量分別占總揮發(fā)性化合物的26.20%和15.11%。3-蒈烯存在于大部分花果類植物和某些中草藥中,具有強(qiáng)烈的松木樣香氣,有較好的抗菌抗炎作用,可作為天然食品用香料直接使用,也可作為中間體原料合成具有生物活性的藥物[13]。D-檸檬烯是柑橘類水果的成分,具有橙子般的果香味,已經(jīng)證明其對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)的嚙齒動(dòng)物乳腺癌、肺癌和胃癌具有顯著的化學(xué)預(yù)防和化療活性,同時(shí)還抑制多種食品相關(guān)微生物的生長,如金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和腸道沙門氏菌等[14-15]。此外,δ-杜松醇、δ-杜松烯、桉油烯醇和β-古巴烯在香榧假種皮精油中的含量也相對(duì)較高,分別為8.16%、7.57%、4.62%和3.74%,這些揮發(fā)性化合物都具有較強(qiáng)的植物芳香氣味,具有提神消炎、抗菌殺蟲等生物活性[16-17]。

2.2 對(duì)DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的自由基,是樣本抗氧化能力的重要指標(biāo)之一,被廣泛用于測定各種天然化合物的抗氧化活性。DPPH自由基的中心氮原子上有一個(gè)未成對(duì)的單電子,其醇溶液呈紫色,在517 nm波長處有強(qiáng)吸收。當(dāng)有抗氧化劑存在時(shí),DPPH自由基能接受抗氧化劑的電子或氫,形成穩(wěn)定的產(chǎn)物,反應(yīng)體系顏色變淺,吸光度下降,因此其吸光度的降低與自由基被清除的能力呈正相關(guān)[5,18]。由圖2可知,在相同的質(zhì)量濃度下,Vc清除DPPH自由基的能力要強(qiáng)于干燥香榧假種皮精油。隨著香榧假種皮精油質(zhì)量濃度的增加,對(duì)DPPH自由基的清除率逐漸提高,這與孫君燕[19]報(bào)道的結(jié)果一致。在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi),1.0 mg/mL的香榧假種皮精油對(duì)DPPH自由基的清除作用最強(qiáng),為74.82%±1.58%。利用SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果表明干燥香榧假種皮精油對(duì)DPPH自由基的清除能力與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān),皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.956(P<0.01)。香榧假種皮精油對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除率濃度(IC50)為0.55 mg/mL。研究表明植物精油中的醇類和酚類化合物一定程度上可以淬滅多數(shù)已知的自由基,烯類化合物如α-松油烯具有很強(qiáng)的DPPH自由基清除活性,因此香榧假種皮精油具有較好的DPPH自由基清除能力可歸因于其含有豐富的烯萜類和醇類化合物[20]。

注:同一曲線上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3和圖4同。

2.3 對(duì)ABTS自由基清除能力的測定

ABTS抗氧化能力的測定是目前使用最廣泛且最受歡迎的間接檢測法,其測定的基礎(chǔ)是ABTS被氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽離子自由基ABTS+,在734 nm處有強(qiáng)吸收[21]。當(dāng)被測物質(zhì)中含有抗氧化成分時(shí),能將預(yù)先形成的ABTS+還原,從而導(dǎo)致反應(yīng)體系顏色變淺,吸光度下降,因此其吸光度的降低與自由基被清除的能力呈正相關(guān)[22]。由圖3可知,在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi),Vc對(duì)ABTS自由基的清除率均在80%以上,且隨著質(zhì)量濃度的增加逐漸趨于平衡。盡管在同一質(zhì)量濃度下,香榧假種皮精油對(duì)ABTS自由基的清除率低于Vc,但隨著質(zhì)量濃度的增加,香榧假種皮精油對(duì)ABTS自由基的清除能力不斷增強(qiáng),在1.0 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到最高。利用SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果表明干燥香榧假種皮精油對(duì)ABTS自由基的清除能力與質(zhì)量濃度呈正相關(guān),皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.966(P<0.01)。香榧假種皮精油對(duì)ABTS自由基的清除表現(xiàn)出較好的量效關(guān)系,IC50為0.29 mg/mL。

圖3 干燥香榧假種皮精油對(duì)ABTS自由基的清除率

2.4 對(duì)羥自由基清除能力的測定

羥自由基是一種對(duì)生物體毒性強(qiáng)、危害大的自由基,可以與細(xì)胞膜磷脂的多不飽和脂肪酸反應(yīng),對(duì)人體細(xì)胞造成氧化性損傷和破壞[23]。由圖4可知,在質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時(shí),干燥香榧假種皮精油對(duì)羥自由基已具有一定的清除能力,其清除率為(47.66±1.67)%。在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi),香榧假種皮精油的羥自由基清除率隨著質(zhì)量濃度的增加不斷升高,在1.0 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到最高。利用SPSS軟件進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果表明干燥香榧假種皮精油對(duì)羥自由基的清除能力與質(zhì)量濃度呈正相關(guān),皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.936(P<0.01)。香榧假種皮精油對(duì)羥自由基的IC50為0.32 mg/mL。研究表明萜烯類化合物具有兩個(gè)或兩個(gè)以上的雙鍵,是反應(yīng)活性很強(qiáng)的一類化合物,可與羥自由基等迅速反應(yīng)為二級(jí)基團(tuán),有一定的羥自由基清除作用[24]。因此香榧假種皮精油較強(qiáng)的羥自由基清除能力可能與其含有大量的單萜烯、倍半萜烯和二萜烯類化合物有關(guān)。

圖4 干燥香榧假種皮精油對(duì)羥自由基的清除率

2.5 香榧假種皮精油的抑菌效果

大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌是3種常見的食源性致病菌,是威脅食品安全的主要危害因子,采用牛津杯法測定了干燥香榧假種皮精油對(duì)這3種食源性致病菌的抑制效果,結(jié)果如表2所示。從表2可以看出,香榧假種皮精油對(duì)3種菌均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用,與無水乙醇對(duì)照組的差異顯著(P<0.05)。通過比較抑菌圈直徑可以發(fā)現(xiàn),在同一質(zhì)量濃度下,蠟樣芽孢桿菌對(duì)香榧假種皮精油最為敏感,其次是大腸桿菌,金黃色葡萄球菌對(duì)香榧假種皮精油的敏感度相對(duì)較弱。革蘭氏陽性細(xì)菌一般比革蘭氏陰性細(xì)菌對(duì)植物精油的敏感性更高,但也有諸多例外,這是由于不同精油含有的成分會(huì)對(duì)革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌表現(xiàn)出不同程度的活性[25-27]。在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi),香榧假種皮精油的抑菌效果隨著質(zhì)量濃度的增加而有所提高,相關(guān)性分析結(jié)果表明,干燥香榧假種皮精油對(duì)大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果與質(zhì)量濃度呈正相關(guān),皮爾遜相關(guān)系數(shù)分別為0.916(P<0.01)、0.930(P<0.01)和0.827(P<0.01)。1.0 mg/mL的干燥香榧假種皮精油對(duì)3種菌的抑菌活性均最強(qiáng)。研究表明植物精油具有較強(qiáng)的抑菌活性,這與其成分中含有的萜烯類、醛類和酚類化合物密切相關(guān)[27]。Umagiliyage等[28]指出D-檸檬烯可以有效抑制微生物的生長,其可能的機(jī)制包括改變細(xì)胞壁的性質(zhì),刺激與細(xì)胞壁完整性信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá),從而對(duì)細(xì)胞分裂產(chǎn)生負(fù)面影響。因此香榧假種皮精油具有較好的抑菌效果可歸因于其含有豐富的萜烯類和醛類化合物。

3 結(jié)論

從水蒸氣蒸餾法所得干燥香榧假種皮精油中共鑒定出45種揮發(fā)性化合物,包括萜烯類、醇類、醛類和酮類等,主要成分為3-蒈烯(26.20%)、D-檸檬烯(15.11%)、δ-杜松醇(8.16%)和δ-杜松烯(7.57%)。干燥香榧假種皮精油具有較好的體外抗氧化活性,且對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基和羥自由基的清除能力與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。此外,該精油具有明顯的抑菌作用,其抑菌效果隨著質(zhì)量濃度的增加而提高,3株食源性致病菌對(duì)同一質(zhì)量濃度的香榧假種皮精油的敏感程度為蠟樣芽孢桿菌>大腸桿菌>金黃色葡萄球菌。干燥香榧假種皮精油具有良好的體外抗氧化活性和抑菌活性,可能與其含有豐富的烯萜類、醇類、醛類和酮類化合物有關(guān)。作為一種天然的抗氧化劑和抑菌劑,香榧假種皮精油在功能性食品、抗氧化化妝品以及植物殺菌劑等領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用價(jià)值和開發(fā)潛力。