植物甾醇負載的脂基納米粒子的制備及表征

郭姝婧,汪學德,胡毓元,王 童,

河南工業大學 糧油食品學院,河南 鄭州 450001

植物甾醇是存在于植物細胞膜中的一類天然甾體化合物,因其具有抗癌[1]、抗炎[2],特別是降膽固醇功效[3-5]而被人們廣泛關注。研究表明,每天攝取1～3 g植物甾醇可降低人體血膽固醇10%左右,有效預防心血管疾病[6],但人們從日常膳食中獲取的甾醇量很難達到這一標準。因此,將植物甾醇富集到功能強化食品中,是增加其攝入量并獲得健康益處的有效策略。目前,對植物甾醇進行親脂酯化是一種比較通用的方法,但這僅限于在高脂食品體系中遞送甾醇[7]。近年來,也有研究嘗試對植物甾醇進行親水改性[8],但需要使用大量有機試劑,為食品安全帶來隱患。膠體傳輸技術逐漸引起人們的關注,利用納米級的載體遞送甾醇不僅可以改善其水分散性差、結晶度高等問題,還可以提高植物甾醇在人體的生物可及性和利用度,是一種極具應用前景的技術[9]。

脂基納米粒子是一種先進的膠體傳輸載體,由脂質核心(固體或固液混合)和表面活性劑外層組成,脂質核心有利于其對疏水性活性成分的封裝,表面活性劑外層使其可以穩定地分散在水環境中,擴展疏水活性成分在食品體系中的應用范圍[10-11]。此外,脂基納米粒子還具有制備方法簡易、適合大量生產、生物相容性好等特點,可作為植物甾醇的理想遞送載體[12]。目前,關于利用脂基納米粒子遞送植物甾醇的研究十分有限,且多集中在傳統的制備方法和非極性脂質配方等方面[13]。

脂基納米粒子通常采用熱高壓均質技術制備[14],即先將溶解活性成分的熱脂質相分散在含有表面活性劑的溶液中制成熱乳液,再利用高壓均質處理,最終冷卻獲取納米級脂基粒子。然而高壓均質能耗大,操作不夠簡潔,且樣品處理量大時易造成堵塞。另外,鑒于甾醇分子結構上含有醇羥基,在傳統的非極性脂質中溶解度偏低,采用甘油三酯基質不易獲得高負載率的植物甾醇納米粒子。因此,作者采用乳液模板法-超聲聯用制備負載植物甾醇的脂基納米粒子,超聲處理同樣具有減小粒子尺寸的功能且便于操作,再加上空穴效應有利于對納米粒子進一步修飾,可作為一種新型制備脂基納米粒子的方法[15]。另外,選用具有一定兩親性的單硬脂酸甘油酯(GMS)作為脂質基質,可通過測試包封率研究該配方對植物甾醇負載效果,并對制備的納米粒子進行微觀結構表征及潤濕性測試。脂基納米粒子的開發為實現植物甾醇在水系功能食品體系中的高濃度遞送帶來了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物甾醇(總甾醇含量>95%,其中菜油甾醇24.82%、豆甾醇24.98%、β-谷甾醇43.28%):西安海斯夫生物科技有限公司;單硬脂酸甘油酯(95%)、大豆卵磷脂(>90%):上海麥克林生化有限公司;正己烷、無水乙醇、甲酸(色譜級)、無水甲醇(色譜級):天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Ultra-Turrax T10 basic高速剪切機:德國IKA公司;Scientz-ⅡD超聲波細胞粉碎儀:寧波新芝生物科技股份有限公司;Zetasizer Nano S90分析儀:英國馬爾文儀器有限公司;HT 7700透射電子顯微鏡:日本Hitachi公司;Agilent 1260高效液相色譜儀:美國安捷倫科技公司;BSA224S電子天平:北京賽多利斯科學儀器有限公司;GL-10000C離心機:上海安亭科學儀器廠;DK-FD10冷凍干燥機:山東博科科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 負載植物甾醇的脂基納米粒子的制備

采用乳液模板法-超聲聯用制備負載植物甾醇的脂基納米粒子。稱取100 mg植物甾醇加入1 g GMS中,加熱至85 ℃,磁力攪拌使固體物質全部溶解;含有0.8%表面活性劑(卵磷脂)的25 mL水溶液加熱至85 ℃。將上述兩相混合,用高速剪切機以24 000 r/min均質5 min,所得初乳液分別進行不同時間(2、4、6、8、10 min)和不同功率(0、60、120、180、240 W)的超聲處理(間隔2 s開2 s),然后將納米乳液分散在25 mL水中冷卻,冷卻方式選擇急速和緩慢,最終制備一系列負載植物甾醇的脂基納米粒子分散液。

表面活性劑的影響:選擇0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%的表面活性劑,其他條件不變制備納米粒子,測試對粒徑、多分散指數(PDI)、Zeta電位和包封率的影響。

甾醇添加量的影響:選擇添加100、150、200、250、500 mg的甾醇,其他條件不變制備納米粒子,測試對粒徑、PDI、Zeta電位和包封率的影響。

1.3.2 粒徑、PDI、Zeta電位的測定

采用動態光散射(DLS)法測定樣品的平均粒徑、PDI、Zeta電位。為避免多次散射效應,每個原始樣品用去離子水稀釋50倍,并在測試前25 ℃保持3 min。

1.3.3 植物甾醇包封率的測定

參照文獻[16]的方法并稍加改動,將4 mL分散液與3 mL正己烷混合,然后渦旋30 s,提取納米粒中未被包封的植物甾醇。混合物以3 000 r/min離心3 min,收集上層有機相。重復上述操作2次以充分提取未被包封的甾醇。將所有收集的有機相合并,并氮吹干燥。所得干物質用1 mL無水乙醇復溶,過0.45 μm有機濾膜以進行高效液相色譜(HPLC)分析。

HPLC分析條件參照文獻[17],用標樣確定植物甾醇中各組分的保留時間,對所得植物甾醇的所有色譜峰積分,根據標準曲線確定植物甾醇含量。

包封率=(m1-m2)/m1×100%,其中,m1為樣品中添加的總甾醇質量(mg),m2為未被包封的甾醇質量(mg)。

1.3.4 透射電子顯微鏡(TEM)觀察微觀結構

采用透射電子顯微鏡觀察樣品的形態學特征。在200目的銅網上滴約20 μL樣品分散液,干燥后用磷鎢酸染色,然后在100 kV的加速電壓下進行觀察。

1.3.5 靜態接觸角測試

使用光學接觸角測量儀分別測定植物甾醇和負載植物甾醇的脂基納米粒子(凍干后)的接觸角。首先利用紅外壓片機將樣品壓成薄片,通過注射器在樣品表面釋放出一個水滴,然后使用儀器配備的分析軟件測量水滴切面與樣品平面的夾角。

1.4 數據處理

所有試驗至少重復2次,數據用平均值±標準差表示。使用SPSS 24進行顯著性分析,使用Origin 8.5制圖。

2 結果與分析

2.1 納米粒子的制備及條件優化

不同條件下制備的植物甾醇-脂基納米粒子的粒徑、PDI和Zeta電位如圖1所示。由圖1(a)可以看出,納米粒子粒徑隨著超聲時間的延長先減小后增加,其中4 min時的粒徑最小,可能是因為超聲時間過長導致納米粒子之間又重新發生了聚集。圖1(b)則顯示超聲可使粒子所帶負電荷減少,可能是由于超聲產生的空化效應使粒子的水化層減少,電位降低。斥力的減小逐漸造成部分粒子團聚,導致粒徑增大,說明電位結果與粒徑結果相一致。但總體來說,電位絕對值在30 mV以上時,粒子通常都可以通過靜電排斥滿足自身穩定性[18]。圖1(c)顯示4種超聲功率下,粒徑無明顯差別,但都比無超聲時明顯降低,超聲處理顯然有助于獲得粒徑更小的納米粒子。未經超聲處理的樣品粒徑在180 nm以上,而經超聲后獲得的粒子粒徑為120～140 nm,比文獻[19-20]報道的用高壓均質獲得的脂質納米粒子的粒徑更小,說明利用超聲處理制備脂基納米粒子具有很好的應用和發展前景。值得注意的是,超聲處理似乎更適合小批量的試驗性研究,再加上超聲產生的空穴效應有利于對納米粒子進一步修飾,因此可作為研究和開發新型脂基納米粒子的方法,與適合大批量生產的高壓均質相互配合。由圖1(d)可知,超聲后納米粒子帶電量降低,與超聲時間的結果相一致。圖1(e)和(f)表明冷卻方式也會對納米粒子的粒徑和電位產生影響,速冷的制備時間縮短,有效地阻止了納米粒子聚集,更符合對負載植物甾醇的脂基納米粒子的需求。另外,PDI結果顯示所有制備的納米粒子都具有良好的均一性,PDI在0.2以下說明此時的體系已經接近單分散體系,這與樣品半透明甚至透明的外觀結果一致。以上結果表明負載植物甾醇的脂基納米粒子已成功制備。

2.2 表面活性劑

表面活性劑是構成脂基納米粒子外層并將其穩定在水環境中的關鍵。表面活性劑含量對負載植物甾醇的脂基納米粒子的影響如表1所示。磷脂含量增加有利于獲得粒徑小、均一度和包封率高的納米粒子,而Zeta電位的差別不大。磷脂含量增加有利于其包覆在更多的油滴表層,在均質過程中得到更小的納米乳滴,從而在冷卻后得到粒徑更小的納米粒子。磷脂添加量大于0.8%,納米粒子的結構逐漸趨于穩定,其包封率也都達到了99%以上。

表1 磷脂含量對納米粒子粒徑、PDI、Zeta電位、包封率的影響

2.3 甾醇添加量

為了研究以GMS為基質的脂基納米粒子對植物甾醇的包封能力,制備了不同甾醇添加量的納米粒子。由表2可知,隨著甾醇添加量的增加,粒徑也開始增大,說明更多的甾醇進入納米粒子中(甚至有一些附著在粒子外層)。不過粒徑在200 nm以內的分散液通常具有良好的物理穩定性以及半透明甚至透明外觀等優點[21],加上PDI和Zeta電位并沒有明顯變化,可見甾醇添加量的增加對于納米粒子結構的影響較小。從包封率來看,隨著甾醇添加量的增加,雖然脂質基底對于甾醇的負載能力逐漸下降,但總體都大于90%,這已經是非常高效的封裝。據報道,植物甾醇在水中的溶解度極差,僅為10-3～10-2mmol/L,即每毫升水中溶解植物甾醇的毫克數在10-4～10-3數量級[22]。根據本研究的甾醇添加量計算,以GMS為脂質基質的納米粒子將植物甾醇在水中的濃度提高到了幾毫克每毫升。GMS的兩親性或許是該納米粒子優異性質及高負載率的重要原因,它可以對同樣結構特點的植物甾醇表現出良好的相容性。此外,由于GMS有抑制植物甾醇結晶的作用,納米粒子的形成更是使甾醇以無定型形式存在[23]。據報道,0.3 g無定型植物甾醇可降低膽固醇水平約37%[24],因此,GMS納米載體有望實現在水系功能食品(如飲料)中添加植物甾醇并使其發揮令人滿意的降膽固醇效果。

表2 甾醇添加量對納米粒子粒徑、PDI、Zeta電位、包封率的影響

2.4 植物甾醇-脂基納米粒子的微觀形貌

用TEM觀察樣品的微觀形態,如圖2所示,負載植物甾醇的脂基納米粒子呈均勻分散的球形,粒徑為100～200 nm,與DLS測試結果一致。圖2(b)顯示納米粒子外有一層亮圈包圍,這可能是磷脂乳化劑層。

注:磷脂0.8%、甾醇添加量100 mg。圖3同。

2.5 植物甾醇-脂基納米粒子的水分散性

圖3(a)顯示樣品很好地分散在水中,在質量濃度為10 mg/mL時,分散液仍然呈半透明。而天然植物甾醇加入水中只能浮在水面上,即使超聲處理后仍然沒有明顯變化。由圖3(b)看出植物甾醇表現出明顯的疏水性,而納米粒子的接觸角為81.8°(<90°),說明其在水中潤濕性較好,能夠很好地分散。良好的水分散性表明負載植物甾醇的脂基納米粒子也可以作為固體沖劑添加到食品體系中,有利于樣品的儲藏。

注:(a)復溶后照片;(b)接觸角。植物甾醇為對照。

3 結論

單硬脂酸甘油酯對于植物甾醇具有很好的相容性,以其作為脂質基質可以制備高負載率(甾醇添加量100～500 mg時包封率均大于90%)的植物甾醇-脂基納米粒子。適當的超聲(時間4 min,功率120 W)有助于獲取粒徑更小的納米粒子,使納米粒子分散液呈半透明甚至透明的狀態。TEM照片顯示納米粒子外層由磷脂乳化劑穩定,因此可以更好地分散在水環境中。此外,脂基納米載體增加了植物甾醇在水中的潤濕性,使樣品在凍干后仍然具有較好的水分散性。然而,要想實現植物甾醇-脂基納米粒子在水系功能食品中的應用,仍有許多問題需要深入探究,比如納米粒子的穩定性,脂質基質對植物甾醇釋放及生物可及性的影響。