基于Y型DNA結構和磁分離的熒光生物傳感器同時檢測Pb2+和Cd2+

馬 軍,郭 蕊*,毋培培,丁國濤,游 靜,梁瑞瑞,索志光*

1.河南省產品質量檢驗技術研究院, 河南 鄭州 450002

2.河南工業大學 糧油食品學院,河南 鄭州 450001

重金屬離子具有分布廣泛、蓄積性和高毒性等特征,生物危害性較強。調查研究發現,包括Pb2+、Cd2+在內的多種重金屬經常共存于食物和生物系統中[1]。Pb2+作為最危險的重金屬之一,機體攝入主要導致神經系統紊亂、肝腎疾病、生育能力下降[2]。國際癌癥研究機構(IARC)已在1993年將鎘列為第Ⅰ類人類致癌物[3]。研究表明,呼吸系統疾病及腎臟疾病的發生與Cd2+關系密切[4]。飲用水中Pb2+和Cd2+的最大允許濃度為世界衛生組織(WHO)所規定的48 nmol/L和27 nmol/L[5]。有學者在水果和蔬菜樣品中發現Pb2+、Cd2+及Hg2+等重金屬離子共存,濃度較多在100～200 nmol/L范圍內[6]。因此,迫切需要開發靈敏有效的方法對多種重金屬離子進行同時檢測。

目前,常采用原子吸收光譜(AAS)[7]、電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)[8]、電感耦合等離子體原子發射光譜(ICP-AES)[9]或者與高效液相色譜相結合[10]的方法對Pb2+和Cd2+進行檢測。上述傳統檢測方法依賴大型精密儀器,存在操作費時費力、儀器昂貴復雜、無法實時檢測等缺點[11]。因此,建立靈敏、可靠、便捷的方法同時檢測和定量兩種或兩種以上的重金屬離子具有重要意義。

適配體(Aptamer,Apt)是通過指數富集配體進化技術從體外篩選出的單鏈寡核苷酸序列(DNA或RNA),能特異性識別靶標并形成特殊的二級結構[12]。有研究報道,金屬類靶標分子通常與適配體的嘌呤和嘧啶基團上帶負電的部分結合而被識別[13]。核酸酶(DNAzyme)是具有催化活性的DNA或RNA分子,大多數DNAzyme需要金屬離子作為輔助因子才能表現出催化活性[14]。兩者作為功能核酸中的兩大類,相比抗體、多肽等其他生物識別元件,以特異性強、穩定性好和易于設計修飾等優點而被廣泛使用。

功能核酸通常與不同信號轉換方式相結合構建出不同類型的生物傳感器,實現對靶標的定性和定量分析。其中,比色、光電化學及電化學生物傳感器存在準確度低和耗時等缺點,而熒光生物傳感器具備靈敏度高、成本低、操作方便、效率高的優勢,更適用于金屬離子的檢測。近年來,已經報道了許多用于食品及環境中重金屬離子檢測的熒光生物傳感器[15-16]。利用DNA的可編程性設計而成的高階結構往往具有優異的機械剛度和穩定性,如Y型和四面體型DNA納米結構。這些結構已經被運用到熒光生物傳感器的構建當中,有利于實現目標物的多重檢測[17]。根據均一體系中熒光基團與猝滅基團之間的熒光共振能量轉移作用所構建的熒光傳感器往往存在背景信號高、成本昂貴的缺點[18]。利用磁性材料——磁珠(Magnetic beads, MBs)的固載和磁分離能力不僅能起到降低背景信號、增強靈敏度的作用,還能在不使用猝滅基團的情況下,實現靶標存在時熒光信號的變化[19-20]。

作者利用特異性高、穩定性好、易于修飾的適配體和DNAzyme對靶標進行識別,Y型DNA結構的設計可以實現雙目標物的同時檢測,MBs的使用不僅可以減少成本,還可以降低背景信號,提高檢測的靈敏度。基于以上策略所設計的熒光生物傳感器,操作簡便、靈敏度高且穩定性好,可用于實際樣品中Pb2+和Cd2+的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

Cd2+的核酸適配體(Apt-FAM): 5’-GGA CTG TTG TGG TAT TAT TTT TGG TTG TG-FAM-3’;Pb2+DNAzyme的底物鏈(Cy5-S-DNA): 5’-Cy5-TTC CAC TAT rA GGA AGA GATTAC AGT CCA AAA AA-(CH2)6-bio-3’、酶鏈(E-DNA): 5’-ATA ATA CCA CTA TCT CTT CTC CGA GCC GGT CGA AAT AGT GGA A-3’(其中下劃線部分為Cd2+適配體的互補序列),由上海生工生物工程有限公司合成。鏈霉親和素包被的磁珠(Streptavidin-MBs,粒徑300 nm、10 mg/mL):蘇州海貍生物醫學工程有限公司。礦泉水、綠茶飲料、皮蛋:鄭州永輝超市。茶葉(編號CFAPA-QC485A)和海帶樣品(編號GB/T 5009.12—2017):河南省產品質量檢驗技術研究院。

1.2 試劑與儀器

Pb(NO3)2:天津市科密歐化學試劑有限公司;Cd(NO3)2·4H2O:上海金山亭新化工試劑廠;G9800A熒光分光光度計:安捷倫(馬來西亞)。

1.3 試驗方法

1.3.1 傳感器的制備及同時檢測Pb2+、Cd2+

取5 μL鏈霉親和素包被的MBs置于200 μL離心管中,用50 μL磁珠清洗液清洗3次。將1 μmol/L 生物素(Biotin)修飾的S-DNA 20 μL以及10 mmol/L Tris緩沖液5 μL加入上述離心管中,充分渦旋混勻之后置于37 ℃振蕩孵育1 h,通過鏈霉親和素與生物素之間的特異性結合,使S-DNA固定在MBs表面,獲得MBs@S-DNA;與此同時,將1 μmol/L E-DNA和Apt各20 μL加入另一個離心管中,同樣37 ℃振蕩孵育1 h,獲得E-DNA@Apt。隨后,將第2個離心管中40 μL溶液加入第1個離心管中,混勻,37 ℃孵育1 h。混合物經磁分離并洗滌3次,制備出固載在MBs上的Y型DNA結構,即MBs@S-DNA/E-DNA@Apt體系。

向MBs@S-DNA/E-DNA@Apt體系中分別加入2 μL終濃度為1 μmol/L的Pb2+、Cd2+溶液以及6 μL Tris緩沖溶液,充分渦旋混勻后37 ℃孵育30 min,反應物進行磁分離,保留上清液,并用Tris緩沖溶液補充至200 μL,在室溫下進行熒光掃描。設置激發波長480 nm,發射波長500～600 nm,記錄在520 nm處FAM的熒光強度,同理,設置激發波長625 nm,發射波長645～750 nm,記錄在664 nm處Cy5的熒光強度。

1.3.2 實際樣品處理

礦泉水和綠茶飲料不進行預處理。采用微波消解法對皮蛋進行預處理,精確稱取1.000 0 g皮蛋,與8 mL硝酸和2 mL過氧化氫加入微波消化爐的消化罐中。微波消化爐的反應溫度、壓力、加熱時間和保溫時間分別設置為180 ℃、2.8×106Pa、12 min、10 min。消化結束后,將含有消化溶液的消化罐在電加熱板(160 ℃)上加熱,排酸,然后室溫冷卻,用超純水定容至10 mL。將Pb2+和Cd2+標準溶液分別與礦泉水、綠茶飲料及皮蛋樣品混合進行加標回收試驗,使傳感體系中Pb2+和Cd2+的終濃度均為1、10、50 μmol/L。

1.4 數據處理與分析

采用SPSS 26進行數據處理與分析,采用Origin 2021制圖。

2 結果與分析

2.1 基于Y型DNA結構和磁分離的熒光生物傳感器同時檢測Pb2+、Cd2+的原理

如圖1所示,首先通過生物素和鏈霉親和素的強結合作用,將生物素修飾的S-DNA固定在包被有鏈霉親和素的MBs上,得到MBs@S-DNA結構。同時,包含有Cd2+適配體互補序列的E-DNA與Cd2+適配體通過堿基互補配對形成雙鏈,獲得E-DNA@Apt結構。然后將MBs@S-DNA體系與E-DNA@Apt體系充分混合,S-DNA中一部分序列與E-DNA進行堿基互補配對構成Pb2+DNAzyme,另一部分序列與Cd2+的Apt結合,進而雜交形成穩定的Y型DNA結構,即MBs@S-DNA/E-DNA@Apt,該傳感器制備成功。

圖1 基于Y型DNA結構和磁分離的熒光生物傳感器同時檢測Pb2+、Cd2+的原理示意圖

當傳感體系中不存在Pb2+和Cd2+時,DNAzyme的rA位點不會被激活,Cd2+的Apt與其兩段互補序列仍然緊密結合,Cy5和FAM熒光基團分別位于Y型DNA結構的兩分支端。經磁分離,所得上清液中Cy5和FAM熒光信號較弱;當Pb2+和Cd2+并存于傳感體系中時,rA位點能夠特異性識別Pb2+,導致S-DNA發生裂解并釋放出5’端標記有Cy5的ssDNA,同時,Cd2+與標記有FAM的Apt特異性結合使其從傳感器中脫離,這是由于Cd2+與胸腺嘧啶(T)和鳥嘌呤(G)堿基上的O和N發生配位造成的[21]。磁分離后,上清液中Cy5和FAM熒光信號明顯增強。通過Cy5與FAM的熒光信號的變化,可以實現對Pb2+和Cd2+的同時檢測。

2.2 傳感器同時檢測Pb2+和Cd2+的可行性分析

圖2中不同的熒光光譜表征了該傳感器檢測Pb2+和Cd2+時熒光信號的變化情況。初始狀態下,Cy5和FAM分別隨S-DNA和Apt位于Y型DNA結構中,并與MBs一起從溶液中分離,上清液中只能檢測到較弱的Cy5和FAM熒光強度(圖2(a))。當向傳感體系中加入不含Pb2+及Cd2+的緩沖溶液時,可以看到Cy5和FAM的熒光強度沒有明顯變化(圖2(a))。當傳感體系中僅存在Pb2+時,所獲得的熒光光譜中Cy5的熒光強度明顯增加,而FAM的熒光強度沒有明顯變化(圖2(b)),說明Pb2+激發DNAzyme對S-DNA進行剪切,標記有Cy5的ssDNA從Y型DNA結構中釋放,而Cd2+適配體沒有脫離結構,隨MBs一起被分離。當傳感體系中僅存在Cd2+時,FAM的熒光強度明顯增強,而Cy5的熒光強度未發生明顯變化,表明Cd2+與標記有FAM的Apt特異性結合形成了Cd2+-Apt復合物,使Apt構象發生改變,從Y型DNA結構中脫離,而Pb2+-DNAzyme結構仍固定在MBs表面(圖2(c))。當Pb2+及Cd2+均存在于傳感體系中時,Cy5和FAM的熒光強度都明顯增加,說明Pb2+誘導的ssDNA和Cd2+-Apt復合物均脫離了Y型DNA結構(圖2(d))。因此,根據加入Pb2+和Cd2+前后上清液中Cy5和FAM的熒光強度變化,可以實現對Pb2+和Cd2+的同時檢測。

注:(a)Pb2+和Cd2+均不存在;(b)Pb2+存在,而Cd2+不存在;(c)Cd2+存在,而Pb2+不存在;(d)Pb2+和Cd2+均存在;CPb2+=CCd2+=1 μmol/L。曲線a表示體系中不存在Pb2+和Cd2+時的熒光光譜;曲線b表示體系中存在Pb2+和Cd2+時的熒光光譜。

2.3 傳感器的試驗條件優化

MBs作為固載Y型DNA結構的材料,其用量至關重要,如圖3所示,分別比較了不同MBs用量下,加入Pb2+和Cd2+前后的Cy5和FAM的熒光強度差值ΔF。從圖3(a)和(c)可以看出,ΔF隨著MBs用量的逐漸增加而逐漸增大,并在MBs用量為5 μL時達到最大值,主要是由于MBs固載了更多的靶標識別探針使得ΔF增大。當繼續增加MBs用量時,ΔF逐漸減小,是因為過量的MBs發生聚集從而導致傳感器檢測性能降低[22]。因此選擇5 μL為MBs的最佳用量。

由于DNAzyme和Apt對目標物的識別起著直接作用,所以對構成Y型DNA結構的3條鏈的比例進行了優化。如圖4(a)和(c)所示,首先保持E-DNA與Apt的濃度比不變,隨著S-DNA與E-DNA的用量比逐漸降低,ΔF逐漸增大,當3條鏈為1∶1∶1時,ΔF達到最大值,這是因為通過堿基互補配對能夠形成更加穩定的Y型DNA結構。之后,保持S-DNA與E-DNA用量比不變,逐漸增加Apt與E-DNA的用量比,可以看到ΔF趨于穩定,不再明顯變化,主要是因為多余的E-DNA@Apt雙鏈結構會通過MBs的清洗過程被除去。因此,選擇S-DNA、E-DNA和Apt的用量比為1∶1∶1進行以下試驗。

注:(a)、(b)分別為不同用量比下Cy5熒光強度差值的變化及對應的熒光光譜;(c)、(d)不同用量比下FAM熒光強度差值的變化及對應的熒光光譜。

為了節省時間和獲得最佳檢測結果,對目標物孵育的時間進行了優化。如圖5(a)和(c)所示,當孵育時間為30 min時,ΔF達到最大值,進一步增加孵育時間,ΔF沒有明顯增大。因此,選擇30 min為最佳時間對目標物進行孵育。

2.4 基于Y型DNA結構和磁分離的熒光生物傳感器對Pb2+和Cd2+同時檢測

由圖6可以看出,在最佳的試驗條件下,隨著Pb2+和Cd2+濃度的逐漸增加,Cy5和FAM的熒光強度逐漸增強。在0.5～100 μmol/L范圍內,Cy5的熒光強度差值ΔF與lg(CPb2+)呈線性相關,擬合可得到方程ΔF=74.47 lgC+57.8 (R2=0.991),檢出限為9.7 nmol/L;在0.01～100 μmol/L范圍內,FAM的熒光強度差值ΔF與lg(CCd2+)之間的線性方程為ΔF=28.534 lgC+65.929 (R2=0.994),檢出限為0.4 nmol/L。將該傳感器與之前同時檢測Pb2+和Cd2+的方法進行比較,如表1所示,該傳感器有較寬的線性范圍和較低的檢測限,具備良好的檢測性能。

表1 傳感器與其他同時檢測Pb2+和Cd2+的檢測方法比較

2.5 傳感器的特異性研究

在最佳的試驗條件下,傳感器分別測定了Pb2+、Cd2+、10倍于Pb2+、Cd2+濃度的干擾離子(Mn2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、K+、Ba2+、Ni2+、Co2+、Li+)以及Pb2+和Cd2+與所有干擾離子的混合樣。從圖7可以看出,僅有干擾離子存在時,傳感器的響應值ΔF均較小,熒光強度沒有明顯增強。只有當Pb2+和Cd2+存在于傳感體系中時,Cy5和FAM的熒光強度才會發生顯著增強,表明該傳感器對Pb2+和Cd2+具有良好的特異性。

圖7 傳感器對Pb2+和Cd2+的特異性

2.6 傳感器的重復性和再現性

在相同的試驗條件下,使用同一個傳感器對Pb2+和Cd2+(終濃度均為1 μmol/L)進行了6次測定,相對標準偏差(RSD)分別為3.3%和5.4%;同時,分別使用6個相同的傳感器對Pb2+和Cd2+(終濃度均為1 μmol/L)進行檢測,RSD分別為4.7%和3.4%。以上結果表明,該熒光生物傳感器具備較好的重復性和再現性。

2.7 實際樣品檢測

為了評估該傳感器的可靠性,利用所制備的傳感器對礦泉水、綠茶飲料及皮蛋樣品進行加標檢測,結果如表2所示,加標樣品中Pb2+的回收率為82.33%～107.25%,Cd2+的回收率為88.71%～101.65%,RSD均低于10%。另外,對質控樣品海帶和茶葉中含有的Pb2+和Cd2+進行檢測,結果見表3,使用單一樣本T檢驗法對數據進行分析,海帶樣品的t為1.058,茶葉樣品的t為2.857,均小于4.303(0.95,n=3),說明檢測值與認證值之間沒有顯著性差異。以上結果表明,所制備的傳感器在實際樣品檢測方面性能優異。

表2 實際樣品的檢測結果

表3 質控樣的檢測結果

3 結論

利用DNAzyme和適配體識別靶標的高特異性,成功構建了以Y型DNA結構和磁分離為基礎的熒光生物傳感器。巧妙設計的Y型DNA結構實現了對Pb2+和Cd2+的同時檢測,利用MBs的固載和磁分離能力達到了降低背景信號、提高靈敏度的作用。結果表明,所構建的傳感器具有較低的檢測限和較寬的檢測范圍,不受其他常見重金屬離子的干擾,特異性高,并且在實際樣品的檢測中也獲得了較好的回收率,質控樣的檢測結果與認證值之間沒有明顯差異。因此,本研究所構建的熒光生物傳感器在食品及環境中多種重金屬檢測方面擁有巨大潛力。此外,通過替換靶標適配體序列,本研究策略也可用于其他目標物的檢測,為食品及環境中有害物質檢測提供了技術支撐。