黑豆7S球蛋白提取工藝及抑制淀粉酶特性研究

孫麗娜,張雅斐,任順成*

1.河南工業大學 河南省天然色素制備重點實驗室,河南 鄭州 450001

2.樂普(北京)醫療器械股份有限公司,北京 102200

經常食用高碳水化合物的食物會增加各種代謝綜合征的風險,比如肥胖癥、2型糖尿病等[1]。食物中的淀粉和糖原能被α-淀粉酶分解為葡萄糖和麥芽糖[2],從而導致血液中葡萄糖水平增加。抑制α-淀粉酶活性可有效控制血糖升高。有研究表明,植物性食物蛋白,比如大豆分離蛋白能有效抑制α-淀粉酶的活性[3]。通過抑制α-淀粉酶活性減緩淀粉消化、控制血糖升高已經成為當前研究的熱點。

黑豆是我國重要的農作物之一,營養豐富,功效眾多,有悠久的藥食同源史[4-5],其蛋白含量高于40%,被稱為“植物蛋白之王”[6]。7S球蛋白是黑豆蛋白的主要組分之一,又被稱為β-伴大豆球蛋白,在球蛋白中占比1/3左右[7]。研究表明,黑豆蛋白有良好的生物活性[8-10](如抗氧化性)和優良的功能特性[11-13](如起泡性、乳化性等)。7S球蛋白對α-淀粉酶的抑制活性較好[14],可以延緩淀粉的消化。黑豆蛋白肽類具有降低脂肪生成的能力,可作為功能性成分應用到與減肥相關的產品上[15]。

堿提酸沉法具有成本低、操作簡單等優點,是目前國內外提取黑豆7S球蛋白最主要的方法之一[16-17]。不同的提取條件會影響7S球蛋白的提取量及生物活性。目前,國內外有關堿提酸沉法提取7S球蛋白的研究主要集中在提取量和抗氧化性等方面[18-19],關于其抑制α-淀粉酶活性的作用鮮有報道,極大局限了黑豆資源的開發利用。

作者采用堿提酸沉法提取黑豆7S球蛋白,以液料比、提取pH值和氯化鈉濃度為主要影響因素,以α-淀粉酶抑制率為指標,運用響應面法進行優化,研究提取條件對α-淀粉酶抑制活性的影響,并探究蛋白質量濃度、溫度、酸堿度及淀粉質量濃度等因素對黑豆7S球蛋白的活性影響,進一步了解不同處理條件下該蛋白的活性變化。旨在提高黑豆的利用價值,為黑豆資源的綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆:贛州康瑞農產品有限公司;3,5-二硝基水楊酸(DNS):國藥集團化學試劑有限公司;豬胰腺α-淀粉酶、可溶性淀粉:上海源葉生物科技有限公司;石油醚、亞硫酸氫鈉、氯化鈉:鄭州新豐化驗器材有限公司。

1.2 儀器與設備

PHS-3C雷磁酸度計:上海儀電科學儀器股份有限公司;MVS-1旋渦混合器:北京金北德工貿有限公司;FA1004電子分析天平:上海上平儀器公司;TDL-5A臺式低速離心機:江蘇省金壇市醫療儀器廠;V-1600-B紫外可見分光光度計:上海美譜達儀器有限公司;SHZ-82數顯水浴恒溫振蕩器:金壇華峰儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理

黑豆經篩選后進行粉碎,過60目標準篩。將黑豆粉與石油醚按體積比1∶3置于燒杯中,并用保鮮膜密封,常溫下用磁力攪拌器攪拌4 h,倒去石油醚和脂肪,將沉淀部分自然風干,得脫脂黑豆粉,并于4 ℃冰箱中保存備用。

1.3.2 黑豆7S球蛋白的提取

參考Nagano等[20]使用的方法并進行優化:稱取一定量的脫脂黑豆粉,按一定比例加入蒸餾水,室溫下攪拌使其完全溶解。調pH值至7.5,3 500 r/min離心20 min,去沉淀,上清液中加入0.98 g/L的亞硫酸氫鈉,攪拌溶解后,用1 mol/L的HCl或NaOH調pH值至6.4,4 ℃冷藏過夜。3 500 r/min離心20 min,去沉淀,在上清液中添加一定量的氯化鈉,調pH值至5.0,3 500 r/min離心20 min,去沉淀;調節上清液的pH值,3 500 r/min離心20 min,倒去上清液,得黑豆7S球蛋白。凍干后備用。

1.3.3α-淀粉酶抑制活性的測定

食物進入腸胃后,淀粉被胰腺α-淀粉酶水解成麥芽糖和葡萄糖,它們均可被DNS還原,因此,可采用DNS比色法進行活性測定。取4支試管(25 mL)為一組,分別標記為樣品管、樣品對照管、空白管和空白對照管。樣品管中加入250 μL、20 mg/mL的7S球蛋白溶液和α-淀粉酶溶液;樣品對照管中加入250 μL的7S球蛋白溶液和蒸餾水;空白管中加入250 μL的α-淀粉酶溶液和蒸餾水;空白對照管中加入500 μL的蒸餾水。將試管放入37 ℃水浴恒溫振蕩器中振蕩10 min,加入糊化后的1%小麥淀粉溶液500 μL,繼續振蕩10 min,再加入1 mL DNS試劑,沸水浴5 min,迅速取出在自來水下沖涼冷卻,定容后在540 nm測定吸光度,重復3組平行。

α-淀粉酶抑制率=(1-(A1-A2)/(A3-A4))×100%,

式中:A1、A2、A3、A4分別代表樣品管、樣品對照管、空白管、空白對照管的吸光度。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 液料比

稱取50 g脫脂黑豆粉,固定氯化鈉濃度為0.25 mol/L,提取pH 4.8,添加蒸餾水使液料比分別為8∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1(mL/g),提取黑豆7S球蛋白并測定α-淀粉酶的抑制率。

1.3.4.2 pH值

稱取50 g脫脂黑豆粉,固定液料比為10∶1(mL/g),氯化鈉濃度為0.25 mol/L,提取pH值設為4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0(提取pH值為5.0時前一個步驟的pH值設為5.2以沉淀雜質),提取黑豆7S球蛋白并測定α-淀粉酶的抑制率。

1.3.4.3 氯化鈉濃度

稱取50 g脫脂黑豆粉,固定液料比為10∶1(mL/g),提取pH為4.8,分別加入0、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mol/L的氯化鈉,提取黑豆7S球蛋白并測定α-淀粉酶的抑制率。

1.3.5 響應面優化試驗

根據單因素試驗結果,選取液料比、提取pH值、氯化鈉濃度為影響因素,以α-淀粉酶抑制率為響應值,設計響應面優化試驗。

1.3.6 影響α-淀粉酶抑制活性的因素研究

1.3.6.1 7S球蛋白質量濃度對α-淀粉酶抑制率的影響

用0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)將7S球蛋白配制成0.1、0.5、1、5、10、15、20 mg/mL的樣品溶液,用1.3.3方法探究7S球蛋白質量濃度對其抑制α-淀粉酶活性的影響。

1.3.6.2 溫度對α-淀粉酶抑制率的影響

用0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)配制7S球蛋白溶液,并分別置于20、30、40、50、60、70、80、90 ℃的恒溫水浴鍋中,30 min后取出冷卻至室溫,用1.3.3方法探究溫度對7S球蛋白抑制α-淀粉酶活性的影響。

1.3.6.3 pH值對α-淀粉酶抑制率的影響

配制pH值為2、3、4、5、6、7、8、9的緩沖液(pH值為2、3、4、8、9用HCl和NaOH配制,其他用磷酸鹽溶液配制),用不同pH值的緩沖液配制7S球蛋白溶液,靜置2 h,用1.3.3方法探究pH值對7S球蛋白抑制α-淀粉酶活性的影響。

1.3.6.4 淀粉質量濃度對α-淀粉酶抑制率的影響

用0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)配制質量濃度分別為10、20、30、40、50、60 mg/mL的淀粉溶液,于90 ℃恒溫水浴鍋糊化30 min,用1.3.3方法探究淀粉質量濃度對7S球蛋白抑制α-淀粉酶活性的影響。

1.4 數據處理與分析

采用SPSS 26對試驗數據進行顯著性分析,Design-Expert 8.0進行方差分析,使用Origin 2021繪圖。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比對α-淀粉酶抑制率的影響

由圖1可知,隨著液料比的增大,α-淀粉酶抑制率呈先增大后減小的趨勢。液料比為12∶1時,α-淀粉酶抑制率達到峰值,此時與液料比14∶1時的抑制率差異不顯著,液料比繼續增大時,α-淀粉酶抑制率急劇降低。這可能是因為隨著溶劑比例的增大,提取出的活性物質逐漸增加,在液料比12∶1時基本浸提完全。而當液料比進一步增大時,提取的活性物質在兩相中比例減少,進而對α-淀粉酶的抑制率降低[21]。因此,液料比為12∶1(mL/g)提取7S球蛋白最為適宜。

注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2—圖3同。

2.1.2 pH值對α-淀粉酶抑制率的影響

由圖2可知,pH 4.0～5.0時,α-淀粉酶抑制率先增大后減小,在pH 4.8時達到峰值,pH值增大至5.0時,α-淀粉酶抑制率略微下降,差異不顯著。可能是因為pH 4.8時最接近該物質的等電點,活性物質析出最多;而當pH值過大或過小時,會影響及破壞蛋白的結構,從而降低蛋白活性[22]。因此,在pH 4.8時提取7S球蛋白最為適宜。

圖2 pH值對α-淀粉酶抑制率的影響

2.1.3 氯化鈉濃度對α-淀粉酶抑制率的影響

由圖3可知,當氯化鈉濃度從0 mol/L增加到0.3 mol/L時,7S球蛋白對α-淀粉酶的抑制率先增大后減小,在0.15 mol/L時達到峰值。可能是因為鹽離子會影響溶液的離子強度,導致溶液發生鹽溶或鹽析作用。適量的鹽離子可以增加活性基團的穩定性,而當其濃度過大時,活性基團會遭到破壞,從而降低對α-淀粉酶的抑制率[23]。氯化鈉濃度0.15 mol/L時,與其他濃度的添加量差異顯著。因此,選用0.15 mol/L的氯化鈉提取7S球蛋白。

圖3 NaCl濃度對α-淀粉酶抑制率的影響

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 響應面優化試驗設計與結果

根據單因素試驗結果,以液料比(A)、提取pH值(B)、氯化鈉濃度(C)為考察因素,以α-淀粉酶抑制率(Y)為響應值,采用Design-Export 8.0軟件,用Box-Behnken方法設計試驗方案,試驗設計及結果見表1,回歸方差分析見表2。

表1 響應面試驗設計及結果

表2 回歸方差分析

以α-淀粉酶抑制率為響應值,對響應結果進行回歸擬合分析,得回歸方程:

Y=75.61-2.25A+7B+4.12C-0.78AB+2.43AC-2.42BC-12.42A2-15.54B2-16C2。

2.2.2 響應面模型的驗證

根據Design-Export 8.0分析,在液料比13.5∶1,提取pH 4.84、氯化鈉濃度0.16 mol/L時,預測α-淀粉酶抑制率為68.09%。調整實際工藝參數:液料比13∶1,提取pH 4.8、氯化鈉濃度0.16 mol/L,進行驗證試驗,得到α-淀粉酶抑制率為70.51%,與理論預測值相差<3%。此提取工藝的可靠、有效,對實際生產具有指導意義。

2.3 抑制α-淀粉酶活性的影響因素分析

2.3.1 7S球蛋白質量濃度對α-淀粉酶抑制率的影響

由圖4可知,7S球蛋白的質量濃度越大,對α-淀粉酶的抑制效果就越強。當7S球蛋白質量濃度大于5 mg/mL時,α-淀粉酶抑制率線性上升。當7S球蛋白質量濃度為20 mg/mL時,抑制率達到75.38%,高于賈光鋒等[24]制得的白蕓豆AAI粗制品對α-淀粉酶的抑制率(43%)。

圖4 7S球蛋白質量濃度對α-淀粉酶抑制率的影響

2.3.2 溫度對α-淀粉酶抑制率的影響

由圖5可知,30～60 ℃時,7S球蛋白具有α-淀粉酶抑制活性,且在30 ℃時抑制活性最好。當溫度升到70 ℃時,7S球蛋白對α-淀粉酶的抑制率為0,此時7S球蛋白已經完全失活。表明7S球蛋白屬于熱敏性蛋白。

圖5 溫度對α-淀粉酶抑制率的影響

2.3.3 pH值對α-淀粉酶抑制率的影響

由圖6可知,當pH 3～9時,7S球蛋白對α-淀粉酶均具有一定的抑制活性,且pH 5～8時抑制效果較佳。當pH值下降到2時,7S球蛋白完全喪失抑制活性。說明pH 3～9時,7S球蛋白有較好的酸堿耐受性。姜彩霞等[25]研究發現白蕓豆α-淀粉酶抑制蛋白在pH 2～10時活性穩定性較高,與本研究結果類似。

圖6 pH值對α-淀粉酶抑制率的影響

2.3.4 淀粉質量濃度對α-淀粉酶抑制率的影響

由圖7可知,淀粉質量濃度從10 mg/mL增加到60 mg/mL時,7S球蛋白對α-淀粉酶的抑制率變化不大。這可能跟7S球蛋白的抑制類型有關,當抑制類型為非競爭性抑制時,底物濃度的改變對抑制程度無影響[26]。表明7S球蛋白對α-淀粉酶的抑制類型可能為非競爭性抑制。由于淀粉質量濃度對α-淀粉酶的抑制率影響不大,為降低成本和原料,可選擇低質量濃度淀粉測定α-淀粉酶的抑制活性。

3 結論

采用單因素和響應面優化試驗,確定了提取7S球蛋白的最優工藝:提取液料比13∶1(mL/g),提取pH 4.8,氯化鈉濃度0.16 mol/L,在此條件下7S球蛋白對α-淀粉酶的抑制效果最佳,可達到70.51%。通過對影響7S球蛋白抑制α-淀粉酶的因素進行研究可知,7S球蛋白的質量濃度越大,對α-淀粉酶的抑制效果越好;7S球蛋白為熱敏性蛋白,在70 ℃及以上即會失活,在30 ℃抑制活性較好;pH 3～9時,7S球蛋白有較好的酸堿耐受性,pH值低于3時,7S球蛋白失活;淀粉質量濃度對α-淀粉酶抑制率沒有明顯影響,這可能跟7S球蛋白的抑制類型有關,后續可對7S球蛋白對α-淀粉酶的抑制類型進行探究。7S球蛋白對α-淀粉酶存在較好的抑制活性,可在降血糖、肥胖癥等方面得到廣泛應用,并可為黑豆中7S球蛋白的綜合利用提供理論參考。