中間球海膽CS基因克隆及其響應急性高溫脅迫的表達模式

孫繼紅 任麗媛 崔東遙 趙譚軍 常亞青 湛垚垚

摘要：【目的】明確中間球海膽（Strongylocentrotus intermedius）檸檬酸合酶（CS）基因（SiCS）的序列特征、組織表達情況及其應對急性高溫脅迫的響應規律，為研究SiCS基因功能及揭示其參與中間球海膽高溫應答的分子機制提供理論依據。【方法】利用RACE克隆SiCS基因cDNA序列，通過BLASTx、EXPASY Proteomics Server、HMMER、PSIRED v3.3及SWISS-MODEL等在線軟件進行生物信息學分析；然后采用分光光度法檢測中間球海膽管足和性腺線粒體腫脹度，運用實時熒光定量PCR檢測SiCS基因的組織表達規律，并以Epoch酶標儀測定中間球海膽管足和性腺總SiCS活性變化情況。【結果】SiCS基因cDNA序列全長2971 bp，5'端非編碼區（5'-UTR）和3'端非編碼區（3'-UTR）分別為96和1480 bp，開放閱讀框（ORF）為1395 bp，共編碼464個氨基酸殘基。SiCS蛋白分子量約51.48 kD，理論等電點（pI）為6.09，總平均親水性（GRAVY）為-0.178，為穩定的溫和疏水性蛋白；SiCS蛋白不存在信號肽和跨膜結構域，其二級結構中α-螺旋占43.86%、β-折疊占7.02%、無規則卷曲占49.12%，三維結構模型與野豬CS蛋白晶體結構的一致性為73.97%。SiCS氨基酸序列與紫球海膽（S. purpuratus）的CS氨基酸序列相似性最高，為92.90%。SiCS基因在中間球海膽的5種組織中均有表達，其相對表達量排序為體腔細胞>圍口膜>性腺>管足>腸道；總SiCS活性排序則為管足>腸道>圍口膜>性腺>體腔細胞；與對照組（20 ℃）相比，經23和26 ℃急性高溫脅迫后中間球海膽管足和性腺的SiCS基因相對表達量及總SiCS活性均呈波動變化規律，但在不同高濕脅迫下和不同組織中有所差異。【結論】中間球海膽可能通過調整組織中的SiCS基因相對表達及SiCS活性來響應急性高溫脅迫，且這種響應策略存在一定的組織和溫度特異性，具體表現為性腺對急性高溫脅迫較管足更敏感。

關鍵詞：中間球海膽；檸檬酸合酶（CS）；急性高溫脅迫；表達模式；酶活性

中圖分類號：S968.9? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2023）02-0586-12

Abstract：【Objective】To clarify the sequence characteristics，tissue expression rules and its expression patterns in response to acute heat stress of citrate synthase （CS） gene （SiCS） in Strongylocentrotus intermedius. The results of this study would provide a theoretical basis for further study of the biological function of SiCS gene and reveal the molecular mechanism of its involvement in the high temperature response of S. intermedius. 【Method】The cDNA sequence was cloned by using the rapid amplification of cDNA ends （RACE） technology. Bioinformatics analysis was carried out by online softwares such as BLASTx， EXPASY Proteomics Server， HMMER， PSIRED v3.3 and SWISS-MODEL. Mitochondria swelling degree of the tube foot and gonad were measured by spectrophotometry. Tissue relative expression of SiCS was analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR）； the changes of total SiCS activity in the tube foot and gonad of S. intermedius were measured by Epoch assay. 【Result】The results showed that the full length of SiCSc DNA was 2971 bp， containing a 5' end non-coding region （5'-UTR） of 96 bp， a 3' end non-coding region （3'-UTR）of 1480 bp， and an open reading frame（ORF） of 1395 bp which encoded 464 amino acids residues. The predicted molecular weight and the theoretical isoelectric point （pI） of SiCS protein were 51.48 kD and 6.09 respectively. SiCS was a stable mild hydrophobic protein with an average hydrophilicity （GRAVY） of -0.178. SiCS had no signal peptideand transmembrane. In the secondary structure， α-helix accounted for 43.86%， β-fold accounted for 7.02%， and random coil accounted for 49.12%.The consistency between the three dimensional structure of SiCS and the crystal structure of CS protein from Sus scrofa was 73.97%. Phylogenetic analysis indicated that the SiCS protein had the most similarity with CS protein from Strongylocentrotus purpuratus （similarity：92.90%）. Relative gene expression data showed that SiCS was expressed in all examined tissues and the expression level from high to low was as coelomcytes>interdental muscle>gonad>tube foot>intestine. Total enzyme activity assay revealed that the level of total SiCS enzyme activity in different tissues from high to low was as tube foot>intestine>interdental muscle>gonad>coelomcytes. Compared with the control group （20 ℃）， the relative expression level of the SiCS gene and the total SiCS activity in the tube foot and gonad of S. intermediuss howed fluctuations after acute heat stress at 23 and 26 ℃， and there were some differences under different heat stresses and in different tissues. 【Conclusion】S. intermedius mightrespond to acute heat stress by adjusting the relative expression of SiCS gene and SiCS enzyme activity in different tissues，and this response strategy hascertain tissue and temperature specificity， which specifically shows that the gonad is more sensitive to acute heat stress than the tube foot.

Key words： Strongylocentrotus intermedius； citrate synthase（CS）； acute heat stress； gene expression； enzyme activity

Foundation items： “Xingliao Talents Plan” Project of Liaoning（XLYC2002107）； Liaoning Innovative Talent Support Program of Colleges and Universities （LR2020065）；

0 引言

【研究意義】海水溫度作為最重要的環境因子之一，其變化會對海洋生物帶來廣泛且深遠的負面影響。海水暖化通過影響三羧酸循環代謝進程而影響貝類（Cherkasov et al.，2007；Tomanek，2012；Gorenkova et al.，2013）、魚類（Martinez et al.，2016）及刺胞生物（Hawkins and Wamer，2017）體內的生理和生化活動，如30 ℃高溫脅迫會導致美洲牡蠣（Crassostrea virginica）腮組織細胞線粒體中的烏頭酸酶活性降低34%（Sanni et al.，2008）。趙志剛等（2016）研究表明，隨著馴化溫度的升高，施氏鱘（Acipenser schrencki）幼魚肝臟線粒體細胞色素Ｃ氧化酶（Cytochrome oxidase，CCO）活性逐漸增加。檸檬酸合酶（Citrate synthase，CS）是三羧酸循環的第一個限速酶，對維持不同類型細胞能量的產生起關鍵作用（Schlichtholz et al.，2005；Chen et al.，2014；MacPherson et al.，2017）。CS對高溫較敏感，38 ℃可嚴重造成豬心臟線粒體中的CS失活（劉箭和莊野真理子，2001），32 ℃可導致大鼠（Rattus norvegicus）肝臟組織中的CS含量顯著降低（姚鳳云等，2018），但目前關于海水升溫對中間球海膽（Strongylocentrotus intermedius）CS的影響尚無研究報道。因此，克隆中間球海膽CS基因（SiCS）并明確其響應海水高溫脅迫的表達規律，可進一步豐富海洋棘皮類動物CS基因的序列信息和結構特點，為從能量代謝調節層面解析海洋生物應對海水暖化的分子響應規律提供參考資料，同時可為制定海水暖化背景下重要海洋經濟棘皮類動物的養殖及管理策略提供新思路。【前人研究進展】CS定位于真核細胞線粒體基質中，具有專一的底物特異性，僅催化乙酰輔酶Ａ（Acetyl-CoA）與草酰乙酸（Oxaloacetic acid）縮合生成檸檬酸（Citric acid）和輔酶Ａ（CoA）（葛亞東等，2010）。CS廣泛存在于動植物體內，根據其細胞定位情況，可分為線粒體CS（mCS）、乙醛酸循環體CS（gCS）和過氧化物酶體CS（pCS） （Schnarrenberger and Martin，2002）。CS除了參與能量調節外，還與動植物的抗逆性狀存在一定關聯（Pracharoenwattana et al.，2005）。在水稻（Oryza sativa）內過表達CS可加速根系大量合成及分泌檸檬酸，培育出耐低磷脅迫的轉基因水稻植株（胡利華等，2006）；在菠蘿（Ananas comosus）果實的成熟過程中有機酸（主要是檸檬酸）含量與CS活性呈極顯著正相關（張秀梅等，2007）；在紫花苜蓿（Medicago sativa）中過表達CS可增強其對鋁毒的耐受力（Barone et al.，2008）。在水產動物中，閆玉蓮和謝小軍（2011）研究證實CS活性可作為間接評價南方鲇（Silurus meridio-nalis）幼魚線粒體功能的重要指標；Davis等（2016）研究表明南極洲翡翠巖鱈魚（Trematomus bernacchii）可通過增強體內的CS活性來抵消海水酸化對有氧呼吸的影響；Jesus等（2018）研究發現當海水酸化條件為ΔpH=-0.4時卡氏雅羅魚（Squalius carolitertii）肌肉組織中的CS活性顯著降低；Li等（2019）研究表明，高鹽（25‰）脅迫可增強中華絨螯蟹（Fenneropenaeus chinensis）后鰓組織中的CS活性，低鹽（15‰和10‰）脅迫則導致中華絨螯蟹肌肉組織中的CS活性下降16.60%～59.11%。【本研究切入點】中間球海膽又稱蝦夷馬糞海膽，具有棘刺短、性腺品質佳及生長快速等特點（常亞青等，2004；尹文露等，2020）。中間球海膽原產于日本北海道及俄羅斯遠東地區，1989年由大連海洋大學從日本引進，現已發展成為我國最重要的海膽養殖品種（常亞青等，1999）。中間球海膽的最適生長水溫在20 ℃左右，當水溫超過23 ℃會嚴重影響其存活、攝食及生長發育，甚至導致大規模死亡（鄭定發等，2019）。近年來受全球海水暖化的影響，我國北黃海中間球海膽養殖區夏季水溫經常處于25～28 ℃（曾廣恩等，2006），導致養殖中間球海膽大規模死亡事件頻繁發生，而帶來重大經濟損失，因此亟待系統解析中間球海膽應對海水暖化的分子響應規律。【擬解決的關鍵問題】明確SiCS基因序列特征、組織表達情況及其對急性高溫脅迫的響應規律，為后續研究SiCS基因功能及揭示其參與中間球海膽高溫應答的分子機制提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試中間球海膽購自大連市旅順龍王塘養殖場，平均殼徑40.00±5.01 mm，平均殼高26.00±2.03 mm，平均體質量38.20±5.04 g。試驗前置于農業農村部北方海水增養殖重點實驗室暫養1周。RNA提取試劑盒、PrimeScriptTM RT reagent Kit、SMARTer? RACE 5'/3' Kit及ABI 7500熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；GENMED純化線粒體腫脹光度法檢測試劑盒購自上海杰美基因醫藥科技有限公司；組織線粒體分離試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；CS測定試劑盒（A108-1）購自南京建成生物工程研究所有限公司；Epoch酶標儀購自美國BioTek公司。

1. 2 試驗設計

1. 2. 1 急性高溫脅迫 隨機選取75只健康且活力好的中間球海膽，平均分成3組（每組25只），設1個對照組（20 ℃）和2個急性高溫脅迫組（23和26 ℃）。對照組海膽養殖在20 ℃恒溫循環水槽中，試驗組海膽從暫養區直接轉移至23和26 ℃的恒溫循環水槽中進行急性高溫脅迫，在整個急性高溫脅迫過程中海膽活力減弱，但未出現死亡現象。

1. 2. 2 樣品收集 選取健康、活力較好的中間球海膽，于冰上分別剖解收集管足、腸道、圍口膜、體腔液和性腺等5個組織，參照武博瓊等（2022）的方法進行保存，用于cDNA克隆、組織表達分析及總SiCS活性測定。同時，分別在23和26 ℃急性高溫處理后第1.5、3.0﹑6.0﹑12.0﹑24.0﹑48.0﹑72.0及96.0 h時取樣，每個時間點從各處理組中隨機選取3只海膽，于冰上剖解收集管足和性腺組織，部分樣品先進行液氮速凍，再置于-80 ℃冰箱保存備用，用于組織表達分析；另一部分樣品直接-80 ℃凍存，用于線粒體腫脹度及總酶活性測定。

1. 3 SiCS基因克隆

按總RNA提取試劑盒說明提取中間球海膽各組織總RNA，參照PrimeScriptTM RT reagent Kit說明反轉錄合成cDNA模板，并參照SMARTer? RACE 5'/3' Kit說明合成5'/3'末端模板。從已構建的中間球海膽轉錄組文庫中搜索CS基因Unigene序列，經BLASTx比對分析后使用Primer Premier 5.0設計SiCS基因特異性擴增引物（表1）。以cDNA為模板進行核心片段克隆，以5'/3'末端cDNA為模板進行5'/3'-RACE擴增。PCR反應體系及擴增程序參照李瑩瑩等（2020）的方法，PCR擴增產物電泳、切膠回收、連接轉化及菌液PCR鑒定參照李蒙等（2019）的方法。

1. 4 SiCS基因生物信息學分析

使用DNAMAN 6.0完成SiCS基因cDNA序列拼接和組裝，然后分別采用BLASTx（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）、ORF Finder（htttp：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）、EXPASY Proteomics Server（http：//www.expasy.org）、HMMER（http：//hmmer.org/download.html）、PSIRED v3.3（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/ psipred/）、SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy. org/）及MEGA等在線軟件完成序列比對分析、開放閱讀框（ORF）確定、蛋白理化性質分析、蛋白結構域和二級結構預測、蛋白三維空間結構建模及系統進化樹構建。

1. 5 中間球海膽組織線粒體腫脹度測定

采用GENMED純化線粒體腫脹光度法檢測試劑盒檢測中間球海膽管足和性腺的線粒體腫脹度，具體操作：采用組織線粒體分離試劑盒分離待測的線粒體樣品；移取20.0 μL線粒體樣品至96孔細胞板中，加入170.0 μL GENMED緩沖液（Reagent A），混勻后立即放入酶標儀（波長520 nm）中讀取0 min初始吸光值（OD520-0）；室溫靜置1 min后加入10.0 μL GENMED膨脹液（Reagent B），混勻后即刻放入酶標儀（波長520 nm）中動態記錄10 min吸光值（OD520-10）。

線粒體腫脹度= OD520-0-OD520-10

1. 6 實時熒光定量PCR檢測SiCS基因組織表達規律

按照PrimeScriptTM RT reagent Kit說明合成cDNA模板，以β-actin為內參基因，對擴增引物的特異性和擴增效率進行檢測。利用ABI 7500熒光定量PCR儀進行實時熒光定量PCR擴增，其反應體系參照柳林等（2019）的方法，擴增程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進行45個循環；對擴增結果進行熔解曲線分析，排除非特異性擴增污染。采用2-ΔΔCt法換算SiCS基因相對表達量（Livak and Schmittgen，2001）。

1. 7 中間球海膽組織總SiCS活性測定

取0.5～1.0 g組織樣品置于液氮中研磨，按1∶9（g∶mL）的比例加入提取液，冰浴勻漿，制成10%待測懸液。10000 r/min離心10 min，取上清液，參照CS測定試劑盒（A108-1）說明，利用Epoch酶標儀測定中間球海膽組織總SiCS活性。反應底物在412 nm波長下，測定初始吸光值（A0），轉入37 ℃孵育箱溫浴15 min后再放入酶標儀測定吸光值（A15），并計算各孔ΔA= A15-A0。

總SiCS活性（U/mg）=[△AU-△AO13.6×10-3×d×T]×N1÷C×N

式中，ΔAU代表測定孔吸光值變化量；ΔAO代表空白孔吸光值變化量；13.6×10-3為摩爾消光系數；T代表反應時間（15 min）；d代表比色光徑（cm）；N1代表體系稀釋倍數；C代表樣本蛋白濃度（mg/mL）；N代表樣本測試前稀釋倍數。

1. 8 統計分析

采用Excel 2016進行試驗數據整理，使用SPSS 22.0進行單因素方差分析（One-way ANVOA），并以Origin 8.0制圖。

2 結果與分析

2. 1 SiCS基因克隆及序列分析結果

對測序結果進行拼接比對分析，得到SiCS基因cDNA序列全長2971 bp，其中，ORF為1395 bp（編碼464個氨基酸殘基），5'端非編碼區（5'-UTR）為96 bp，3'端非編碼區（3'-UTR）為1480 bp，起始密碼子（ATG）位于序列的第97 bp處，終止密碼子（TAA）位于序列的第1489 bp，且包含30 bp的poly（A）尾巴（圖1）。

2. 2 SiCS蛋白理化性質預測分析結果

采用ProtParam分析SiCS蛋白理化性質，結果顯示，SiCS蛋白分子量為51.48 kD，理論等電點（pI）為6.09；帶負電氨基酸殘基數（Asp+Glu）52個，帶正電氨基酸殘基數（Arg+Lys）46個；不穩定系數為30.84，屬于穩定蛋白；脂肪族氨基酸系數為89.55，說明SiCS蛋白脂肪族氨基酸含量較高；總平均親水性（GRAVY）為-0.178，即為溫和疏水性蛋白（圖2）。SignalP預測結果顯示，在SiCS蛋白氨基酸序列中未檢測到信號肽，屬于非分泌型蛋白（圖3）；TMHMM預測結果顯示，SiCS蛋白為非跨膜蛋白（圖4）。蛋白二級結構預測結果顯示，SiCS蛋白中α-螺旋占43.86%、β-折疊占7.02%、無規則卷曲占49.12%（圖5-A）；SiCS蛋白C-端結構域位于第73～451氨基酸處，且在302H、348H和403D位檢測到活性中心（圖5-B）。以已知的野豬CS蛋白晶體結構（PDB登錄號5uqs.1A）為模板進行三維結構同源建模，結果（圖6）顯示預測得到的SiCS蛋白三維結構模型與模板間的一致性為73.97%。

2. 3 CS氨基酸多序列比對及系統發育進化分析結果

CS氨基酸多序列比對分析結果顯示，14種生物（表2）的CS氨基酸序列相似性為82.91%（圖7）；除刺參外，SiCS氨基酸序列與其他12種生物的CS氨基酸序列相似性均大于70.00%，其中，與紫球海膽（S. purpuratus）的CS氨基酸序列相似性最高，為92.90%，與長棘海星的CS氨基酸序列相似性為79.18%。由基于CS氨基酸序列相似性構建的系統發育進化樹（圖8）可知，中間球海膽與紫球海膽、刺參和長棘海星聚為一支，其中與紫球海膽的親緣關系最近。

2. 4 急性高溫脅迫對中間球海膽管足和性腺線粒體腫脹度的影響

如圖9-A所示，與對照組（20 ℃）相比，23 ℃急性高溫脅迫后第1.5和3.0 h中間球海膽管足線粒體腫脹度呈極顯著上升趨勢（P<0.01，下同），然后緩慢恢復至正常水平；經26 ℃急性高溫脅迫后，中間球海膽管足線粒體腫脹度呈先上升后下降的變化趨勢，至脅迫后第6.0 h達最高值，而后開始降低；與23 ℃急性高溫脅迫相比，26 ℃急性高溫脅迫整體上呈下降趨勢。由圖9-B可知，與對照組（20 ℃）相比，23 ℃急性高溫脅迫后第1.5和3.0 h中間球海膽性腺線粒體腫脹度極顯著上升，從脅迫后第6.0 h開始呈下降趨勢；經26 ℃急性高溫脅迫后，中間球海膽性腺線粒體腫脹度呈先上升后下降再上升的變化趨勢，脅迫后第48.0 h降至最低值；與23 ℃急性高溫脅迫相比，26 ℃急性高溫脅迫后整體上呈下降趨勢。

2. 5 SiCS基因和總SiCS活性的組織表達規律及其對急性高溫脅迫的響應

2. 5. 1 SiCS基因和總SiCS活性的組織表達規律 如圖10-A所示，SiCS基因在中間球海膽的管足、性腺、腸道、體腔細胞及圍口膜等組織中均有表達，其相對表達量排序為體腔細胞>圍口膜>性腺>管足>腸道，具有一定的組織特異性。SiCS基因相對表達量以中間球海膽體腔細胞的最高，顯著高于其他4種組織（P<0.05，下同），管足和腸道中的相對表達量較低，顯著低于其他3種組織。如圖10-B所示，中間球海膽各組織的總SiCS活性排序為管足>腸道>圍口膜>性腺>體腔細胞，其中，管足和腸道的總SiCS活性顯著高于其他3種組織，圍口膜和性腺的總SiCS活性又顯著高于體腔細胞，而體腔細胞的總SiCS活性最低。

2. 5. 2 急性高溫脅迫對SiCS基因表達及總SiCS活性的影響 如圖11-A所示，與對照組（20 ℃）相比，經23和26 ℃急性高溫脅迫后中間球海膽管足的SiCS基因相對表達量在不同時間點呈先上升后下降的波動變化規律。其中，在23 ℃急性高溫脅迫中，中間球海膽管足SiCS基因相對表達量在脅迫后第6.0 h達第1次峰值，第96.0 h達第2次峰值，而在脅迫后第1.5和48.0 h分別出現2次谷值；在26 ℃急性高溫脅迫中，中間球海膽管足SiCS基因相對表達量在脅迫后第3.0 h達第1次峰值，第72.0 h達第2次峰值，在脅迫后第24.0 h達最低值。與23 ℃急性高溫脅迫相比，經26 ℃急性高溫脅迫后中間球海膽管足SiCS基因相對表達量也呈先上升后下降的波動變化規律。在中間球海膽性腺SiCS基因相對表達量方面，與對照組（20 ℃）相比，經23和26 ℃急性高溫脅迫后SiCS基因相對表達量均呈上升趨勢，且在脅迫后第3.0 h達第1次峰值，第72.0 h達第2次峰值；與23 ℃急性高溫脅迫相比，經26 ℃急性高溫脅迫后中間球海膽性腺SiCS基因相對表達量呈先下降后上升的波動變化規律（圖11-B）。

如圖11-C所示，與對照組（20 ℃）相比，經23 ℃急性高溫脅迫后中間球海膽管足總SiCS活性呈先下降后上升再下降的變化趨勢，在脅迫后第6.0 h達峰值；經26 ℃急性高溫脅迫后，中間球海膽管足總SiCS活性極顯著下降；與23 ℃急性高溫脅迫相比，26 ℃急性高溫脅迫后總SiCS活性整體上呈下降趨勢。在中間球海膽性腺總SiCS活性方面，與對照組（20 ℃）相比，經23 ℃急性高溫脅迫后中間球海膽性腺總SiCS活性在各時間點均呈極顯著下降趨勢，且在脅迫后第3.0和72.0 h出現2次谷值；經26 ℃急性高溫脅迫后中間球海膽性腺總SiCS活性在脅迫后第3.0 h達第1次峰值，第48.0 h達第2次峰值，而在脅迫后第6.0和72.0 h分別出現2次谷值；與23 ℃急性高溫脅迫相比，經26 ℃急性高溫脅迫后中間球海膽性腺總SiCS活性整體上呈先上升后下降的變化趨勢（圖11-D）。

3 討論

3. 1 SiCS基因序列特征

本研究利用RACE首次克隆獲得SiCS基因cDNA序列全長（NCBI登錄號ON496991），編碼一個具有464個氨基酸殘基的蛋白。CS氨基酸多序列比對分析發現，SiCS氨基酸序列與紫球海膽的CS氨基酸序列相似性最高，達92.90%，僅存在1個氨基酸殘基差異，提示CS同源蛋白在進化上具有一定的種屬特異性。在蛋白空間結構方面，SiCS蛋白與親緣關系較遠的野豬CS蛋白在三維結構上差異較小，表明SiCS蛋白空間結構及其生物學功能在進化過程中具有較高的保守性。由基于CS氨基酸序列相似性構建的系統發育進化樹可知，中間球海膽與同屬于棘皮動物的紫球海膽、刺參和長棘海星聚為一支，處于無脊椎動物與脊椎動物的過渡位置，與海膽類傳統的進化和分類地位相符。此外，SiCS氨基酸序列與長棘海星CS氨基酸序列的相似性高于其與刺參CS氨基酸序列的相似性，故推測SiCS蛋白與長棘海星CS蛋白的親緣關系較近，而與刺參CS蛋白的親緣關系較遠，與崔東遙等（2019）研究報道的中間球海膽LDH基因系統進化分析結果相似。

3. 2 急性高溫脅迫對中間球海膽管足和性腺線粒體腫脹變化的影響

線粒體形態具有高度的可塑性，極易受生理和病理條件的影響（Vincent et al.，2016）。線粒體腫脹是指線粒體內膜Na+、K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性過低（Venkatraman et al.，2008），而導致線粒體膜電位（MMP）缺失及線粒體通透性轉換孔（mPTP）開放，引起線粒體蛋白滲透壓升高和基質水腫的狀態（Rodriguez-Enriquezs et al.，2004）。線粒體腫脹后會導致外膜破裂，線粒體功能失調（曹穎等，2010），因此線粒體腫脹常用于評價線粒體對抗外界應激的能力（徐莉等，2012）。本研究結果表明，在23和26 ℃急性高溫脅迫下，中間球海膽管足和性腺中的線粒體腫脹度與對照組（20 ℃）相比均呈先升高再下降的變化趨勢。經23 ℃急性高溫脅迫后，中間球海膽管足和性腺線粒體腫脹度均在脅迫后第1.5和3.0 h極顯著高于對照組，隨后逐漸下降至與對照組無顯著差異，表明23 ℃急性高溫脅迫引起的線粒體腫脹現象經3.0 h適應后有所緩解，即23 ℃可能仍在中間球海膽的可適應溫度范圍內。經26 ℃急性高溫脅迫后，在脅迫前6.0 h的管足和脅迫前3.0 h的性腺中，線粒體腫脹度均與對照組無顯著差異，但在之后的脅迫過程中線粒體腫脹度均極顯著低于對照組，故推測26 ℃已超過中間球海膽的自我調節范圍，導致線粒體膜發生破損，且持續高溫脅迫導致的損傷難以恢復，也是中間球海膽在高溫脅迫時運動能力降低，最后逐漸死亡的主要原因之一。因此，后續研究應準確掌握中間球海膽線粒體自我調節的極限溫度。

3. 3 SiCS基因及總SiCS活性的組織表達規律

實時熒光定量PCR檢測結果顯示，SiCS基因在中間球海膽管足、圍口膜、體腔細胞、腸道和性腺等組織中均有表達，且具有鮮明的組織特異性，與趙蘭英（2013）研究報道的黃河裸裂尻魚（Schizopygopsis pylzovi）CS基因組織分布規律相似。在同一組織中，SiCS基因相對表達量與總SiCS活性呈相反的變化趨勢。如SiCS基因在體腔細胞中的相對表達量最高，但總SiCS活性最低，可能是體腔細胞中SiCS主要以尚未激活的酶原形式存在。總SiCS活性在中間球海膽的管足和腸道中較高，表明CS除了參與調控機體能量代謝外，還與動植物的抗逆性狀存在一定關聯。中間球海膽的管足直接暴露于外部環境，腸道可通過口器直接與外部環境接觸，較低的SiCS基因表達水平有助于中間球海膽在環境因子快速變化時通過上調表達SiCS基因及時進行響應，維持代謝水平和能量供應以抵抗不利影響，與焦仁和等（2022）、武博瓊等（2022）的研究結果相似。

3. 4 急性高溫對中間球海膽管足和性腺SiCS基因表達及總SiCS活性的影響

管足是海膽的運動和觸覺器官，對外界環境變化敏感，可率先發生響應；性腺是海膽重要的繁殖及能量儲存器官，也是經濟海膽的主要可食用部分。為揭示中間球海膽管足和性腺響應高溫脅迫的分子機制，本研究對中間球海膽管足和性腺中的SiCS基因相對表達量及總SiCS活性進行檢測，結果表明，經23和26 ℃急性高溫脅迫后，管足和性腺的SiCS基因相對表達量及總SiCS活性均呈波動變化規律，但在不同高溫脅迫下和不同組織中有所差異。CS是三羧酸循環中的第一關鍵酶，而三羧酸循環是動物體內糖類、脂類和氨基酸三大營養素的最終代謝通路，也是糖類、脂類及氨基酸代謝聯系的樞紐（樊佳佳等，2014）。此外，CS活性的降低可引起機體能量代謝紊亂（Balaban et al.，2005；Dirks et al.，2006）。本研究結果表明，面對高溫脅迫時中間球海膽可能通過增加三羧酸循環代謝酶活性及提高能量供應，以抵抗高溫脅迫造成的負面影響；隨著CS的不斷積累，又負反饋調節SiCS基因表達，二者間波動調節以響應高溫脅迫。在酶活性方面，經26 ℃急性高溫脅迫后管足和性腺的SiCS活性普遍高于23 ℃急性高溫脅迫，說明隨著脅迫溫度的升高，中間球海膽組織需要更多SiCS活性來調節其生理活動，以緩減高溫脅迫造成的負面影響。本研究還發現，經23和26 ℃急性高溫脅迫后，中間球海膽性腺總SiCS活性普遍高于管足，說明性腺對高溫脅迫更加敏感。Delorme和Sewell（2016）研究發現，逐漸升高的海水溫度對海洋生物性腺生長發育可能會產生負面影響，故推測在應對高溫脅迫時中間球海膽的性腺比管足需要更多能量以保證其正常的生理功能，即中間球海膽性腺對急性高溫脅迫可能較管足更敏感。

綜上所述，中間球海膽可能通過調整組織中的SiCS基因相對表達及SiCS活性來響應急性高溫脅迫，且這種響應策略存在一定的組織和溫度特異性。因此，在后續的研究中應從蛋白水平進一步探究中間球海膽不同組織中SiCS基因響應高溫脅迫的表達規律，并在此基礎上分析SiCS基因表達、蛋白表達及其酶活性水平與高溫脅迫或高溫耐受的相關性，系統解析SiCS基因在中間球海膽響應高溫脅迫中的分子機制，為制定海水暖化背景下重要海洋經濟棘皮類動物的養殖及管理策略提供新思路。

4 結論

中間球海膽可能通過調整組織中的SiCS基因相對表達及SiCS活性來響應急性高溫脅迫，且這種響應策略存在一定的組織和溫度特異性，具體表現為性腺對急性高溫脅迫較管足更敏感。

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（責任編輯 蘭宗寶）