右美托咪定預處理對視網膜缺血再灌注損傷的保護效應及機制研究

周巖巖

武陟濟民醫院麻醉科，河南 焦作 454950

視網膜缺血再灌注損傷為臨床常見眼科疾病，眼外傷、高眼壓及視網膜中央動脈阻塞等因素為其發病原因。該病易造成視神經出現不同程度損傷，對視功能有所危害，故保護視神經為眼科研究重點［1］。右美托咪定為美托咪定右旋異構體的咪唑類衍生物，是一種選擇性高的α2腎上腺素能受體激動劑。研究顯示［2］，右美托咪定心肌缺血再灌注損傷中具有抗氧化應激、抗炎及抗細胞凋亡等作用，且圍術期使用右美托咪定能降低患者心血管不良事件發生與死亡率［3］。為此，本研究探討了右美托咪定預處理對視網膜缺血再灌注損傷的保護效應與機制，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取30只雄性大鼠，來源于上海凱學生物科技有限公司，8周齡，體重為50～250 g。

1.2 方法

將30只雄性大鼠分為健康組、缺血組和預處理組，每組10只。健康組大鼠各項指標均正常，缺血組采用高眼壓法制造的大鼠視網膜缺血再灌注模型，預處理組對缺血組小鼠進行了右美托咪定預處理。分別于缺血前15 min作用及再灌注前5 min左右，健康組及缺血組按照5 mL/kg大鼠體重進行生理鹽水灌注，預處理組對缺血組小鼠按照25 μg/kg大鼠體重進行了鹽酸右美托咪定（揚子江藥業集團有限公司，國藥準字H20183219）預處理灌注。

視網膜缺血再灌注損傷模型建立方法：先對本實驗30只大鼠進行11%水合氯醛全身麻醉，再局部滴用0.4%倍諾喜言表進行眼部麻醉3次。麻醉后，采用固定器將大鼠按照仰臥位放置，采用0.5%作用的氯霉素眼藥水對大鼠眼部結膜囊進行嚴格清洗，最后用安爾碘對大鼠眼眶及其周圍視野進行嚴格消毒，防止其余物質影響實驗結果的準確性。將輸液器開始一端和血壓計相連的水銀柱輸氣管用三通管連接。通過進行不同程度的手部按壓將水銀柱升高至14 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。采用穿刺針頭插入大鼠右眼結膜，直至找到前房位置，通過觀察水銀柱記錄大鼠的眼內壓。視網膜缺血再灌注時，為防止角膜因長時間暴露過于干燥，需要進行間斷性的在角膜間滴加生理鹽水，通過人為按壓，將眼內壓升高至110 mmHg，為造成視網膜缺血再灌注損傷需要一直維持約1 h。隨后即可慢慢的關掉充氣柄開關，當眼內壓降低到14 mmHg后，為防止損傷眼膜及其周圍晶狀體組織，需要慢慢的拔除針頭，并于大鼠眼結膜囊內涂紅霉素眼膏預防感染。

1.3 觀察指標

比較三組大鼠于再灌注24 h時的視網膜電圖（ERG）、細胞凋亡指數（AI）、促凋亡因子（Bax）、抑凋亡因子（Bcl-2）表達水平、腫瘤壞死因子（TNF-α）及白細胞介素-6（IL-6）表達水平。

（1）比較三組大鼠于再灌注24 h 時ERG：大鼠在經過暗適應半小時后對被檢眼給予1%地卡因表面麻醉，0.5 g/L托吡卡胺進行充分散瞳。大鼠被檢眼用固定架固定后保持不動，在角膜上置封閉式角膜接觸鏡電極，另一電極置于額部，眼附近的面部安放參考電極，接地電極置于耳前。先作暗適應閃光視網膜電圖或圖像視網膜電圖，然后明適應1 min，再作光適應閃光視網膜電圖或圖像視網膜電圖。觀測a 與b 波的潛時和波幅，觀測震蕩波［4］。（2）比較三組大鼠于再灌注24 h時的AI：石蠟切片二甲苯和梯度乙醇脫蠟、水化后，使用PBS進行沖洗，于37 ℃下用蛋白酶K工作液進行處理；用細胞凋亡檢測試劑盒（德國Roche 公司，TUNEL）處理，于熒光顯微鏡（Olympus，ix53型）下觀察視網膜細胞凋亡。隨機選擇各切片5個視野，統計凋亡細胞與總細胞，凋亡細胞核棕褐色，AI=凋亡細胞計數/總細胞計數×100%［5］。（3）比較三組大鼠治療后Bax 及Bcl-2 表達水平：向視網膜組織加入蛋白裂解液以提取其蛋白，實用BCA試劑盒測定其濃度，蛋白樣品置于離心管內，加上樣緩沖液煮沸使其變性，保存備用；制備10%SDS-PAGE分離膠與5%濃縮膠，分別取蛋白樣品上樣，電泳后移入PVDF 膜中，封閉后加入Bax 一抗、Bcl-2 一抗孵育過夜。采用凝膠成像分析系統掃描測定灰度值，蛋白相對表達水平為目的蛋白條灰度值/內參β-actin 條灰度值。（4）比較三組大鼠治療后TNF-α及IL-6 表達水平：取患者治療前治療后靜脈血各5 mL，以3 000 r/min離心處理10 min，取上層血清，使用采用雙抗體夾心酶聯免疫法測定血清TNF-α、IL-6水平。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，方差齊使用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠左右眼ERG b波振幅情況

健康組ERG 顯著優于缺血組，缺血組ERG 顯著優于預處理組，三組大鼠組間比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 三組大鼠左右眼ERG b波振幅情況（±s）μV

表1 三組大鼠左右眼ERG b波振幅情況（±s）μV

組別健康組（n=10）缺血組（n=10）預處理組（n=10）F值P值左眼154.81±8.86 23.92±2.78 57.25±4.56 1 296.980＜0.001右眼160.62±7.24 32.14±7.29 73.78±9.35 667.990＜0.001

2.2 三組大鼠細胞凋亡指數情況

健康組AI 顯著優于缺血組，缺血組AI 顯著優于預處理組，三組大鼠組間比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 三組大鼠細胞凋亡指數情況（±s）%

表2 三組大鼠細胞凋亡指數情況（±s）%

組別健康組（n=10）缺血組（n=10）預處理組（n=10）F值P值AI 1.55±0.16 14.36±4.58 7.52±2.73 43.320＜0.001

2.3 三組大鼠凋亡因子情況

健康組Bax 顯著高于缺血組，缺血組Bax 顯著高于預處理組；健康組Bcl-2顯著低于缺血組，缺血組Bcl-2顯著低于預處理組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 三組大鼠凋亡因子情況（±s）

表3 三組大鼠凋亡因子情況（±s）

組別健康組（n=10）缺血組（n=10）預處理組（n=10）F值P值Bax 1.33±0.26 2.54±0.43 1.13±0.31 50.090＜0.001 Bcl-2 1.87±0.26 0.94±0.13 1.62±0.21 54.040＜0.001

2.4 三組大鼠炎癥因子水平情況

健康組TNF-α、IL-6 顯著高于缺血組，缺血組TNF-α、IL-6 顯著高于預處理組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 三組大鼠炎癥因子水平（±s）ng/mL

表4 三組大鼠炎癥因子水平（±s）ng/mL

組別健康組（n=10）缺血組（n=10）預處理組（n=10）F值P值TNF-α 1.33±0.20 2.68±0.24 1.52±0.21 113.060＜0.001 IL-6 1.23±0.25 2.86±0.37 1.63±0.08 105.190＜0.001

3 討論

視網膜缺血再灌注損傷為常見眼科疾病，臨床表現為血液再通后視網膜嚴重損傷，視功能顯著下降。右美托咪定為高選擇性與特異性的α2腎上腺素能受體激動劑，廣泛應用于圍術期及ICU中，具有抑制交感神經活性、鎮靜鎮痛、抗焦慮與催眠等功效。圍術期給予右美托咪定能維持機體血流動力學穩定，降低心臟以外風險。缺血再灌注損傷表現為電生理生化與形態等變化，最先發生的為電生理變化，ERG為視覺電生理中代表性部分，是客觀評價視功能成熟有效的無創方式。視網膜缺血再灌注損傷預防目的是延緩或阻止視神經細胞死亡，防止視功能繼續損失，故在神經保護藥物中對視功能評估極為重要［6］。ERG的a波來自于感受器層，反映視網膜光感受器電位變化，b 波集中反映視網膜雙極細胞與Muller細胞電活動；且視網膜各層，尤其是顆粒細胞層細胞均參與b 波形成。研究顯示［7］，視網膜缺血先影響b波，b波組織對缺血影響比a波產生更明顯。缺血組ERG 的a、b 波振幅均降低，且隨著時間延長而持續性下降，提示缺血再灌注后對視網膜功能損傷在持續，該部分損傷是因恢復血供的再灌注損傷導致。預處理組ERG 的a、b 波有所上升，說明右美托咪定對視網膜缺血再灌注損傷后有保護作用。視網膜為神經組織，血供來源于視網膜中央動脈，該動脈為終動脈，視網膜極易在缺血情況下受損。視網膜缺血再灌損傷機制較為復雜，為多因素作用結果，包括細胞內鈣超載、氧自由基損傷、細胞凋亡壞死及炎癥反應等病理生理過程［8］。細胞凋亡包括外源性或死亡受體途徑和內源性或線粒體途徑導致的細胞凋亡，前一途徑是細胞通過激活死亡受體接受接頭蛋白Fas 相關死亡結構域蛋白，招募激活半胱氨酸蛋白酶以啟動細胞凋亡。半胱氨酸蛋白酶在凋亡信號下，開放線粒體膜上通道，釋放內部細胞色素與半胱氨酸蛋白酶前提蛋白，激活其核酸酶或抑制胞內抗凋亡蛋白，進而誘發細胞凋亡［9］。細胞色素c為線粒體呼吸鏈重要組成，釋放于胞漿中能激活半胱氨酸蛋白酶9，使該酶3 激活以誘發細胞凋亡。研究顯示［10］，抑凋亡蛋白Bcl-2及促凋亡蛋白Bax 比值與細胞凋亡密切相關。大鼠視網膜缺血再灌注損傷能使視網膜神經節細胞凋亡，促進凋亡蛋白Bax表達上調，抑凋亡蛋白Bcl-2表達下調。由于內質網應激誘導細胞凋亡是通過Bcl-2家族調控實現，故可將內質網應激誘導細胞凋亡認為內源性或線粒體途徑的細胞凋亡。本研究中健康組Bcl-2顯著低于缺血組，缺血組Bcl-2顯著低于預處理組，提示右美托咪定能通過抑制細胞凋亡以減輕大鼠視網膜缺血再灌注損傷。本研究顯示，相對于健康組，模型組TNF-α及IL-6等炎癥因子水平顯著上升，說明視網膜缺血再灌注時機體組織產生大量炎癥因子，出現炎癥反應。相對于缺血組，預處理組視網膜組織中TNF-α及IL-6水平明顯降低，提示右美托咪定能抑制炎癥因子分泌，減弱大鼠視網膜缺血再灌注損傷模型中炎癥反應。

綜上所述，右美托咪定可能通過促進Bcl-2 表達，抑制Bax 表達以改善細胞凋亡指數，同時能夠抑制TNF-α、IL-6表達，降低視網膜缺血再灌注損傷炎癥效應，進而為改善視網膜缺血再灌注損傷發揮保護作用。