廈門某醫院2021年沙門菌血清分型及耐藥機制初步研究

胡鯉萍，魏 嫻，蔡芳芳，林燕蕓，劉玲英

廈門長庚醫院，福建 廈門 361028

沙門菌是影響人類生態行為活動的重要傳染病病原菌之一，是引起感染性腹瀉的常見病原菌，其普遍存在于自然界中，主要通過食物和水源引起人類感染，能引起傷寒、副傷寒或非傷寒性疾病。根據世界衛生組織（WHO）統計，每年沙門菌感染的病例約有9 000 萬，其中死亡人數近15萬人［1-2］。沙門菌感染呈現明顯的季節分布［2］，由于沙門菌血清型非常復雜，根據沙門菌O相抗原和H 相抗原的不同組合，WKLM 抗原表將沙門菌分為2 500 多個血清型［3］，準確對沙門菌血清分型就顯得尤為重要。目前，臨床上常用于治療沙門菌病的藥物主要為三代頭孢和氟荃喹諾酮類，但隨著這些抗生素的大量使用，世界各地均出現了大量三代頭孢和氟荃喹諾酮類耐藥的沙門菌［4-5］，給臨床治療沙門菌病和食品安全帶來巨大壓力。本研究選取2021年廈門長庚醫院分離的沙門菌株進行血清學分型、藥物敏感性試驗及對β-內酰胺和氟荃喹諾酮相關耐藥基因進行擴增、測序和分析，了解其流行狀況、病原學特征以及初步分析β-內酰胺和氟荃喹諾酮的耐藥機制，為沙門菌病的防控及臨床科學用藥提供科學依據，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

選取2021年1—12月廈門長庚醫院腹瀉病例糞便培養的沙門菌分離株，共計50株。

1.2 主要儀器和試劑

沙門、志賀菌屬瓊脂培養基（SS）平板、麥康凱平板、沙門菌血清（寧波天潤生物藥業有限公司，丹麥SSI）、VITEK 2 COMPACT 及配套的革蘭陰性菌（Gramnegative，GN）生化鑒定卡及藥敏卡（法國梅里埃GN13）。

1.3 方法

1.3.1 菌株的鑒定 將腹瀉患者糞便標本接種于SS和麥康凱平板上，置于35 ℃，5% CO2培養箱中培養18～24 h，挑取疑似菌落，分離純化，并經VITEK 2生化鑒定，符合沙門菌屬的進行后期實驗。

1.3.2 血清鑒定 根據WHO推薦的沙門菌O&H抗原標準化鑒定流程進行菌株血清型鑒定，并送至福建省疾病預防控制中心細菌室進行復核確認。

1.3.3 藥敏實驗 沙門菌對13種抗菌藥物（氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、氨曲南、厄他培南、亞胺培南、環丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因和復方磺胺甲噁唑）的耐藥性由藥敏卡（法國梅里埃GN13）測定，折點判斷依據2019年美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）標準［6］。多重耐藥菌（MDR）定義：至少同時耐3種和（或）以上不同類型抗菌藥物。

1.4 耐藥基因篩查

1.4.1 模板制備 采用熱裂解法，挑取數個純菌培養的新鮮菌落于100 μL 純水中，制成懸濁液。100 ℃煮沸10 min，12 000 r /min離心3 min，取上清作為反應模板，-20 ℃保存以備用。

1.4.2 聚合酸鏈反應（PCR）反應體系及條件 PCR 反應總體積為20 μL，其中2×Taq PCR MasterMix （TaKaRa 公司）10 μL，上下游引物（10 μmoL /L ）各1 μL，DNA 模板4 μL，dd H2O 4 μL。PCR 反應程序: 95 ℃預變性5 min，然后95 ℃30 s，50～57 ℃30 s，72 ℃30～60 s，進行33個循環，最后72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳條帶與目標預計大小一致的送測序驗證。

2 結果

2.1 菌株分離時間與人群分布特征

2021 年醫院共分離沙門菌共50 株，均來源于臨床病例，其中男29例，女21例。1—12月各月份均有沙門菌檢出，其中，5—10 月份檢出率較高，呈現夏秋季節性分布特征，見圖1。

圖1 不同月份及性別病例分布情況

2.2 分離株沙門菌血清群和型分布特征

經血清凝集O&H 抗原鑒定試驗及查White-Kauffmann表，50 株沙門菌共分為B、C1、C2-3、D、E1 五個血清群，9 個不同的血清型，其中以鼠傷寒沙門菌占比最高48.00%（24/50），其次為腸炎沙門菌14.00%（7/50），其他型別的沙門菌亦有少量檢出，見表1。

表1 50株沙門菌血清群/型分布特征

2.3 不同年齡沙門菌血清型分布情況

50 個檢出沙門菌病例的年齡分布在2 個月～90 歲之間，3歲以下兒童檢出率最高，為64.00%（32/50）；3歲以下兒童中檢出最高的血清型為鼠傷寒沙門菌，占38.00%（19/50），其他各年齡段檢出的沙門菌血清型分布，見表2。

表2 不同年齡血清型分布情況株

2.4 分離株藥敏情況分布

50株沙門菌對氨芐西林（72.00%）、氨芐西林/舒巴坦（56.00%）、復方磺胺甲噁唑（36.00%）耐藥率較高；菌株多重耐藥（MDR）率為40.00%。對頭孢他啶（12.00%）、頭孢曲松（16.00%）、氨曲南（16.00%）、頭孢吡肟（4.00%）、環丙沙星（22.00%）、左氧氟沙星（12.00%）、呋喃妥因（8.00%）較為敏感；未發現對哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、厄他培南耐藥的菌株，見表3。

表3 50株沙門菌的藥物敏感性特征

2.5 分離株耐藥基因篩查

2.5.1 超廣譜β-內酰胺酶TEM和CTX-M基因 50株沙門共檢出TEM 基因28 株，占總數的56.00%（28/50），28 株TEM基因陽性菌株均對氨芐西林耐藥，占氨芐西林耐藥菌株的77.78%（28/36）。CTX-M基因檢出數為8，占總數的16.00%（8/50），8 株檢出CTX-M 基因的菌株均對頭孢曲松和氨曲南耐藥，耐藥表型與耐藥基因型完全一致。另外，8 株檢出CTX-M 基因的菌株中5 株同時檢出TEM 基因。8 株CTX-M 基因測序結果在NCBI 比對表明，6 株為CTX-M-55型，2株為CTX-M-14型[7-10]。

2.5.2 喹諾酮耐藥區（QRDR）基因突變與質粒介導的喹諾酮耐藥基因（PMQR）50株沙門中檢出喹諾酮類藥物耐藥決定區（QRDR）存在gyrA 和gyrA 兩個基因突變類型，檢出gyrA基因突變株8株，其中2株同時發生parC基因突變。該8株菌株均為環丙沙星和左氧氟沙星不敏感株，占環丙沙星不敏感表型的61.54%（8/13）。gyrA 基因突變位點分別為第83和87位氨基酸，突變氨基酸類型分別為2株Ser83Tyr、2 株Ser83Phe、2 株Asp87Tyr、2 株Asp87Asn 和2 株Asp87Gly，其中2 株同時發生Ser83Phe-Asp87Gly 及parC:Ser80Ile 雙突變。質粒介導的喹諾酮耐藥基因（PMQR）aac（6'）-Ib-cr，oqxA，oqxB 在50 株沙門菌中的檢出率分別為26.00% （13/50），12.00% （6/50）和12.00%（6/50），這些陽性基因在環丙沙星和左氧氟沙星耐藥株和敏感株中均有檢出[11-13]。

3 討論

沙門菌是臨床和食品公共衛生安全中常見的一種腸道食源性致病菌，可導致人類感染傷寒、副傷寒和急性腸胃炎等。據統計，我國70%～80%細菌性食物中毒均由沙門菌引起［14］。禽肉、蛋等食品污染是沙門菌感染的主要來源，隨著抗生素的大量使用和濫用，臨床分離株中也出現不同程度的耐藥，尤其是臨床治療沙門菌的兩類常用藥物三代頭孢和氟荃喹諾酮類，也出現了大量的耐藥菌株，為此，加強臨床沙門菌菌株的血清學分型、耐藥監測及耐藥機制的研究就具有了重要意義。

本研究中回顧性分析樣本醫院分離的50株沙門菌株，共分離出5個血清群（B、C1、C2-3、D、E1），其中以B群為最大占比52.00%（26/50），B群中以鼠傷寒沙門菌24株為最常見分離株：而D群中主要以腸炎沙門菌為主要分離株，這與國內其他學者研究一致［15-16］。本次分離的菌株中主要來源于3 歲以下，共分離到32 株（19 株鼠傷寒沙門菌、3 株腸炎沙門菌、3 株倫敦沙門菌、2 株斯坦利沙門菌、2株里森沙門菌、1株波茨坦沙門菌、1株紐波特沙門菌、1 株明斯特沙門菌）；60 歲以上有4 株（2 株腸炎沙門、1株傷寒沙門菌、1株里森沙門菌）；來源于3～60歲的有14株（2株里森沙門菌、4株鼠傷寒沙門菌、2株腸炎沙門菌、1株倫敦沙門菌、1株波茨坦沙門菌、1株紐波特沙門菌、2株肯塔基沙門菌、1株明斯特沙門菌）。這可能由于小于3歲以下兒童機體免疫系統尚處于發育過程中，對沙門菌抵抗能力比較差，而大于60歲老年人，往往由于基礎性疾病以及身體機能的下降，也對沙門菌抵抗不足，成為沙門菌主要的攻擊對象［15］，為此應加強嬰幼兒及老年人沙門菌的健康監測，尤其在一些腹瀉病例中，應加強沙門菌的分離培養。

本次分離的50 株菌株中，對氨芐西林的耐藥達72.00%（36/50）、對氨芐西林/舒巴坦達56.00%（28/50），而TEM 基因檢出28 株，占總數的56.00%（28/50），占氨芐西林耐藥菌株的77.78%（28/36），提示氨芐西林的耐藥主要可能由TEM 基因介導。部分氨芐西林耐藥株未檢出TEM基因，可能與其他如AmpC等耐藥基因有關。50株菌對頭孢曲松耐藥和氨曲南耐藥率為16.00%（8/50），這與CTX-M 基因的檢出率一樣，且其耐藥表型與耐藥基因型完全一致。這表明三代頭孢耐藥主要由CTX-M 基因介導，這也與菌株對頭孢他啶耐藥較頭孢曲松較低符合，因為CTX-M 酶對頭孢他啶水解能力較頭孢曲松弱。測試菌株對環丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別為22.00%（11/50）和12.00%（6/50），gyrA基因突變位點均為83位和87位氨基酸突變，這與陳晶等［5］在武漢社區沙門菌中檢出的突變一致。

另外，本研究檢出2株同時發生Ser83Phe-Asp87Gly和parC:Ser80Ile 的雙突變株，通常認為雙重突變會介導高水平的喹諾酮耐藥，說明本地區已出現對喹諾酮高水平的耐藥，應引起足夠的重視。所有菌株對哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、厄他培南，均為敏感菌株，這與李美華等［16-17］的報道基本一致。近年來，沙門菌多重耐藥率越來越高，許多菌株呈現出不同的耐藥程度，甚至出現多耐藥現象，本研究分離的50 株菌株中也出現了20 株多重耐藥性菌株，達40.00%，這也提醒研究者在臨床分離的沙門菌存在比較嚴重的多耐藥現狀菌株，可能與患者在出現腹瀉后未及時就診而自行服用各種抗菌藥物及抗菌藥物有關［18-21］。

沙門菌感染是臨床常見的腹瀉病因之一，也是臨床比較棘手的問題。為預防因抗生素的濫用而導致臨床關注的多重耐藥超級細菌的出現，臨床微生物檢驗科應加強沙門菌分離培養、血清分型、耐藥監測及耐藥機制研究，為控制沙門菌臨床指導提供依據。