透射電子顯微鏡樣品的制備方法及技術綜述

盧照, 魏慧欣, 陳霞, 曾紅霞, 丁雨葵, 宋武林,2*

(1.華中科技大學分析測試中心, 武漢 430074; 2.華中科技大學材料科學與工程學院, 武漢 430074)

1932年,德國科學家Knoll和Ruska成功研制出世界上第一臺透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)。經過近90年的發展,TEM分辨率已經從亞微米量級提升至原子尺度級別的亞納米量級[1],功能也趨于多樣化,現如今廣泛應用于材料科學、生命科學、物理學等領域,是當今科學研究不可或缺的表征工具之一。

透射電子顯微鏡是采用波長很短的電子束透過樣品成像,由于電子束的穿透能力較弱,因此,對于TEM樣品的厚度有一定的要求,而且通過TEM觀察的區域一定要代表所研究的材料。理想的TEM樣品要求均勻分散或均勻減薄,具有良好的導電性,同時耐電子束轟擊。TEM樣品制備的方法有很多種[2-6],材料的類型不同,選取的制樣方法就會有所不同。適合的制樣方法對透射電鏡的觀察效果有著重要的影響。比如,粉末樣品或者材料分散液采用超聲分散法[7];合金樣品可以選擇單獨采用或者結合雙噴電解拋光法、離子減薄法或者聚焦離子束技術這幾種方法[8-12];對于一些有機樣品或者生物樣品,可以選擇超薄切片技術[13-14]或者負染法[15]?，F結合近幾年來的相關報道,重點介紹幾種目前適用于TEM樣品的制備方法及技術。

1 超聲分散法

對于粉末狀納米材料或納米材料分散液,最常用的制樣方法就是超聲波法[16-20]。超聲波法主要操作步驟如下:取少量樣品放入易揮發、與樣品不發生反應的溶劑當中,用超聲波充分分散后滴至微柵或支持膜上,常溫自然干或紅外燈烘干便可進行TEM觀察。根據樣品的性質選擇合適的溶劑,常用的溶劑有水、乙醇、丙酮、氯仿等。對于樣品尺寸偏大導致電子束無法穿透的材料,可以先將試樣放入瑪瑙研缽中研碎再進行超聲分散,比如氧化物陶瓷材料。圖1[21]為聚苯乙烯(PS)、表面為十二烷基磺酸鈉的聚苯乙烯(PS/SDS)、聚苯乙烯/聚多巴胺(PS/PDA)

圖1 四種不同納米粒子的TEM照片[21]Fig.1 TEM images of four different kinds of nanoparticles[21]

以及表面為十二烷基磺酸鈉的聚苯乙烯/聚多巴胺(PS/SDS/PDA)納米粒子的TEM結果,其制樣方法為去離子水超聲分散,再用滴管吸取少量滴置銅網上。圖2[22]是將催化劑研磨后取少許樣品分散在乙醇中,超聲分散2 min后將表面附有碳膜的銅網浸入乙醇分散液中取樣,最后晾干得到的TEM結果。

圖2 γ-Al2O3固載咪唑對甲苯磺酸鹽離子液體催化劑TEM照片[22]Fig.2 TEM images of [Hmim]TsO/γ-Al2O3 liquid catalyst[22]

2 雙噴電解拋光法

雙噴電解拋光法主要用于制備金屬和合金薄膜試樣[23-26]。在雙噴電解拋光之前,樣品一般要進行預減薄,其操作流程如下:用精密切割機或復式線鋸將塊體試樣切成0.3 mm左右的均勻薄片。接著用砂紙將薄片機械研磨至100 μm左右的厚度。隨后機械拋光或使用化學拋光液將薄片減薄至40 μm左右,最后用沖孔機沖下Ф3 mm的圓片以備終減薄使用。雙噴電解法是終減薄的其中一種方法,其原理如圖3所示:將拋光好的薄片作為陽極,用白金或不銹鋼作為陰極,在陽極試樣中心的兩側噴射電解液進行雙噴電解減薄。當圓片的中心出現小孔,電解雙噴設備的光敏元件輸出電訊號,拋光線路電源切斷,電解減薄終止。隨后立即將薄膜放入酒精中漂洗干凈以防形成氧化物類的污染層。張繼明等[27]利用FEI-F30高分辨透射電鏡對X100高級管線鋼中的馬奧島(MA)組織進行了詳細研究分析,部分TEM結果如圖4所示。其樣品的處理方法采用的是雙噴電解減薄法。詳細步驟如下:利用線切割方法在小尺寸試樣的橫截面上切下0.5 mm厚度薄片,在砂紙上機械減薄至約50 μm厚度薄片,然后利用Gatan沖樣機沖下Ф3 mm的圓片。隨后在司特爾Tenupol-5雙噴減薄儀上進行電解雙噴減薄,電解液為5%的高氯酸酒精溶液,減薄電壓為20 V,液氮制冷,使電解液的溫度始終保持在-20～-30 ℃。當電解雙噴的試樣穿孔后,立即將試樣取出并用酒精沖洗干凈,充分干燥后放入樣品盒中備用。Wang等[28]利用透射電子顯微鏡對5052鋁合金的組織結構進行分析時,對試樣的處理方法采用的也是雙噴電解法,其電解雙噴的條件如下:機械預減薄至50 μm的厚度,隨后進行電解雙噴,電解液的組成為30% HNO3+70% CH3OH(體積分數),直流電壓為16～20 V,溫度保持在-20 ℃。其TEM結果如圖5所示。電解電壓、電流、電解液的成分、溫度是雙噴電解制備TEM薄膜樣品的關鍵。不同的TEM樣品制備條件都不一樣,如表1所示。

圖3 雙噴電解減薄法的示意圖Fig.3 Schematic illustration of twin-jet electropolishing method

表1 電解雙噴減薄液的成分及減薄條件

TM為孿晶馬氏體;RA為殘留奧氏體圖4 X100管線鋼中馬奧島(MA)精細結構的TEM分析[27]Fig.4 TEM analysis of fine structure of MA island in the X100 pipeline steel[27]

B為晶向指數;N為應力圖5 不同條件下的TEM圖[28]Fig.5 TEM images at different conditions[28]

3 離子減薄法

離子減薄法可用于陶瓷材料、合金、復合材料、多相半導體以及截面樣品的TEM樣品制備[45-50]。使用離子減薄方法制備TEM樣品之前,同樣需要對樣品進行預減薄,一般采用機械研磨的方法或金剛石切割器將試樣減薄為100 μm厚度的薄片,隨后用沖孔機沖下Ф3 mm的圓片,對于陶瓷等脆性材料,需要用Ф3 mm的金屬環補強。再用凹坑機在圓片中央部位磨出一個凹坑以備離子減薄使用。離子減薄主要是利用高能惰性氣體離子(通常使用的是Ar離子)轟擊試樣表面,使表面的原子濺射出來,其原理圖如圖6所示,試樣在一特殊架上旋轉,離子束在樣品的兩側以一定的傾角(5°～30°)轟擊樣品相反的兩個面。開始時一般選擇快速減薄,設定高入射角的離子束。隨著樣品減薄特別是接近穿孔或已穿孔,離子束入射角要減小,以減少試樣表面損傷。所有材料在減薄過程中,最好使用液氮制冷以避免離子損傷產生的空穴引起擴散性的改變。樣品預減薄的厚度、離子束的入射角、電壓、束流大小等都會影響試樣的減薄效果,不同的樣品,工藝參數就會有所區別。江鵬等[51]研究的Al-5Ti-1B合金采用的制樣方法就是離子減薄法,先通過機械減薄的方法將試樣減薄至80 μm的厚度,然后用Gatan的691離子減薄儀進一步減薄,初始條件為離子束射角8°,電壓4.4 kV,電流0.02 mA。當試樣中心出現微孔時,將入射角降低至6°,繼續減薄20 min。樣品制備完畢后,用場發射透射電鏡Tecnai F30對其薄區進行觀察,結果如圖7所示。Hamu等[48]研究的AZ31鎂合金也是采用離子減薄法制備的TEM樣品,其制備過程如下:先從樣品中心切下直徑6 mm,厚度0.2 mm的薄片,然后機械拋光并沖下Ф3 mm的圓片,再在圓片中央部位磨出一個約為10 μm的凹坑,最后使用Gatan的691離子減薄儀進行減薄,電壓設定在5.0 kV,入射角為6°～4°。制備好的薄膜樣品使用透射電子顯微鏡JEOL 2010進行觀察,其結果如圖8所示。

圖6 離子減薄法的示意圖Fig.6 Schematic illustration of ion milling method

圖7 TiB的TEM明場相及其SAED花樣[51]Fig.7 TEM bright field image of TiB and its SAED pattern[51]

圖8 AZ31合金的TEM圖片[48]Fig.8 TEM image of the cast AZ31 alloy[48]

4 聚焦離子束技術(FIB)

聚焦離子束技術適用范圍相當廣泛,大多數塊體材料的TEM樣品都可以采用聚焦離子束(focused ion beam, FIB)技術,與傳統的電解雙噴和離子減薄等制樣方法相比,該技術具有精度高、速度快、成功率高等特點,特別是可以制備出具有特定微觀區域的TEM樣品[52-58]。該技術由聚焦離子束掃描電子顯微鏡(FIB-SEM雙束系統)來完成,其工作原理如圖9所示。電子束垂直安裝,離子束與電子束成一定的夾角安裝,通常稱電子束和離子束焦平面的交點為共心高度位置,在使用過程中樣品處于共心高度的位置即可同時實現離子束加工和電子束成像,并可以通過樣品臺的傾轉使樣品表面與電子束或離子束垂直。目前最常用的離子源為液態金屬Ga離子源,它具有低熔點,低蒸氣壓,良好抗氧化性,且束流范圍大,束斑尺寸小等特性。

圖9 FIB-SEM 雙束系統示意圖Fig.9 Schematic illustration of FIB-SEM dual-beam system

付琴琴等[59]對FIB-SEM雙束技術做了簡要介紹和典型的應用展示,其中包括透射電鏡樣品的制備。透射電鏡樣品的制備可以分為非提取法和提取法兩種。非提取法是針對已經預減薄的樣品,只需在其上面對感興趣區域進一步定點FIB加工即可制得TEM樣品,如圖10所示。提取法是采用能夠提高樣品自支撐性的H形或X形方法對樣品進行整體減薄,圖11即為H形減薄方法制備的TEM樣品。Sun等[57]利用透射電子顯微鏡觀察7150鋁合金微觀結構以探究其腐蝕性能,其TEM薄膜樣品就是使用FEI公司Helios系列FIB-SEM雙束系統制得。制備過程和制備條件如下:首先在感興趣的區域表面鍍上一層Pt(保護層),然后提取樣品,最后通過離子束進行減薄。為了減小離子束造成的損傷,減薄條件設定為電壓2 kV,電流23 pA。圖12(a)為7150鋁合金薄膜提取的位置圖,圖12(b)和圖12(c)為感興趣區域的STEM-HAADF圖。

圖10 非提取法制備 TEM 樣品[59]Fig.10 A typical TEM sample prepared through non-lift-out method[59]

圖11 H形減薄樣品[59]Fig.11 A sample thinned through H-type technology[59]

圖12 7150鋁合金的微觀結構[57]Fig.12 Microstructures of 7150 Al alloy [57]

5 超薄切片技術

超薄切片技術多適用于制備生物樣品、聚合物樣品以及比較軟的無機材料的TEM樣品[60-65]。生物樣品的制備過程相對復雜,大致可以分為以下幾個步驟:取材、固定、漂洗、脫水、浸透、包埋、修整定位和超薄切片。為了能夠觀察到接近生活狀態時的生物組織或細胞,要求取材速度越快越好。取完后立即使用固定劑固定,時間間隔越短越好,常用固定劑有四氧化鋨固定液、戊二醛固定液和多聚甲醛固定液。為了去除殘留的固定液,然后需要使用緩沖液對其進行漂洗,常用漂洗液為0.1 mol/L的磷酸緩沖液。由于大多數的包埋劑不溶于水,漂洗后的組織塊,應使用脫水劑去除組織中的游離水,有利于包埋劑均勻滲入組織塊內,常用的脫水劑有乙醇和丙酮。隨后選擇合適的包埋劑對其進行包埋使之具有良好的硬度和切割性能。也可以使用脫水劑來稀釋包埋劑,以實現包埋劑取代脫水劑,這個過程就是滲透。包埋處理一般使用的是丙烯基類的樹脂或環氧類的樹脂。將包埋塊修塊定位好后就可以超薄切片了,此步驟需要使用到超薄切片機,其原理如圖13所示。超薄切片機通過上下移動固定試樣的臂,使樣品通過金剛石刀進行切片,樣品每上下運動一次就自動向前進一點。通常,水槽中裝滿水,連續切出的薄片都漂浮在水面上,最后用銅網撈出。Yamaoka等[63]采用TEM研究紅色亞棲熱菌H328的特征。其樣品制備過程如下:提取,戊二醛固定液和磷酸鉀緩沖液固定,不同濃度的乙醇溶液脫水,正丁基縮水甘油醚和812環氧樹脂混合物浸潤,隨后轉移至純812環氧樹脂包埋,再用金剛石刀切片(70 nm厚度),醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色,最后用TEM觀察其形貌,結果如圖14所示。

圖13 超薄切片的示意圖Fig.13 Schematic illustration of ultrathin slicing method

圖14 紅色亞棲熱菌H328超薄切片的TEM圖[63]Fig.14 TEM images of ultrathin sections of Meiothermus ruber H328[63]

采用超薄切片技術制樣的聚合物樣品和無機樣品的操作步驟相對簡單一些,一般情況下只需要通過包埋、修整定位和超薄切片就可以完成前期制樣工作。Yang等[66]在研究嵌段共聚物微球時,為了清楚地觀察其內部結構,先將樣品包埋于環氧樹脂中,然后固化,隨后用在萊卡超薄切片機(UCT-GA-D/E-1/00, Germany)上用金剛石刀進行切片,其厚度控制在100 nm左右,再用300目的銅網撈出。最后用碘蒸氣染色1 h以增加樣品襯度。制備好的樣品用透射電子顯微鏡觀察,其結果如圖15所示。

圖15 PS133K-b-P2VP132K 微球橫截面切片的TEM圖[66]Fig.15 TEM images of the cross-sectional slices of PS133K-b-P2VP132K microspheres[66]

6 負染法

負染法主要用于制備病毒、細菌、細胞、生物大分子等TEM樣品[67-71]。負染色又稱為陰性反差染色,它主要是利用密度反差和靜電場反差來提高樣品的分辨力。生物樣品的負染過程相對簡便,先將樣品制成懸浮液,隨后采用懸滴法將其附著于載網上。具體方法如下:將懸浮液用毛細吸管或移液槍滴一滴附著于載網上,呈液珠狀。靜置數分鐘再用濾紙的邊角在液珠的邊緣吸走多余的液體。然后滴上一種合適濃度的染液靜置數分鐘,樣品不同染色時間差異很大。待染色結束自然風干后便可用透射電子顯微鏡觀察。一般可選擇的染色液有磷鎢酸溶液、磷鎢酸鹽溶液和醋酸鈾水溶液等。徐健[72]采用TEM觀察丙烯酸酯乳液的微觀結構之前,先將樣品稀釋150倍,再用磷鎢酸進行染色,其TEM結果如圖16所示,可以清晰地觀察到樣品為具有核殼結構的規整球形,內層白色為核層,外層灰色為殼層。Sahiro等[73]研究表明Preyssler型磷鎢酸鉀(K(15-n)[P5W30O110Mn+],M=Na+,Ca2+,Ce3+,Eu3+,Bi3+,Y3+)對病毒類樣品是一種具有高性能的陰性染色試劑。圖17所示為負染法的操作流程,先將病毒吸附于碳膜上,然后滴加含重金屬元素的染色劑,過一定時間移走多余的染色液,自然干以后就能用于電鏡觀察。圖18為T4噬菌體的TEM圖,使用的是一種Preyssler型Eu3+包裹的K12[P5W30O110Eu(H2O)]染色劑,質量分數為0.3%的水溶液。

圖16 MAA6乳膠粒的TEM圖[72]Fig.16 TEM images of MAA6 emulsion particles [72]

圖17 負染法[73]Fig.17 Negative staining method[73]

圖18 T4噬菌體的TEM圖[73]Fig.18 Transmission electron microscopy (TEM) images of T4 phages[73]

7 總結與展望

透射電子顯微鏡是一種研究物質微觀形貌、顯微結構以及微觀成分的高端儀器,可以實現在原子尺度上對“加工處理-結構-性質”的關聯性研究。因此,透射電子顯微分析技術是科學研究過程中不可缺少的表征手段。然而,能否制備好透射電子顯微鏡樣品是利用好該儀器的關鍵因素。對于不同類型的透射電子顯微鏡樣品,應該采取不同的制樣方法。這些方法可以總結為:超聲分散法、雙噴電解拋光法、離子減薄法、聚焦離子束技術、超薄切片技術以及負染法。對于粉末樣品及大多數懸浮液,一般可以采用超聲分散法制樣;對于金屬、陶瓷等塊狀樣品,可以采用雙噴電解拋光法、離子減薄法或者聚焦離子束技術中的一種或者幾種結合的方式進行制樣;對于一些特殊的有機薄膜樣品以及生物試樣等樣品,可以采用超薄切片技術;只包含輕元素的生物樣品則需采用負染法制樣。不同樣品的制樣不僅僅選擇的制樣方法會有所不同,而且工藝參數也會不同。選擇合適的制樣方法及最佳參數將會大大提高透射電子顯微鏡的表征效果,更有利于推進科研工作。無損、高精度、高效率、自動化的制樣技術將是未來透射電子顯微鏡制樣設備發展的主要方向。