過量表達氣囊蛋白強化茂原鏈霉菌合成胰蛋白酶

蘇瑩瑩,劉松*

1(江南大學,未來食品科學中心,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學,糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室,江蘇 無錫,214122)

氣體囊泡是具有剛性空心結構并充滿氣體的細胞器[1],廣泛存在于藍藻、異養細菌、厭氧光合細菌和嗜鹽古菌等原核生物中[2]。一般認為,氣體囊泡可為藍藻細胞提供浮力,從而更好地利用光和養分[3]。在嗜鹽古菌中,氣體囊泡則有助于其在極端壓力和高鹽條件下存活[2,4]。結構分析顯示,氣體囊泡主要由氣囊蛋白(gas vesicle protein, Gvp)構成[5],在不同生物體中已經鑒定出8～14個編碼可調控氣體囊泡形成的基因。嗜鹽古菌中,氣囊由2個相反的基因簇gvpANO和gvpFGHIJKLM組成[6],GvpA作為大多菌體氣囊的主要結構蛋白,高度保守且具有很強的疏水性[7];gvpO則可能參與了gvpACN的轉錄激活或有助于其mRNA的穩定性,敲除gvpO會顯著降低gvpA、gvpC和gvpN的轉錄水平且無法形成氣體囊泡[8]。研究表明,Gvp的表達受環境因素的調節[2]。在沙雷氏腸桿菌(Serratiasp.ATCC 39006)中觀察到的氣體囊泡,其形成就需要氧氣的刺激,并受到群體感應信號分子N-?；呓z氨酸內酯的調控[9]。值得注意的是,重組表達編碼藍藻氣體囊泡基因簇能使大腸桿菌細胞浮于培養基表面[10]。因此,過量表達氣體囊泡基因簇能有效調控細胞的生理狀態。

在鏈霉菌基因組中研究者同樣發現了gvp基因簇,如天藍色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)的gvpOAFGYZJLSK[2-3]。不同于藍藻和嗜鹽古菌,鏈霉菌gvp基因簇一般缺少gvpC、gvpN和gvpV等氣囊蛋白基因。值得注意的是,藍藻和嗜鹽古菌中的輔助蛋白GvpC能使氣體囊泡更穩定抗壓,GvpN或GvpV則有助于促進氣囊組裝[9]。因此,多數鏈霉菌并不能檢測到氣體囊泡的形成[11],過量表達鏈霉菌gvp基因簇也不能使大腸桿菌細胞漂浮[12]。一般認為,鏈霉菌主要是利用GvpA的疏水性N端形成疏水表面,以便于其氣生菌絲穿過氣液界面[3]。最近,鏈霉菌(Streptomycessp.) CB03234-S中發現的基因簇gvpOAFGJLSK(圖1)缺少了鏈霉菌中常見的gvpY和gvpZ,并能在富含氮源的培養條件下觀測到胞內的類似氣囊蛋白的結構[13]。此外,過量表達gvpOAFGJLSK增加CB03234-S中的氣體囊泡數量和十元環烯二炔天賜霉素的產量,使其鏈霉菌菌體形態和代謝產生重要的影響[13]。因此,調控gvpOAFGJLSK的合成可能是促進鏈霉菌產物合成的新途徑。

圖1 不同來源的gvp基因簇組成Fig.1 Composition of gvp gene clusters from different sources

基因組分析顯示,S.mobaraensisDSM40587的gvp基因gvpOAFGJLSK(gvp40587)與CB03234-S的gvp基因簇具有相同的組成(圖1),均不含gvpY和gvpZ。在本研究中,將S.mobaraensisDSM40587胰蛋白酶(S.mobaraensistrypsin,SMT)過量表達于缺失谷氨酰胺轉氨酶基因(tg)的S.mobaraensisDSM40587(smY2019Δtg)中[14],研究了過量表達gvpA、gvpO及基因簇gvp40587對SMT合成、生長及代謝的影響。研究結果將有助于認識Gvp功能,也為鏈霉菌產酶的優化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

S.mobaraensisDSM40587為本研究室保藏。tg缺失的S.mobaraensis(smY2019Δtg)為研究室前期工作中構建[14]。大腸桿菌(EscherichiacoliJM109)為本章實驗所用克隆宿主。本研究使用的其他菌株與質粒如表1所示。

表1 本研究所使用的菌株與質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 試劑

高保真DNA聚合酶(PrimeSTAR GXL)、平末端磷酸化連接酶(Blunting Kination Ligation Kit),寶生物工程(大連)有限公司;高保真DNA聚合酶(KOD FX),東洋紡(上海)生物科技有限公司;一步克隆連接試劑盒One Step Cloning Kit(ClonExpressTMII),南京諾唯贊生物科技股份有限公司;限制性內切酶、蛋白預制膠、蛋白質Marker、MES蛋白電泳緩沖液,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;硫鏈絲菌素,生工生物工程(上海)股份有限公司;質粒抽提試劑盒、DNA產物純化試劑盒、基因組提取試劑盒、ATP含量檢測試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;NADPH/NADP+測定試劑盒,碧云天生物技術有限公司;底物Nα-苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基苯酰胺(BAPNA),美國Sigma公司;RNA提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司;反轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒,寶生物工程(大連)有限公司。其他常規試劑及藥品為國產或進口分裝。

1.1.3 培養基

LB培養基(g/L):胰蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10。

GYM產孢培養基(g/L):葡萄糖10,酵母粉4,麥芽粉3。

2×YT孢子萌發培養基(g/L):蛋白胨16,酵母粉10,NaCl 5。

種子培養基(g/L):甘油20,酵母粉5,胰蛋白胨20,K2HPO44,MgSO42,pH 7.2。

發酵培養基(g/L):甘油20,酵母粉5,胰蛋白胨20,大豆粉20,KH2PO42,K2HPO44,MgSO42,CaCO32,pH 7.2～7.4。

固體培養基在此基礎上添加1.5%～2%瓊脂粉。121 ℃濕熱滅菌15 min后備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 整合表達載體的構建

以S.mobaraensisDSM40587基因組(GenBank No.CP083590)為模板,分別擴增基因K7I03_26340上游1 056 bp(同源重組左臂)和下游999 bp(同源重組右臂)、SMT基因K7I03_25045片段(792 bp)和tg啟動子片段。使用限制性內切酶BamH I和EcoR I切割pJTU1278獲得同源重組質粒片段。采用一步克隆試劑盒將上述5個片段融合,得到SMT整合表達質粒pJTU1278-SMT。以S.mobaraensisDSM40587基因組為模板,分別擴增tg位點上游1 406 bp(同源臂)、相關氣囊基因gvpA、gvpO及完整基因簇gvp40587。采用一步克隆試劑盒將gvpA、gvpO及完整基因簇gvp40587分別與tg同源臂和pJTU1278酶切片段連接,得到整合表達質粒pJTU1278-gvpA、pJTU1278-gvpO和pJTU1278-gvp40587。將重組質粒轉化E.coliJM109,并進行PCR驗證。載體構建及驗證相關引物見表2。

表2 本研究所使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.2.2S.mobaraensis原生質電轉化

取70 μLS.mobaraensis原生質體溶液與5～10 μg構建的整合表達質?；旌?轉入0.1 cm電轉杯中,于2 500 V和25 Ω電擊1次;電擊結束立即加入1 mL預冷的1 mol/L山梨醇,最后轉移至無菌的1.5 mL EP管中,于30 ℃、220 r/min搖床中培養2 h。將培養液涂布至含30 μg/mL硫鏈絲菌素的GYM平板,培養5～6 d篩選含單交換的轉化子。將轉化子轉接至無抗性GYM平板松弛培養3～4 d后,通過PCR驗證和基因測序分析,篩選獲得雙交換轉化子。相關PCR驗證引物見表2。

1.2.3 重組S.mobaraensis搖瓶發酵

將GYM平板上獲得的重組菌轉化子平板上劃線后,置于30 ℃恒溫培養箱內培養4～5 d。隨后用無菌涂布棒適量刮取GYM固體平板上的菌絲,將孢子懸液以終濃度106個/mL接種至種子培養基(30 μg/mL硫鏈絲菌肽),于30 ℃和220 r/min搖床中培養24～36 h后,以8%(體積分數)接種量轉接至含有30 mL發酵培養基(30 μg/mL硫鏈絲菌肽)的250 mL三角瓶中,繼續于30 ℃和220 r/min搖床中培養72 h。

1.2.4 胰蛋白酶酰胺酶活力測定

每隔12 h,將不同時間點的發酵樣品取1 mL于10 000 r/min、10 min進行離心,之后取上清至EP管中,放冰上待測。參考文獻[15]的方法進行測定:以BAPNA為底物測定胰蛋白酶酰胺酶活力:將890 μL緩沖液溶液(50 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl, 20 mmol/L CaCl2)與10 μL BAPNA (100 mmol/L)混合均勻;在37 ℃下預熱10 min后,迅速加入100 μL酶液混合均勻,在37 ℃、410 nm條件下測定其吸光值的變化值(ΔA410/min)。酶活定義為:在37 ℃下,ΔA410/min升高0.1即為胰蛋白酶的1個酰胺酶水解單位。計算如公式(1)所示:

(1)

1.2.5 SDS-PAGE凝膠電泳分析

取30 μL發酵上清液與10 μL的5xloading buffer混合均勻后,于90 ℃加熱10 min后待用。SDS-PAGE凝膠電泳具體操作方法參考Invitrogen公司Bis-Tris預制凝膠說明書。

1.2.6 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

取基礎發酵培養基中培養36 h的發酵液,于4 ℃、12 000 r/min、2 min離心,收集菌體待用,隨后用RNA提取盒提取總RNA,根據說明書中的步驟進行操作。對提取RNA的濃度、純度及完整性進行驗證,并以RNA為模板,使用PrimeScriptTMRT試劑盒逆轉錄成cDNA,最終,在Light Cycler 480 System(Roche Diagnostics Ltd.,Rotkreuz,Switzerland)中使用SYBR Green I嵌合熒光法對qRT-PCR進行分析。以S.mobaraensis基因組中的hrdB基因為內參基因,用2-ΔΔCt法計算不同樣品中不同基因的相對倍數變化。qRT-PCR使用的引物列于表3中。

對于局部損壞的素土后屋面，采用干土+草泥方式修補。對于完全需要重新改造的素土后屋面，拆除修平后，在原屋面上鋪設聚苯板保溫層+塑料薄膜或草泥抹面的簡易厚屋面。有立柱溫室和骨架荷載良好的溫室，采用墊板+聚苯板+鋼網砼層，墊板+聚苯板+CSM墻面材料等復合后屋面。對于原屋面為水泥抹面面層時，如裂縫、剝落現象，應將原墻面鑿毛，否則，應將原涂層鏟除，重新進行水泥抹面，裂縫可采用防水瀝青灌縫處理。后屋面改造升級后，達到整個后屋面頂部成南高北低的斜坡，坡面平整無縫，具備防水、隔熱保溫的功能，并在后屋面加蓋保溫被，或覆蓋棚膜等方式，進行防水保溫。

表3 qRT-PCR所用引物Table 3 Primers used for qRT-PCR

1.2.7 菌絲生長量測定

將不同時間點的發酵樣品取1 mL進行離心,留下菌體,每隔12 h取樣1 mL至1.5 mL提前稱重的空EP管(m1)中。將菌液離心,10 000 r/min、10 min,留下菌體,EP管開蓋放至65 ℃烘箱中干燥直到恒重,取出稱量(m2)。計算菌體在不同時間點的質量(m2-m1),繪制細胞干重曲線。

1.2.8 ATP測定

將不同時間點的發酵樣品取1 mL進行離心,留下菌體,用PBS緩沖液(137 mmol/L NaCl,2.7 mmol/L KCl,10 mmol/L Na2HPO4,1.8 mmol/L KH2PO4,pH 7.4)洗滌3次后進行超聲破碎1 min,隨后10 000 r/min、4 ℃離心10 min,取上清至另一EP管中,加入500 μL氯仿充分振蕩混勻,10 000 r/min、4 ℃離心3 min,取上清至冰上待測,胞內ATP測定按ATP檢測試劑盒說明書操作。

1.2.9 NADPH/NADP+測定

將不同時間點發酵樣品取1 mL進行離心,留下菌體,用PBS洗滌3次后加入適量預冷的NADP+/NADPH提取液,輕輕吹打促進細胞裂解,隨后10 000 r/min、4 ℃離心10 min,取上清至冰上待測,NADPH/NADP+測定按輔酶II NADP(H)含量試劑盒說明書操作。

1.2.10 透射電鏡分析

2 結果與分析

2.1 胰蛋白酶在S.mobaraensis中的整合表達

胰蛋白酶是一種重要的堿性絲氨酸蛋白酶[15],廣泛應用于皮革、紡織、制藥和食品等行業[16]。為實現胰蛋白酶的高效表達,將S.mobaraensisDSM40587來源的胰蛋白酶SMT完整的開放閱讀框與tg啟動子和K7103_26340位點的左右同源臂融合并克隆至pJTU1278,構建得到SMT整合表達質粒pJTU1278-SMT(圖2-a)。將pJTU1278-SMT轉化smY2019Δtg,通過PCR驗證和基因測序篩選得到在K7103_26340位點整合SMT表達框的smY2019Δtg-SMT(圖2-a、圖2-b)。

a-雙交換整合胰蛋白酶基因示意圖;b-DNA核酸電泳圖(M-DNA標準分子質量;1-smY2019Δtg;2-smY2019Δtg-SMT);c-重組菌發酵過程酶活力分析;d-重組菌發酵過程蛋白電泳分析(M-蛋白marker;1-12 h;2-24 h;3-36 h;4-48 h;5-60 h)圖2 胰蛋白酶在smY2019Δtg中的表達分析Fig.2 The analysis of trypsin expression in smY2019Δtg

分別對smY2019Δtg-SMT和smY2019Δtg發酵,測定胰蛋白酶酰胺酶活力和進行SDS-PAGE電泳分析。酶活力分析顯示,在發酵上清液中胰蛋白酶活力在24 h達到最高值8.0 U/mL,發酵36 h后活力迅速下降(圖2-c)。盡管未過量表達SMT,smY2019Δtg發酵上清液仍能檢測到胰蛋白酶活力,并在發酵24 h達到最大值2.2 U/mL。SDS-PAGE分析顯示,smY2019Δtg-SMT的24 h和36 h發酵上清液有較明顯的SMT條帶(理論分子質量26 kDa)(圖2-d),而在smY2019Δtg發酵上清液中未見明顯的SMT條帶。上述結果表明,smY2019Δtg內源的SMT具有一定的表達量,采用tg啟動子在K7103_26340位點整合表達SMT能顯著提升其胞外表達水平。

2.2 過量表達gvp基因對胰蛋白酶發酵的影響

目前,Gvp在胞內的組裝機制尚不清楚,相關基因在不同宿主中的功能存在一定的差異[17]。例如,過量表達結構蛋白GvpA和輔助蛋白GvpC不能促進嗜鹽古菌中氣體囊泡形成[18],而表達藍藻Anabaenaflos-aquae和Planktothrixrubescens中GvpA和GvpC則能使釀酒酵母中產生氣體囊泡[19]。為分析氣體囊泡對SMT分泌表達的影響,通過單交換在smY2019Δtg-SMT中tg位點整合表達內源gvpA、gvpO和完整基因簇gvp40587,分別得到重組菌smY2019Δtg-SMT-gvpA,smY2019Δtg-SMT-gvpO和smY2019Δtg-SMT-gvp40587(圖3-a)。

將構建的重組菌進行發酵,胰蛋白酶酰胺酶活力和SDS-PAGE電泳分析SMT表達情況。結果顯示,smY2019Δtg-SMT-gvp40587發酵到36 h胞外胰蛋白酶活達到最大值13.14 U/mL,較smY2019Δtg-SMT最高酶活(24 h)提高了64.3%;整個發酵過程的smY2019Δtg-SMT-gvp40587胞外酶活力均明顯高于smY2019Δtg-SMT,后期酶活下降速度相對較慢(圖3-b)。與smY2019Δtg-SMT相同,smY2019Δtg-SMT-gvpA胞外最高胰蛋白酶活在24 h達到最高值,但較前者提高17%(圖3-b)。如圖3-c所示,smY2019Δtg-SMT-gvp40587和smY2019Δtg-SMT-gvpA發酵上清液胰蛋白酶條帶較smY2019Δtg-SMT明顯增粗(圖3-d)。然而,smY2019Δtg-SMT-gvpO胞外胰蛋白酶及電泳條帶均與smY2019Δtg-SMT差異不大(圖3-c、圖3-d)。上述結果表明,表達完整的氣囊蛋白基因簇相對于僅表達部分氣囊結構蛋白基因能更有效的促進SMT在S.mobaraensis中的合成。

2.3 S.mobaraensis中gvp基因的轉錄水平分析

為確認gvp基因在S.mobaraensis中的表達情況,分別對smY2019Δtg-SMT、smY2019Δtg-SMT-gvpA、smY2019Δtg-SMT-gvpO和smY2019Δtg-SMT-gvp40587進行定量PCR分析。在smY2019Δtg-SMT-gvpA中,除了gvpA之外,gvpO、gvpS和gvpK均不同程度上調。在gsmY2019Δtg-SMT-gvpO中,gvpO、gvpG和gvpS有較明顯上調(圖4)。gvp基因簇各基因間的表達會互相影響已經有相關報道。例如,敲除嗜鹽古菌中gvpO基因導致GvpA表達量的顯著下調[8]。然而,確切gvp基因表達調控機制仍不清楚,有待后續研究。在smY2019Δtg-SMT-gvp40587中,關鍵調控基因gvpO和結構蛋白基因gvpA的轉錄水平較smY2019Δtg-SMT分別提高4.2倍和3.7倍;此外,其他gvp基因轉錄水平也均高于對照菌株(圖4)。值得注意的是,輔助蛋白基因gvpJ僅在smY2019Δtg-SMT-gvp40587中明顯上調(圖4)。一般認為,gvpJ通過與gvpA相互作用提升氣囊的穩定性[20]。因此,gvpJ表達水平的提升可能是smY2019Δtg-SMT-gvp40587中SMT高效合成的重要原因。

圖4 S.mobaraensis中gvp基因的轉錄分析Fig.4 Transcriptional analysis of gvp genes in S.mobaraensis

2.4 過量表達gvp基因對S.mobaraensis生理狀態的影響

由于氣體囊泡內部充滿氣體[1],過量表達gvp基因可能有助于供氧和ATP等能量物質的合成。在Streptomycessp.CB03234-S中過量表達其內源氣囊蛋白基因簇后,研究者發現了菌株的生長形態變化和次級代謝物產量增加[13],但并未對胞內的ATP等生理狀態參數進行測定。為分析過量表達gvp基因對S.mobaraensis生理狀態的影響,分析了gvp基因過量表達菌株的菌體生長、ATP及還原力水平等生理狀態關鍵指標。

結果顯示,smY2019Δtg-SMT-gvp40587的菌絲生長量在24～60 h略高于smY2019Δtg-SMT和其他gvp過表達菌株(圖5-a)。此外,smY2019Δtg-SMT-gvp40587胞內的ATP含量和NADPH/NADP+明顯高于其他菌株,且在36 h時達到最大值;其中,smY2019Δtg-SMT-gvp40587的ATP含量和NADPH/NADP+分別較smY2019Δtg-SMT高1.4倍和0.4倍(圖5-b、c)。酶或蛋白質的合成依賴于胞內能量和前體供給[21]。因此,能量和還原力增加可能是SMT在smY2019Δtg-SMT-gvp40587高效合成的重要原因。值得注意的是,過量表達纖維素酶A導致了變鉛青鏈霉菌(Streptomyceslividans)TK24中NADPH的增加[22]。目前,關于鏈霉菌gvp基因簇功能的研究極少,過量表達gvp基因簇影響S.mobaraensis胞內能量水平和前體供給的機制還有待進一步研究。為確認過量表達gvp基因簇是否增加了胞內氣體囊泡數量,對上述重組菌進行了透射電鏡分析。發酵培養基包含不溶的大豆粉,不易與S.mobaraensis菌絲分離,嚴重干擾了透射電鏡觀測。因此,選取固體培養獲得的菌絲進行分析。然而,在smY2019Δtg-SMT-gvp40587和smY2019Δtg-SMT胞內均未見明顯的氣囊蛋白形成(圖5-d),可能是由于固體培養環境不利于氣體囊泡的形成。在后續研究中,將換用其他不含固形物發酵培養基發酵制備smY2019Δtg-SMT-gvp40587和smY2019Δtg-SMT菌絲體。

a-重組菌生長情況;b-重組菌胞內能量;c-重組菌還原力;d-透射電鏡分析圖5 過量表達gvp基因對S.mobaraensis生長及代謝的影響Fig.5 The effects of overexpressing gvp genes on the cell growth and metabolism of S.mobaraensis

3 結論

盡管研究者已經在大量的鏈霉菌中發現了gvp基因簇,然而其生理功能仍不清楚。本研究在整合表達胰蛋白酶的菌株smY2019Δtg-SMT中,分別過量表達了gvpA、gvpO以及整個gvp基因簇,首次發現了gvp基因簇或主要結構基因gvpA能促進酶在S.mobaraensis中表達。此外,過量表達gvp基因簇可顯著提高胞內的ATP含量和NADPH/NADP+。因此,能量和還原力增加可能是SMT在gvp基因簇過量表達菌株中高效合成的重要原因。值得注意的是,Streptomycessp.CB03234-S和S.mobaraensis的gvp基因簇中均不含有多數鏈霉菌的gvpY和gvpZ,其缺失對于調控氣囊蛋白形成的作用還有待進一步分析?；趃vp基因對SMT在S.mobaraensis中合成的重要影響,通過調控gvp基因的表達時間和強度可能成為提高合成蛋白及其他代謝產物產量的新策略。