過表達內源Trswo1基因提高里氏木霉纖維素酶對玉米秸稈水解效率的研究

莫易,冉小琴,王贊丞,陳雨點,彭念,李江洪,李勇昊*

1(重慶科技學院 化學化工學院,重慶,401331)2(工業發酵微生物重慶市重點實驗室(重慶科技學院),重慶,401331)

由秸稈為代表的木質纖維素類生物質資源轉化為生物燃料和生物基化學品是引領“烴經濟”向“糖經濟”轉型的重要突破口[1]。然而,秸稈類生物質堅韌的超分子結構,需要高效的纖維素酶才能將纖維素水解為可發酵性糖。纖維素酶高產菌株主要來自里氏木霉(Trichodermareesei)[2],T.reesei纖維素酶主要包括內切纖維素酶、外切纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和多種纖維素降解輔助蛋白[3],它們協同將纖維素水解為葡萄糖,但這些蛋白的合成均需誘導。

前期通過β-葡萄糖苷酶催化高濃度葡萄糖制備葡萄糖-槐糖混合物(mixture of glucose and sophorose, MGD)可以高效誘導T.reesei合成纖維素酶[4],然而蛋白質組學研究發現相比于木質纖維素固體誘導物,雖然可以合成更高水平的外切纖維素酶和內切纖維素酶,但是纖維素降解輔助蛋白表達量明顯降低,尤其是膨脹素(swollenin,SWO1)[5]。已有研究表明SWO1雖然無糖苷水解酶活性,但可以破壞木質纖維素致密的高分子結構,從而協同纖維素酶提高催化速率[6-7]。目前已發現十多種SWO1作為纖維素降解輔助蛋白可提高纖維素酶水解效率[8-9]。其中T.reesei內源SWO1是最先被發現的,但尚無在T.reesei中過表達該基因并利用MGD作為誘導物刺激纖維素酶合成的研究。

因此本研究在T.reeseiRut C30中利用組成型強啟動子丙酮酸脫羧酶1(pyruvate decarboxylase1, PDC1)高效表達內源Trswo1基因,重組菌株利用MGD為誘導物發酵生產纖維素酶,并被用于水解堿預處理玉米秸稈(alkali pretreated corn straw, APCS);最后通過X射線衍射(X-ray diffraction, XRD)和掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)分析SWO1蛋白協同纖維素酶降解纖維素的分子機制。研究結果為T.reesei利用MGD為誘導物合成高水解效率的纖維素酶系具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與質粒

T.reeseiRut C30(NRRL 11460)惠贈于美國農業研究菌種保藏中心;大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態購自北京擎科生物科技有限公司。根瘤農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)AGL-1惠贈于青島農業大學咸洪泉教授。pPTPDC1由本實驗室之前研究構建的表達載體,包括PDC1啟動子和終止子以及潮霉素B抗性基因,在T.reesei中使用潮霉素B作為篩選標記[5]。

1.1.2 培養基

LB培養基(g/L):蛋白胨10,NaCl 10,酵母浸粉5,如配制固體培養基則添加20 g/L瓊脂粉。

PDA培養基(g/L):馬鈴薯浸出液200,葡萄糖20,瓊脂20。

固體生孢培養基(g/L):麥芽提取物30,瓊脂20。

種子培養基(g/L):葡萄糖4,玉米漿粉10。

纖維素酶發酵培養基(g/L):MGD 10,蛋白胨1,尿素0.3,(NH4)2SO41.4,KH2PO42,MgSO4·7H2O 0.3,CaCl20.4,FeSO4·7H2O 5 mg/L,MnSO4·H2O 1.7 mg/L,ZnSO4·7H2O 1.4 mg/L,0.2 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 5.0)500 mL/L。

1.1.3 試劑

植物總RNA提取試劑盒(離心柱型)、TSINGKE TSV-S1 Trelief?SoSoo Cloning Kit、2×TSINGKE?Master qPCR Mix(SYBR Green 1 with UDG),北京擎科生物科技有限公司;SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time),TaKaRa公司;限制性內切酶BsiWⅠ,美國New England Biolabs公司;β-葡萄糖苷酶,夏盛(北京)生物科技開發有限公司。

MGD是由β-葡萄糖苷酶催化葡萄糖轉糖苷反應合成[4]。具體以0.2 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 4.8)配制600 g/L葡萄糖,加入20 CBU/g葡萄糖的β-葡萄糖苷酶。65 ℃孵育72 h后在105 ℃下處理5 min失活β-葡萄糖苷酶。離子色譜測定MGD含有410.20 g/L葡萄糖、60.56 g/L龍膽二糖、9.34 g/L纖維二糖和13.66 g/L槐糖,其中槐糖為已知T.reesei誘導合成纖維素酶最強誘導物。

APCS由2%(質量分數)NaOH于121 ℃條件下處理90 min,堿處理后的APCS用自來水洗至中性,置于烘箱烘干備用,得到的APCS室溫保存[10]。

3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)試劑的配制方法如下。甲液:稱取NaOH 104 g溶解于1 300 mL蒸餾水中,再加入30 g 3,5-二硝基水楊酸,加熱溶解;乙液:稱取910 g酒石酸鉀鈉溶于2 500 mL蒸餾水中,溶解后加入25 g結晶酚和25 g NaHSO3,混勻。將上述甲、乙兩液混合,加入1 200 mL蒸餾水(總體積5 000 mL),貯于棕色瓶中備用,在室溫下放置1周后可以使用。

1.1.4 儀器與設備

SW-CJ-1FD潔凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司;ZWY-240恒溫培養振蕩器,上海智城分析儀器制造有限公司;MJ-150F-I霉菌培養箱,上海一恒科學儀器有限公司;A300基因擴增儀,杭州朗基科學儀器有限公司;CFX Connect熒光定量PCR儀,美國Bio-rad公司;希爾曼S-10生物傳感器分析儀,深圳市西爾曼科技有限公司;X射線衍射儀XRD-7000,日本島津公司;JSM-7800F掃描電子顯微鏡,日本電子株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 過表達Trswo1基因質粒與T.reesei基因工程菌的構建

T.reeseiRut C30孢子接種于種子培養基于28 ℃培養24 h,再將菌絲體以10%(體積分數)接種到含有50 mL纖維素酶發酵培養基的250 mL錐形瓶中于28 ℃培養48 h。取樣提取RNA后逆轉錄為cDNA;以cDNA為模板,swo1-F/R(含有20 bp pPTPDC1同源片段)為引物擴增Trswo1基因;利用BsiWⅠ線性化表達載體pPTPDC1,使用無縫克隆方法將線性化載體與Trswo1基因連接,通過熱激法將連接產物轉化E.coliDH5α感受態細胞,成功構建的過表達Trswo1基因表達載體命名pPTPDC1-swo1;pPTPDC1-swo1利用PCR驗證成功后DNA測序驗證保證基因無突變。表1為本研究使用到的引物。

表1 載體構建和實時熒光定量PCR所需引物Table 1 Primers used for vector construction and quantitative real-time PCR

通過A.tumefaciens介導遺傳轉化的方法將質粒pPTPDC1-swo1中包含Trswo1表達盒的T-DNA整合到T.reeseiRut C30基因組,利用含有300 μg/mL潮霉素B抗性的PDA平板篩選轉化子,提取轉化子基因組PCR驗證后進行DNA測序保證基因無突變。

1.2.2 搖瓶發酵生產纖維素酶

T.reesei于固體生孢培養基28 ℃培養7 d收集孢子[11],將孢子接種到50 mL種子培養基,在28 ℃、150 r/min條件培養24 h后將菌絲體以10%(體積分數)接種到50 mL纖維素酶發酵培養基,在28 ℃、150 r/min條件下誘導纖維素酶合成。

1.2.3 堿預處理玉米秸稈的水解

質量分數為5%的APCS在pH 4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.2 mol/L)中進行酶解,加酶量為10 FPU/g APCS,由于T.reesei所產纖維素酶缺乏β-葡萄糖苷酶,進而導致水解過程中纖維二糖積累從而抑制外切和內切纖維素酶活性導致纖維素酶水解效率降低[12],因此本研究額外添加326 U/g APCS的β-葡萄糖苷酶;反應在30 mL樣品瓶中進行,裝液量為7.5 mL,反應溫度50 ℃,轉速150 r/min。

1.3 分析方法

纖維素酶活性測定:按國際理論和應用化學協會推薦的國際標準法測定[13]。向比色管中加入 0.5 mL 經稀釋后的酶液、1.0 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.2 mol/L,pH 4.8)和1 cm×6 cm的約50 mg的Whatman NO.1濾紙,于50 ℃水浴鍋中反應60 min,反應結束后立即加入DNS試劑反應液終止酶反應,測定生成還原糖的量。酶活性單位的定義:在最適反應條件下,每分鐘水解Whatman No.1濾紙產生1 μmol還原糖所需的酶量為1個酶活力單位。

外切纖維素酶活性測定:以1 g/L對硝基苯纖維二糖苷(4-nitrophenyl β-D-cellobioside,pNPC)為底物測定[14]。向1.5 mL離心管中加入100 μL經適當稀釋的酶液以及50 μLpNPC溶液,于50 ℃水浴鍋中反應30 min后,立即加入150 μL 10%(質量分數)Na2CO3終止反應,測定415 nm處的吸光值。酶活性單位的定義:在酶最適反應條件下,每分鐘水解pNPC產生1 μmol對硝基苯酚(p-nitrophenol,pNP)所需的酶量定義為1個酶活力單位。

內切纖維素酶活性測定:以2%(質量分數)羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose,CMC)為底物測定[13]。向試管中加入0.5 mL經適當稀釋的酶液及0.5 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液(0.2 mol/L,pH 4.8),于50 ℃水浴鍋中反應30 min,反應結束后立即加入DNS試劑,測定反應液中生成的還原糖含量。酶活性單位的定義:在酶最適反應條件下,每分鐘水解CMC產生1 μmol還原糖所需的酶量定義為1個酶活力單位。

葡萄糖濃度測定:使用希爾曼S-10生物傳感器分析儀測定葡萄糖的濃度。

菌株平板生長分析:將T.reesei孢子接種于去除蛋白胨的纖維素酶發酵固體培養基平板(直徑35 mm),在28 ℃條件下培養觀察T.reesei菌絲生長直徑。

實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)分析:T.reesei孢子接種于50 mL種子培養基于28 ℃培養24 h,菌絲體以10%(體積分數)的比例接種到50 mL纖維素酶發酵培養基,28 ℃培養36 h后收集菌絲,提取RNA并逆轉錄為cDNA。按照2×TSINGKE?Master qPCR Mix的說明書進行qPCR測定基因相對表達量,所有基因的qPCR引物如表1所示。采用2-ΔCt法計算基因相對表達量,sar1基因作為管家基因。

XRD分析:酶解后的固體殘留物過濾后用蒸餾水洗滌3次并干燥后研磨,使用X射線衍射儀在40 kV 和30 mA的Cu輻照條件下分析樣品,掃描范圍為2θ=8°～80°。用峰高法計算了樣品的結晶度指數(crystallinity index,CrI)[15],CrI的計算如公式(1)所示:

(1)

式中:I002為002衍射面的結晶度;IAM為非結晶區的衍射強度,2θ=18°。

SEM分析:通過掃描電鏡觀察酶解72 h后APCS表面的微觀變化。樣品用雙面膠黏附于金屬圓盤上,表面噴鍍鉑金后在5 kV下觀察。

2 結果與分析

2.1 表達載體構建及里氏木霉轉化子鑒定

本研究想提高MGD誘導T.reesei合成纖維素酶系的水解效率,而MGD中除誘導物槐糖外,還有大量葡萄糖存在,因此本研究選用葡萄糖為碳源條件下PDC1啟動內源Trswo1基因表達,有效避免使用cbh1或者xyn3啟動子導致本底纖維素酶基因轉錄水平降低問題[16]。

實驗室前期已構建了包含PDC1啟動子和終止子的T.reesei基因表達載體pPTPDC1,啟動子和終止子之間含有BsiWⅠ限制性內切酶位點,該載體已經成功在T.reeseiRut C30中表達了外源aabgl1基因,使得T.reesei的β-葡萄糖苷酶活性提高了70多倍[5]。所以本研究利用BsiWⅠ線性化pPTPDC1后,通過無縫克隆技術將Trswo1基因連接到PDC1啟動子和終止子之間,成功構建過表達Trswo1基因的載體并命名為pPTPDC1-swo1(圖1-a)。利用A.tumefaciens介導的T.reesei遺傳轉化將Trswo1基因表達盒整合到T.reeseiRut C30基因組,挑取2個潛在的轉化子,并提取轉化子基因組后以Bsiw1yz-F/R為引物通過PCR證明轉化成功(圖1-b),進而通過DNA測序驗證了Trswo1基因表達盒沒有發生堿基突變(圖1-c),將2株陽性轉化子分別命名為T.reeseiOEswo1-1和OEswo1-2。

a-表達載體pPTPDC1-swo1;b-PCR驗證Trswo1基因表達盒(M-marker);c-DNA測序驗證Trswo1基因表達盒圖1 表達載體的構建及Trswo1基因的驗證Fig.1 Construction of the expression vector and verification of the Trswo1 gene

2.2 過表達Trswo1基因對T.reesei Rut C30生長和纖維素酶合成的影響

T.reeseiRut C30和2株陽性轉化子(T.reeseiOEswo1-1和OEswo1-2)以10 g/L MGD為誘導物在纖維素酶發酵培養基中培養36 h后取樣提取RNA并反轉為cDNA,通過qPCR檢測T.reeseiOEswo1-1和OEswo1-2的Trswo1基因相對表達量分別是野生型菌株的4.65倍和3.91倍(P<0.001)。表明Trswo1基因在2株陽性轉化子中均實現了過表達。

進一步對野生型和兩株陽性轉化子發酵生產纖維素酶,對纖維素酶活性、外切纖維素酶活性和內切纖維素酶活性進行測定,發現過量生產SWO1后并不會提高以上3種糖苷水解酶活性(P>0.05)(圖2-b～圖2-d)。這與SWO1蛋白無糖苷水解酶活性的研究結果相一致[17]。

a-Trswo1相對表達量;b-纖維素酶活性;c-外切纖維素酶活性;d-內切纖維素酶活性;e-T.reesei Rut C30和轉化子的形態圖2 T.reesei Rut C30與轉化子Trswo1基因轉錄分析和酶活性分析Fig.2 Transcription analysis of Trswo1 and activities of cellulase, exoglucanase, and endoglucanase from T.reesei Rut C30 and transformants with MGD as inducer注:*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,ns表示P>0.05(下同)

將等量的T.reeseiRut C30和2株陽性轉化子的孢子接種到固體纖維素酶發酵培養基平板,在28 ℃下培養4 d。如圖2-e所示,T.reeseiOEswo1-1在24 h孢子產生量小于另外2株菌的孢子產生量,而在其他時間點孢子產生量均無顯著性差異,同時3個菌株菌絲的直徑在任何時間點都沒有顯著性差異;上述結果表明,在T.reeseiRut C30中過表達Trswo1基因不影響菌株的生長。

2.3 堿預處理玉米秸稈的水解

雖然用MGD作為誘導物可以獲得較高的纖維素酶活性,但普遍認為T.reesei的β-葡萄糖苷酶不足導致水解過程中纖維二糖積累抑制外切和內切纖維素酶活性,從而降低木質纖維素的水解效率,所以普遍額外添加β-葡萄糖苷酶保證纖維素酶的水解效率[4]。基于此本研究在水解體系中額外添加326 U/g APCS商業β-葡萄糖苷酶。

利用T.reeseiRut C30、OEswo1-1和OEswo1-2生產的纖維素酶(Cellulase-C30、Cellulase-OEswo1和Cellulase-OEswo2)分別被用于水解APCS,結果如圖3所示,1 h后釋放葡萄糖分別為4.58、4.86、5.72 g/L;水解12 h后Cellulase-OEswo1和Cellulase-OEswo2水解APCS后釋放的葡萄糖相比于Cellulase-C30釋放的葡萄糖分別提高了6.98%和13.93%(P<0.001)。這表明在MGD作為誘導物情況下,過量生產SWO1會顯著性提高纖維素酶水解效率,而72 h的水解結果顯示各種纖維素酶催化效率無顯著性差異(P>0.05)。這是由于酶具有飽和動力學現象,因此含有更多SWO1的纖維素酶更適合同步糖化發酵水解木質纖維素。

圖3 T.reesei Rut C30和OEswo1轉化子酶解APCS的葡萄糖產量Fig.3 Glucose yield in the hydrolysis of APCS by enzyme from T.reesei Rut C30 and transformants

此外Trswo1基因表達水平與纖維素水解效率不成正比,雖然纖維素酶Cellulase-OEswo1相比于Cellulase-OEswo2含有更多的SWO1(P<0.05),但是Cellulase-OEswo1水解APCS的葡萄糖產量卻低于Cellulase-OEswo2水解APCS的葡萄糖產量。表明SWO1必不可少,但是足量后繼續提高其含量無法持續提高纖維素酶水解效率。這與已有研究保持一致,即SWO1和纖維素酶競爭纖維素中有限的結合位點,過量的SWO1反而會抑制纖維素酶的活性[8]。

2.4 酶解后固體殘渣結構特征分析

為探究SWO1提高纖維素酶水解APCS效率的分子機制,利用SEM分析預處理前后玉米秸稈的結構特征,結果如圖4所示,未經水解的APCS整個纖維表面光滑均勻且纖維沒有分散,而經過纖維素酶Cellulase-C30水解會導致纖維分散,形成粗糙且無定形的表面;而經過纖維素酶Cellulase-OEswo1和Cellulase-OEswo2水解的APCS表面結構破壞更嚴重,并且由圖4-c和圖4-d可以看出纖維素酶Cellulase-OEswo1相比于Cellulase-OEswo2對纖維結構破壞的能力更強,這是由于Cellulase-OEswo1含有更多的SWO1。

a-APCS;b-Cellulase-C30處理的APCS;c-Cellulase-OEswo1處理APCS;d-Cellulase-OEswo2處理的APCS圖4 酶解后固體殘渣的掃描電鏡圖(2 000×)Fig.4 Scanning electron microscopy photo of hydrolysed APCS (2 000×)

玉米秸稈中的纖維素由結晶和非結晶2種結構組成,結晶結構是由葡聚糖鏈之間的大量氫鍵形成的,這種結晶結構會減緩纖維素酶的水解速率[18-19]。纖維素的結晶度通常由XRD測量的CrI來表示[20]。因此本文通過XRD測量分析了酶解前后APCS的CrI。結果如圖5所示,所有樣品均觀察到2θ=16°和2θ=22°附近存在衍射峰,衍射峰的位置無明顯變化,但衍射強度差異較大。樣品的CrI值如表2所示,經過纖維素酶Cellulase-C30水解后的APCS與未經過水解相比,CrI降低(從74.34%降至60.95%);同時β-葡萄糖苷酶也可以將APCS的CrI由74.34%降至70.88%。而含有更多SWO1的纖維素酶Cellulase-OEswo1和Cellulase-OEswo2水解APCS后的殘渣在2θ=22.5°處的CrI明顯降低,與用纖維素酶Cellulase-C30處理后APCS的CrI相比(60.95%),經過纖維素酶Cellulase-OEswo1和Cellulase-OEswo2水解后APCS的CrI更低(53.27%和57.94%)。以上結果表明SWO1協同提高纖維素酶水解效率主要是由于破壞纖維素的結晶度。此外,纖維素酶Cellulase-OEswo1相比于Cellulase-OEswo2含有更多SWO1,可以更大程度上破壞纖維素的結晶度,這與SEM分析結果一致。

圖5 酶解的固體殘渣XRD譜圖Fig.5 XRD spectra of the solid residues from enzymatic hydrolysis

表2 酶解的固體殘渣的結晶度指數Table 2 Crystallization index of the solid from residues enzymatic hydrolysis

3 結論

本研究在TrichodermareeseiRut C30中過表達同源SWO1基因得到2株陽性轉化子,Trswo1基因表達量分別提高了4.65倍和3.91倍。使用葡萄糖-槐糖混合物作為誘導物,發現過量生產SWO1對纖維素酶活性和菌株生長無顯著性影響,但是可以提高對堿預處理玉米秸稈的水解效率。進一步分析過量生產的SWO1可破壞纖維素表面結構同時降低結晶度來協同纖維素酶提高玉米秸稈水解效率。該研究對T.reesei利用可溶性誘導物合成纖維素酶系中纖維素降解輔助蛋白含量低的問題具有一定意義。