姜黃素對Prdx6基因介導的肝癌細胞增殖、轉移、侵襲的調控作用*

孫樹剛 劉英琪 施 喆 周麗媛 楊 勇 王曉輝

1.河北工程大學附屬醫院普外科 (河北 邯鄲, 056000) 2.河北工程大學附屬醫院婦科

肝癌是全球常見的嚴重威脅人類生命健康的惡性腫瘤,其發病率呈逐年上升趨勢。姜黃素是一種從姜科植物的根莖中提取的天然酚類色素,具有廣泛的抗腫瘤作用[1-3]。研究表明,姜黃素可抑制肝癌細胞遷移和侵襲[4]。過氧化物氧化還原蛋白 6(Prdx6)是Prdx家族的一員,同時具有磷脂酶A2和過氧化物酶雙重活性,有研究報道Prdx6在肝癌患者癌組織中高表達,且表達水平與患者不良預后顯著相關[5]。另有研究發現,Prdx6過表達能夠促進肝癌細胞增殖活性、增強其遷移和侵襲能力[6]。上皮間質轉化(EMT)是指上皮細胞在特定情況下向間質細胞分化的現象,在惡性腫瘤細胞的遷移和侵襲中起重要作用。上皮細胞標志物E-cad的喪失以及間質細胞標志物N-cad和Vimentin的升高是肝癌細胞發生遠處侵襲和轉移的象征[7]。本研究以肝癌HepG2細胞為對象,探討姜黃素是否可通過調節Prdx6表達抑制肝癌細胞的惡性生物行為學。

1 材料和方法

1.1 細胞系 人肝癌細胞株HepG2購自美國ATCC公司。

1.2 試劑和儀器 姜黃素和MTT試劑盒購自美國Sigma公司;胎牛血清和培養基購自美國Gibco公司;Matrigel基質膠購自美國BD公司;Lipofectamine 2000試劑盒購自美國Invitrogen公司;Prdx6過表達質粒和空白對照質粒購自上海生工生物工程有限公司;兔抗人神經鈣黏蛋白(N-cad)、上皮鈣黏蛋白(E-cad)以及波形蛋白(Vimentin)抗體購自美國Abcam公司;倒置顯微鏡購自日本Olympus公司;酶標儀購自美國MDC公司。

1.3 細胞培養 HepG2細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中,置于37℃、5% CO2以及飽和濕度的恒溫培養箱中,每2 d更換新的培養基,顯微鏡下觀察,待細胞密度達80%以上時進行傳代,取第4代對數生長期的細胞進行實驗。

1.4 MTT法檢測細胞存活率 將細胞制成單細胞懸液,以每孔2×103個細胞的密度接種于96孔板內,待細胞貼壁生長后,參照文獻[8]方法,分別用0、10、20、40和60 μmol/L姜黃素處理細胞,每組設置3個復孔。培養箱中繼續培養24 h后,每孔加入20 μl MTT溶液,重新置于培養箱中培養4 h,每孔加入DMSO振蕩混勻直至紫色結晶完全溶解。置于酶標儀上測定490 nm波長處的吸光度(A)值,計算細胞活力和半數抑制濃度(IC50)。根據IC50確定后續實驗中采用40 μmol/L姜黃素處理細胞。

1.5 細胞轉染與分組 取第4代對數生長期HepG2細胞,以每孔2×103個細胞的密度接種于96孔板內,待細胞貼壁生長后,將細胞隨機分為對照組、姜黃素組、空載體組、Prdx6過表達組以及Prdx6過表達+姜黃素組,每組設置3個復孔。根據Lipofectamine 2000說明書將過表達PIRES-EGFP-Prdx6載體轉染Prdx6過表達組和Prdx6過表達+姜黃素組細胞,24 h后,Prdx6過表達+姜黃素組細胞和姜黃素組細胞加入40 μmol/L姜黃素處理24 h;空載體組細胞轉染PIRES空載體24 h;對照組細胞不做處理。24 h后,按照1.4的實驗方法計算細胞存活率。

1.6 qRT-PCR法檢測Prdx6 mRNA相對表達量 24 h后,棄掉培養液,預冷PBS清洗細胞3次,每孔加入1 ml Trizol試劑提取總RNA,測定RNA濃度并將RNA逆轉錄成cDNA,以cDNA為模板,GAPDH為內參,PCR儀進行擴增,條件設置為：95℃預變性5 min,95℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,共進行35個循環,以2-ΔΔCT法計算Prdx6 mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將HepG2細胞按2×103/ml密度接種于24孔板,細胞融合度達80%以上時,100 μl無菌槍頭垂直培養板底部均勻劃線,預冷PBS清洗3次,置于培養箱中培養24 h,顯微鏡下觀測劃痕寬度。細胞劃痕愈合率(%)=(0 h細胞劃痕寬度-24 h細胞劃痕寬度)/0 h細胞劃痕寬度×100%。

1.8 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 基質膠用無血清培養基稀釋(1∶3),將50 μl稀釋后的基質膠加入到上室中,將HepG2細胞按2×103/ml密度接種于上室,每孔150 μl。Transwell下室中加含10%胎牛血清的培養基600 μl,將小室置于培養箱中培養24 h,取出小室,濕棉簽將未侵襲細胞擦去,多聚甲醛固定小室20 min,并用結晶紫染色15 min,顯微鏡下觀察并計數穿膜細胞數,隨機取3～5個視野拍照。

1.9 蛋白印跡法檢測細胞中各蛋白相對表達量 收集對數期細胞,裂解液裂解,離心取上清液,BCA試劑盒測定蛋白濃度,調整蛋白濃度,煮沸。120 v恒壓電泳,直至溴酚藍到達凝膠底部,0.3 A恒流濕轉2 h,TBST洗膜,室溫封閉,E-cad、N-cad和Vimentin抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜,二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h,TBST洗膜,ECL顯色液顯影,Image J分析條帶灰度值,目的蛋白條帶灰度值/GAPDH灰度值為目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 不同濃度姜黃素對HepG2細胞存活率的影響 不同濃度(0、10、20、40、60 μmol/L)姜黃素處理24 h后,HepG2細胞存活率(%)分別為100.00、82.05±3.55、63.76±4.13、46.70±3.50、33.98±3.28,差異有統計學意義(P<0.05)。與0 μmol/L姜黃素組比較,各濃度姜黃素組細胞存活率降低,且具有濃度依賴性(P<0.05)。經計算,姜黃素對HepG2細胞的IC50為36.87 μmol/L,故后續實驗中采用40 μmol/L姜黃素處理細胞。

2.2 姜黃素對HepG2細胞Prdx6 mRNA表達的影響 Prdx6 mRNA相對表達量組間比較,差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組(6.38±1.04)比較,姜黃素組Prdx6 mRNA(1.29±0.08)相對表達量降低(P<0.05);與姜黃素組比較,Prdx6過表達+姜黃素組Prdx6 mRNA(3.87±1.12)相對表達量升高(P<0.05);與空載體組(6.42±1.03)比較,Prdx6過表達組Prdx6 mRNA(8.97±1.10相對表達量升高(P<0.05);與Prdx6過表達組比較,Prdx6過表達+姜黃素組Prdx6 mRNA相對表達量降低(P<0.05)。

2.3 姜黃素和Prdx6表達對HepG2細胞存活率的影響 細胞存活率組間比較,差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組(100.00%)比較,姜黃素組細胞存活率(63.65±4.05)降低(P<0.05);與姜黃素組比較,Prdx6過表達+姜黃素組細胞存活率(81.86±4.01)升高(P<0.05);與Prdx6過表達組(98.79±5.36)比較,Prdx6過表達+姜黃素組細胞存活率降低(P<0.05)。對照組、空載體組(98.21±5.22)以及Prdx6過表達組細胞存活率比較,差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 姜黃素和Prdx6表達對HepG2細胞遷移能力的影響 細胞劃痕愈合率組間比較,差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組(77.82±4.25)比較,姜黃素組細胞劃痕愈合率(47.98±3.46)降低(P<0.05);與姜黃素組比較,Prdx6過表達+姜黃素組細胞劃痕愈合率(65.36±4.37)升高(P<0.05);與空載體組(78.55±4.13)比較,Prdx6過表達組細胞劃痕愈合率(91.22±5.62)升高(P<0.05);與Prdx6過表達組比較,Prdx6過表達+姜黃素組細胞劃痕愈合率降低(P<0.05)。對照組和空載體組細胞劃痕愈合率比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 細胞劃痕實驗

2.5 姜黃素和Prdx6表達對HepG2細胞侵襲能力的影響 侵襲細胞數組間比較,差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組(125.58±6.37)比較,姜黃素組侵襲細胞數(57.22±4.28)減少(P<0.05);與姜黃素組比較,Prdx6過表達+姜黃素組侵襲細胞數(94.37±5.72)增多(P<0.05);與空載體組(127.33±6.56)比較,Prdx6過表達組侵襲細胞數增多(P<0.05);與Prdx6過表達組(197.67±6.58)比較,Prdx6過表達+姜黃素組侵襲細胞數減少(P<0.05)。對照組和空載體組侵襲細胞數比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 結晶紫染色圖

2.6 姜黃素和Prdx6表達對HepG2細胞EMT相關蛋白表達的影響 E-cad、N-cad和Vimentin蛋白相對表達量組間比較,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組細胞中E-cad、N-cad和Vimentin蛋白相對表達量比較

圖3 細胞中各蛋白表達電泳圖 (A為對照組,B為姜黃素組,C為空載體組,D為Prdx6過表達組,E為Prdx6過表達+姜黃素組)

3 討論

肝癌發病機制復雜,具有起病隱匿、進展速度快以及易轉移等特點,臨床上治療肝癌的抗癌藥物常引起多種不良反應,且長期使用會出現耐藥性,因此尋找一種毒副作用小且有效的藥物,用于治療肝癌和提高患者生活質量至關重要[9]。

姜黃素是從姜黃中提取得到的一種植物多酚,具有多種藥理學活性,Liang等[10]研究發現,姜黃素通過促進HepG2細胞焦亡和凋亡,誘導HepG2細胞發生死亡,從而在肝癌中發揮抗癌作用。Han等[11]研究發現,姜黃素通過下調DJ-1表達從而抑制肝癌細胞增殖。本研究采用不同濃度姜黃素處理HepG2細胞,結果發現HepG2細胞的存活率隨姜黃素濃度的升高而降低,且具有濃度依賴性。結果表明：姜黃素可抑制肝癌細胞增殖。Prdx6是一種廣泛存在于各組織器官中的過氧化酶,由224個氨基酸組成,近年來,Prdx6在癌癥中的作用受到廣泛關注,研究發現,在宮頸癌組織中Prdx6高表達,過表達Prdx6可促進宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲,抑制細胞凋亡[12]。研究表明,敲除Prdx6的HepG2細胞分裂減緩、線粒體功能發生障礙,細胞周期阻滯在G2/M期,因此在肝癌中發揮抗癌作用[13]。He等[14]研究發現,食管鱗癌組織中Prdx6表達顯著高于正常組織,過表達Prdx6可促進食管鱗癌細胞增殖、遷移和侵襲。Huang等[15]研究發現Prdx6在結腸癌中呈陽性表達,沉默HCT-116細胞中Prdx6表達則顯著抑制結腸癌細胞遷移和侵襲?；谝陨涎芯?我們猜測姜黃素可能通過抑制Prdx6表達從而在肝癌中發揮抗癌作用。本研究結果顯示：HepG2細胞中Prdx6過表達后細胞存活率和劃痕愈合率升高,侵襲細胞數增多,給予姜黃素處理后細胞存活率和劃痕愈合率降低,侵襲細胞數減少。結果表明姜黃素可拮抗Prdx6的促癌作用。

腫瘤細胞發生遷移和侵襲與上皮間質轉化過程密切相關,上皮間質轉化是一種具有極性的上皮細胞在某些病理情況下與微環境相互作用向間質細胞轉化的現象[16]。E-cad是廣泛分布在上皮組織上的一種跨膜糖蛋白,在維持上皮細胞形態和極性,以及上皮細胞結構完整性方面發揮不可或缺的作用,E-cad的表達與腫瘤分化程度和發展轉移密切相關,表達降低或缺失導致癌細胞的黏附能力下降,上皮性癌細胞則順利實現浸潤和轉移,在腫瘤的發生發展中起抑制作用,是發生上皮間質轉化的關鍵蛋白[17]。Vimentin是一種重要的骨架蛋白,在維持細胞完整性方面具有重要作用,主要表達與間充質,正常上皮組織中不表達或低表達,是間質細胞的標志性蛋白之一。N-cad也是間質細胞的標志性蛋白,表達上調可促進腫瘤細胞的運動和遷移[18]。Cao等[19]研究發現姜黃素逆轉IL-6/STAT3介導的上皮間質轉化抑制TCE誘導的肝癌發展。本研究結果顯示HepG2細胞中Prdx6過表達后N-cad和Vimentin蛋白表達升高,而E-cad蛋白表達降低,給予姜黃素處理后N-cad和Vimentin蛋白表達降低,而E-cad蛋白表達升高。結果表明：姜黃素可抑制Prdx6誘導的上皮間質轉化過程。

綜上所述,姜黃素可抑制HepG2細胞增殖、遷移和侵襲,其可能是通過降低Prdx6表達發揮調控作用,為臨床治療肝癌提供新的思路。