miR-223對高糖環境培養的視網膜微血管內皮細胞NLRP3/IL-1β通路的調控作用①

董雪松,劉 丹,宿星杰,張 劍,齊艷秀

(佳木斯大學附屬第一醫院眼科,黑龍江 佳木斯 154003)

糖尿病視網膜病變(DR)是一種由糖尿病引發的視網膜微血管損害性病變,是嚴重影響視力,甚至致盲的慢性進行性疾病,是導致50歲以上人群致盲眼病的因素之一。多數學者認為其發病與糖代謝、血液、生長激素、神經退行性變、免疫和慢性炎癥等多種因素相關[1]。根據微血管變性和缺血損害程度,糖尿病視網膜病變(DR)可分為增殖性DR(PDR)和非增殖性DR(NPDR)。增殖性DR(PDR)的主要病理特征表現為血管生成和玻璃體視網膜表面纖維化,其機制是巨噬細胞導致的炎癥和血管損傷[2]。炎性小體是固有免疫的重要效應分子,由細胞內模式識別受體(PRRS)、銜接蛋白和Caspase酶組成,它們可以促進IL-1β和IL-18促炎性因子釋放。目前研究較多的是核苷酸結合寡糖化結構域樣受體蛋白-3(NLRP3)炎性小體[3]。既往研究[4]顯示,NLRP3異常激活與痛風、動脈粥樣硬化、年齡相關性黃斑變性、阿爾茨海默病、肥胖等疾病密切相關。研究[5]顯示,早期糖尿病大鼠視網膜中發現高表達NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18,沉默NLRP3表達后視網膜血管通透性降低。微小RNA(microRNA,miRNA)是一種長度約20～23個核苷酸的小非編碼RNA,miRNA通過與編碼蛋白(mRNA)3’UTR上堿基互補配對,在轉錄后水平上調控基因的表達。既往研究[5]顯示,miR-223可通過調節人血管平滑肌細胞NLRP3炎性小體表達,調控動脈粥樣硬化的發生,但miR-223在糖尿病視網膜病變(DR)形成過程中是否可通過抑制NLRP3炎性小體發揮保護作用目前未見報道。本文通過將miR-223模擬物和抑制劑以及相對應的miR-NC轉入經高糖環境培養的人視網膜微血管內皮細胞(HRMECS),通過與模型組或對照組相比較,探討miR-223對HRMECS的NLRP3炎性小體、炎性因子表達的影響。本課題旨在研究miR-223通過NLRP3炎性小體對糖尿病視網膜病變(DR)的保護作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Invitrogen、胎牛血清、M199組織培養基、鏈霉素/青霉素、Trizol試劑購自碧云天;人視網膜微血管內皮細胞(HRMECS)購自北京北納創聯生物技術研究院。miR-223陰性對照(miR-NC)、mimcs-miR-223、inhibitor-miR-223由大連寶生物工程公司測序合成。IL-1β、IL-18酶聯免疫反應法(ELISA)試劑盒購自伊萊瑞特生物科技股份有限公司(武漢)。NLRP3、ASC、Caspase-1一抗購自賽默飛世爾。

1.2 方法

1.2.1細胞培養

人視網膜微血管內皮細胞(HRMECS)培養于含20%胎牛血清、3ng/mLbFGF、10U/mL肝素和1%鏈霉素/青霉素的M199培養基,培養條件為37℃、5%CO2,取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2實驗分組

采用0.25%胰蛋白酶對HRMECS細胞進行消化,計數后接種于6孔板(1×105個/孔)。分組:正常基培養的對照組、高糖環境培養的模型組、高糖環境下轉染miR-NC、mimics-miR-223和inhibitor-miR-223的miR-223陰性組、miR-223組以及miR-223抑制組。

1.2.3細胞轉染

采用LipofectamineTM3000試劑依據說明書進行轉染,對照組和模型組轉染空白試劑,miR-223陰性組轉染miR-NC,miR-223組轉染mimics-miR-223,miR-223抑制組轉染inhbitor-miR-223,轉染完畢后對照組用正常培養進行培養,模型組、miR-223陰性組、miR-223組和miR-223抑制組用D-葡萄糖以30mmol/L的最終濃度添加到培養基中模擬高糖環境。培養48h后,收集各組細胞,進行后續實驗。

1.2.4實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測

miR-233的表達利用Trizol試劑提取各組總RNA,使用紫外分光光度計檢測總RNA的濃度。參照反轉錄試劑盒(生工,中國上海)說明書將RNA進行反轉錄,以反轉錄產物cDNA為模板,按照miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒說明書進行PCR擴增(生工,中國上海)。使用反轉錄試劑(碧云天,中國上海)合成NLRP3、ASC和Caspase-1的cDNA,使用熒光定量PCR檢測NLRP3、ASC和Caspase-1的mRNA水平。分別以U6和β-actin為內參。采用2-ΔΔCt的方法處理數據,見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5酶聯免疫吸附法

收集各組細胞上清液,置于-80℃冰箱保存,采用ELISA法檢測各組IL-1β、IL-18水平,檢測步驟嚴格遵循試劑盒說明書。

1.2.6Western blot

收集轉染后各組HRMECS細胞,提取蛋白樣品。取20μL總蛋白上樣于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-poly acrylamide gelel ectrophoresis,SDS-PAGE)上電泳分離蛋白,轉膜。室溫下,采用5%脫脂牛奶封閉1h。洗膜后,加入一抗在4℃下孵育過夜,洗膜,加入二抗在室溫下孵育1.5h。洗膜后,ECL顯影,采用圖像分析軟件Image J對Western blot實驗所得結果圖像進行灰度分析。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 miR-223的表達情況

熒光定量PCR檢測miR-223組中miR-223表達水平為(2.98±0.23)高于對照組(0.98±0.06)、模型組(0.48±0.06)、miR-223陰性組(1. 02±0.06)和miR-223抑制組(0.18±0.09)。miR-223抑制組中miR-223表達趨勢低于對照組、模型組、miR-223陰性組、miR-223組,差異均有統計學意義(P<0.05),見圖1。

圖1 miR-233在各組中的表達趨勢(*P<0.05)

2.2 IL-1β和IL-18濃度比較

miR-223組IL-1β、IL-18濃度(6.85±0.48,8.96±1.43pg/mL)均高于對照組(2.73±1.14,3.48±1.08pg/mL),低于模型組(18.67±3.67,22.03±4.15pg/mL)、miR-223陰性組(19.03±4.48,22.62±5.06pg/mL)和miR-223抑制組(34.08±8.23,40.69±7.43pg/mL),差異均有統計學意義(F=51.248,P<0.001)。

2.3 NLRP3、ASC、Caspase-1mRNA表達

模型組和miR-223陰性組NLRP3、ASC、Caspae-1表達水平均高于對照組,miR-223組NLRP3、ASC、Caspase-1表達水平均低于miR-223陰性組和模型組,差異均有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 各組NLRP3、ASC、Caspase-1表達

2.4 NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達

模型組和miR-223陰性組NLRP3、ASC、Caspae-1蛋白表達水平均高于對照組,miR-223組NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達水平均低于miR-223陰性組和模型組,差異均有統計學意義(P<0.05),見表3和圖2。

圖2 各組細胞NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白的表達

表3 各組NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達

3 討論

近年來隨著老齡化進程加速、生活水平提高和工作生活方式轉變,糖尿病發病率逐年升高,DR發病人數和致盲人數隨之上升。流行病學研究顯示,我國DR發生率約占總人群的1.3%和糖尿病人群的23.0%[6]。DR的發生發展是復雜的病理過程,涉及到細胞因子、糖基化終末期產物堆積、多元醇通路異常、炎癥、氧化應激、蛋白激酶C等多種機制,其中炎癥反應是DR發生發展的關鍵因素[7]。

固有免疫反應在驅動慢性炎癥及糖尿病相關并發癥中發揮重要作用,炎性小體家族是機體固有免疫反應的組成部分,在DR的發生發展中起促進作用[8]。NLRP3是一種胞漿模式識別受體分子,作為炎性小體家族一員,可與凋亡相關蛋白顆粒樣蛋白(ASC)和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1(Caspase-1)形成炎性復合物,活化的Caspase-1可剪切IL-1β和IL-18前體,促進活性IL-1β和IL-18生成,啟動炎性反應級聯反應,加速DR的發生發展過程[9]。研究[10]顯示,增生性糖尿病視網膜病變患者的玻璃體液中NLRP3表達明顯升高,并且在PDR患者纖維血管膜中檢測到高表達的NLRP3、Caspase-1和IL-1β。對糖尿病視網膜病變動物模型的研究[11]同樣顯示,NLRP3參與病理性新生血管生成。本研究結果顯示,模型組NLRP3、ASC、Caspase-1的mRNA和蛋白表達水平均較對照組顯著升高,細胞上清液IL-1β和IL-18水平高于對照組,結果提示,在高糖環境下,HRMECS細胞NLRP3/IL-1β信號通路激活,炎性因子表達增加,加快DR病變進程,與臨床和動物模型研究結果一致。

miR-223定位于X染色體Xq12上,高表達于血液系統尤其是骨髓系,如粒細胞、單核細胞,參與粒細胞的分化與成熟過程,參與免疫細胞分化。在動脈粥樣硬化基礎研究中顯示,miR-223可通過直接負性調控下游NLRP3炎性靶基因延緩粥樣硬化的發展[12]。Bauernfeind等人[13]研究顯示,NLRP3在限制條件下表達,需要額外的啟動信號常使其表達,miR-223通過NLRP3的3’非翻譯區內的保守結合位點抑制NLRP3表達,減少NLRP3炎癥反應活性。對miR-223缺陷小鼠的研究中則可觀察到NLRP3/IL-1β激活的特征[14]。Neudecker等人[15]對炎癥性腸病的研究中顯示,miR-223缺失動物NLRP3/IL-1β通路表達增加,炎性細胞因子水平顯著升高,阻斷NLRP3可降低動物模型炎性腸病的嚴重程度。雖然在炎癥性腸病、動脈粥樣硬化等基礎研究中觀察到miR-223對NLRP3炎癥通路激活的影響,但在DR中較少見相關報道。本研究對高糖環境培養的視網膜微血管內皮細胞研究顯示,高糖誘導可降低miR-223表達,模型組在miR-223降低的同時,NLRP3、ASC、Caspase-1在mRNA和蛋白水平表達升高。此外模型組細胞培養液中IL-1β水平升高,結果提示高糖培養的HRMECS細胞存在miR-223降低和NLRP3/IL-1β通路激活。為觀察miR-223與NLRP3/IL-1β通路激活的相關性。本研究分別轉染mimcs -miR-223-和inhibitor -miR-223。結果顯示,轉染miR-22-3mimcs的高糖培養HRMECS細胞NLRP3、ASC、Caspase-1在mRNA和蛋白相對表達水平降低,細胞培養液中IL-1β和IL-18水平降低,從而抑制NLRP3/IL-1β通路激活,而轉染inhibitor-miR-223則可促進NLRP3/IL-1β通路激活。本研究結果提示,與動脈粥樣硬化、炎癥性腸病和腦膜炎等研究中類似,miR-223可調控高糖培養HRMECS細胞NLR3/IL-1β細胞通路,可能在DR的發生發展中發揮保護作用。

綜上所述,高糖處理HAMECS后,可引起miR-223降低,上調miR-223表達可通過抑制NLRP3/IL-1β通路激活減輕細胞的炎癥反應,本研究結果初步闡述了miR-223在DR發展中的作用,豐富了DR發病的分子機制,為DR治療提供了新的線索。