缺血性腦損傷對SD大鼠腸道菌群的影響①

盛 雪,張慧明,馬光宇,仲昭泓,陳玨曉

(1.佳木斯大學基礎醫學院,黑龍江 佳木斯 154007;2.黑龍江省微生態-免疫調節網絡與相關疾病重點實驗室,黑龍江 佳木斯 154003;3.暨南大學附屬第一醫院婦產科, 廣東 廣州 510630)

腸道菌群在機體代謝、免疫防御以及維持宿主細胞正常生命活動中發揮著重要作用。作為機體的基因庫和第二大腦,腸道菌群是哺乳動物系統中規模最為龐大、成分最為復雜的微生物系統[1]。機體腸道中孕育著最復雜的微生物群落,它與宿主共生,并參與調節宿主的腸道穩態平衡,是一套復雜的共生體系。一般認為,腸道內含有有益菌和致病菌兩類菌群,二者相互制約、相互影響,共同維持腸道內環境穩定。研究證實,腸道菌群參與并影響機體消化、內分泌等重要的生命機制,腸道微生物與多個器官都有直接或間接的聯系,特別是與腎臟、腦的功能相聯系,腸道微生物群可以通過代謝、體循環以及神經傳導通路與炎癥、心血管和腦相互作用[2]。目前,對腸道中的微生物進行形態分析和功能劃分是研究領域的一大熱點。多項研究證實腸道菌群失調與缺血性腦損傷致病危險因素息息相關[3]。因此,我們有依據推測腸道菌群在缺血性腦損傷的發展中發揮著必然的作用。因此,本實驗通過分析實驗動物糞便標本中微生物形態、種類以及數量的變化,探索腸道菌群與缺血性腦損傷發病的潛在聯系與相互作用機制[4],為臨床診療缺血性腦損傷提供新手段。

1 材料和方法

1.1 材料

本實驗選用成年雄性SD大鼠,6～8周齡,體質量250～300g,清潔級,均采購于佳木斯大學動物實驗中心。飼養環境清潔、消毒、適宜溫度17～23℃與濕度35%～70%、光照充足。標準組大鼠自由飲水與進食,實驗組大鼠術前禁食禁水12h,術后逐漸恢復飲水與進食。

1.2 實驗方法

1.2.1動物模型制備

將90只成年雄性SD大鼠隨機分配,每組45只分為兩組,即模型組與標準組。標準組又以每組15只隨機分為3組,標記為1～3組;模型組的45只大鼠術后進行分組,依據術后腦損傷程度的評估與分級,將造模成功的大鼠以每組15只分為3組,標記為4～6組,其中4～6組損傷程度逐漸增加。

向隨機分配的45只模型組SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛,觀察大鼠的肌張力變化,待大鼠麻醉充分后,將大鼠平臥位固定在無菌手術操作臺上。術前進行常規滅菌消毒,將固定好的SD大鼠沿頸前正中線做大約長為3～5cm的縱行切口,使血管與神經充分暴露。后用玻璃分針小心剝離出大鼠的雙側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈,切勿傷及迷走神經,然后分別將左右頸總動脈永久性結扎。手術后局部皮膚用碘伏涂抹,每日每只大鼠注射青霉素抗感染,連續3d[4]。術后觀察大鼠行為狀態與表現,待大鼠清醒后對大鼠神經受損程度行為評分,并按照損傷等級程度分為4～6組。

1.2.2糞便采集

待大鼠飼養3d后,按照3、5、7d時間點采集糞便。采用醫用無菌糞便盒取樣,用滅菌的鑷子夾取大鼠的糞便,使用后,用酒精棉球反復擦拭鑷子進行消毒滅菌。將采集好的大鼠糞便放入準備好的無菌EP管。每只大鼠糞便標本量應控制為在5g左右,且不少于1g。將采集好的糞便樣本立刻放入-80℃冰箱進行封存。

1.2.3糞便細菌DNA提取與檢測

選用傳統的16SrDNA基因檢測技術對糞便樣本中微生物進行檢測。16SrRNA基因是細菌編碼核糖體RNA相對應的DNA序列,它包含9個高變區(hypervariable regions)和10個保守區(conserved regions)[5]。高變區反映種間差異關系,保守區反映種間親緣關系,存在于原核生物的基因組中。16SrRNA具有高度的特異性、保守性和穩定性。突變發生率低,是適用于微生物系統發育和鑒定的指標。16SrRNA的編碼序列為16SrDNA[5],但是在實驗中RNA的提取相對較難,而DNA提取相對容易些,所以本實驗對16SrDNA進行測序分析。

16S測序的基本原理是PCR擴增。選擇一段通用引物對環境中樣本微生物進行擴增,然后進行高通量測序,并于已有數據庫進行對比分析,從而對環境中樣本微生物群落多樣性進行研究。16SrDNA基因檢測技術現已成為微生物檢測和鑒定的一種強有力工具。

2 結果

2.1 稀釋性曲線-Rarefactioncurve

稀釋性曲線以個體數和物種數來構建。稀釋性曲線可以用來比較不同樣本豐富度的差異,也可代表樣本量的合理性與數據的可信性。本實驗構建稀釋性曲線用于檢測樣本數據是否合理。當曲線趨于平坦時,說明實驗數據量合理。如圖1所示,樣本1～6曲線均趨于平坦,說明1～6組數據均合理,有統計學意義。

圖1 稀釋性曲線注:橫坐標:隨機抽取的序列條數;縱坐標:觀測到的OTU數量。

2.2 物種累積曲線Species_Accumulation

以樣品量為橫坐標,抽樣后OTU數量為縱坐標構建物種累積曲線圖,結果代表反映了連續隨機抽樣下新生OTU出現的速率。隨著樣品量的逐漸增加,當群落中有大量新生物種被發現時,曲線呈急劇上升趨勢;而當曲線趨于平穩時,則表明此樣本中新生物種不會隨樣本量增加而顯著增加。如圖2所示,1～3組曲線陡峭,4～6組曲線趨于平穩。說明在開始給予大鼠腦損傷時,大鼠腸道內微生物數量和多樣性發生急劇改變,而伴隨著腦損傷的進行,這種改變趨于穩定和平衡。

2.3 群落結構組成

如圖3所示,門水平上,大鼠各組腸道細菌菌門中,厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)是優勢菌群,含量比較少的菌門只在個別個體中出現。并且可以看出,隨著腦缺血損傷程度的改變,厚壁菌門呈遞減趨勢,在缺血組中厚壁菌門的比例下降,而擬桿菌門、變形菌門、放線菌門數量明顯增多;其中,3、4組樣本中變形菌門數量顯著增多,可以推測擬桿菌門、變形菌門、放線菌門的增多可能與大鼠腦損傷有關。

3 討論

缺血性腦損傷發生后,大多伴有腸道并發癥[6]。在腸道微生物群與腦缺血作用的實驗研究中發現,老年宿主轉移的微生物群可能導致局灶性腦缺血小鼠模型中功能性長期結果的惡化,然而涉及的過程確切機制尚不清楚。最近的一項研究表明,嚴重腦缺血后的微生物群特征發生了變化,并伴有中風后生態失調,誘導了促炎癥免疫反應,腦缺血后平衡微生物群的移植可改善卒中預后,但是未具體說明何種菌群變化。多項研究表明,腸道菌群的改善對干預與治療缺血性腦損傷意義重大。隨著生物與科學的進步,研究人員對腸道菌群與腦-腸軸關系得到更加深入的研究。未來,關于腦腸關系的科學研究將會有新的突破,腸道菌群與腦損傷的聯系作用機制得到進一步闡明,這將對腦損傷的診斷和治療提供新的方法和新的思路,為缺血性腦損傷的臨床治療帶來新的改變。

此實驗研究發現,缺血導致的腦損傷大鼠腸道菌群發生明顯紊亂,其腸道內優勢菌較正常大鼠數量減少,特別是乳桿菌屬(lactobacillus)、小球藻屬(prevotella)等含量降低明顯[7]。隨著腦缺血時間的延長,菌群結構發生更加明顯的改變,差異更加顯著。大鼠優勢菌門后壁菌門(firmicutes)降低明顯,而擬桿菌門(bacteroidetes)、變形菌門(proteobacteria)、放線菌門(actinobacteria)含量升高,特別是變形菌門[8],差異顯著。此外,在實驗大鼠中,某些新生菌群被發現,且伴隨著腦損傷程度的增加呈遞增趨勢,說明在腦損傷大鼠腸道中微生物多樣性發生急劇改變,推測這可能與腦損傷的發展過程有關。綜上所述,我們的實驗研究表明腦損傷大鼠紊亂的腸道菌群加重腦缺血傾向和腦損傷程度。缺血性腦損傷大鼠腸道內存在著不同程度的菌群失衡,失衡的菌群物種的豐富度和多樣性降低。通過菌群糞便移植并進行16SrDNA測序系統測序,證實了腸道菌群紊亂程度與腦缺血程度呈正相關,即腦實質損傷越嚴重,腸內菌群紊亂程度越高。需提出的是,我們的實驗尚未對腦損傷與腸道菌群之間的作用機制作出闡明,對腦缺血過程中腸道菌群的變化作用基礎的研究,仍需后續實驗的進一步研究。