豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測方法的建立

文│張晶（福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測中心）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是豬中最嚴(yán)重、傳播最迅速的傳染病之一。豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是豬繁殖與呼吸綜合征的直接病原體。

目前PCR是檢測PRRSV病毒標(biāo)準(zhǔn)而有效的診斷方法，具有較高的特異性和敏感性。但因其耗時較長，需要昂貴的設(shè)備、有經(jīng)驗的技術(shù)人員和專業(yè)實驗室等限制了其進(jìn)一步應(yīng)用，尤其是即時現(xiàn)場檢測應(yīng)用領(lǐng)域。因此，開發(fā)一種簡單、準(zhǔn)確、快速的檢測方法至關(guān)重要。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是2000年由Notomi等提出的一種核酸等溫擴(kuò)增方法，即針對特定靶標(biāo)的6～8個區(qū)段設(shè)計的4～6條不同的引物，在恒定溫度（60～65℃）下15～60分鐘內(nèi)實現(xiàn)109～1010倍的擴(kuò)增，結(jié)果可通過熒光變化、溶液渾濁情況（擴(kuò)增產(chǎn)生的副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀為依據(jù)觀察白色沉淀）、比色法等進(jìn)行判斷，具備高靈敏、高特異性、高效性、快速、簡便、易檢測等特點。LAMP技術(shù)是一種快速有效識別病原體感染的即時診斷技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于人類及動植物細(xì)菌、病毒、寄生蟲、真菌等病原體檢測，尤其在新型冠狀病毒SARS-CoV-2的檢測中發(fā)揮了重要作用。

本研究在RT-LAMP的基礎(chǔ)上建立了一種簡便、快速、靈敏的PRRSV檢測方法。筆者先是設(shè)計并篩選出高擴(kuò)增性能的PRRSVRT-LAMP引物對，同時通過體系優(yōu)化添加化學(xué)試劑，進(jìn)一步提高反應(yīng)速率，縮短反應(yīng)時間。最后對PRRSVRT-LAMP體系（包括熒光法、可視化檢測）性能進(jìn)行評價。

一、材料與方法

1.P R R S V R T-L A M P 引物對設(shè)計與合成。我們以P R R S V SRV07菌株的基因組（GenBank No.JX 512910.2）為標(biāo)準(zhǔn)序列，采用BLAST在線網(wǎng)站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行同源序列比對，而后用引物設(shè)計網(wǎng)站NEBRLAMP Primer Design Tool（https://lamp.neb.com）進(jìn)行LAMP引物對設(shè)計。同時合成帶有PRRSV M基因14460-14810片段（GenBank No. JX512910.2）的PUC57為載體的質(zhì)粒和RNA假病毒作為陽性參照。引物（表1）、質(zhì)粒和RNA假病毒均由上海生工生物股份有限公司生產(chǎn)。

表1 PRRSV RT-LAMP引物對序列

2.PRRSV RT-LAMP引物對篩選。PRRSV RT-LAMP引物對篩選采用RT-LAMP實時熒光法。我們通過文獻(xiàn)選取了額外4組公開報道的用于PRRSV臨床樣本檢測驗證的LAMP引物對（表1），并與本研究所設(shè)計的LAMP引物對進(jìn)行擴(kuò)增效率比較，用以確定最佳檢測效率的引物對。其中，25微升反應(yīng)體積的PRRSV RT-LAMP熒光法檢測體系成分包含1×Bst 4.2 Basic Mix（Cat. No.:A3831-01，HaiGene），0.32 U/微升HotStart Bst 4.2（Cat. No.: A3831-01，HaiGene），1×SYBRTMGreen I（Cat.No.: S7563，ThermoFisher），0.2微米 F3/B3，1.6微米FIP/BIP，0.4微米LF/LB（若有），1微升反應(yīng)模板（基因組、質(zhì)粒或RNA假病毒等），剩余用無核酸酶水補足25微升。在熒光PCR儀中65℃反應(yīng)1小時，每隔1分鐘收集一次熒光。注：HotStart Bst 4.2具有DNA/RNA通擴(kuò)能力，因此，PRRSV RT-LAMP體系不需要額外添加逆轉(zhuǎn)錄酶。

3.化學(xué)添加劑對PRRSV RTLAMP檢測體系性能的影響。甜菜堿（Betaine）不僅可以通過減小二級結(jié)構(gòu)的形成來提高DNA的擴(kuò)增，還可以通過消除DNA融化/變性時對堿基對的依賴提高擴(kuò)增特異性，常用于PCR擴(kuò)增。甘氨酸（Glycine）類似于L-脯氨酸，據(jù)文獻(xiàn)資料報道，其有助于提高LAMP反應(yīng)速率，縮短反應(yīng)時間。因此，我們采用了上述兩種化學(xué)添加劑研究其對PRRSV RT-LAMP檢測體系性能的影響。

4.PRRSV RT-LAMP檢測體系靈敏度和特異度考察。

（1）PRRSV RT-LAMP熒光法快速檢測體系。PRRSV RT-LAMP熒光法檢測體系中額外添加0.5M Glycine，其余反應(yīng)參數(shù)不變。

（2）PRRSV RT-LAMP熒光法快速檢測體系靈敏度。PRRSV RNA假病毒經(jīng)EASY Dilution（for Real Time PCR）（Cat. No.: 9160，Takara）進(jìn)行稀釋，用PRRSV RT-LAMP熒光法快速檢測體系進(jìn)行檢測，并以無核酸酶水作為陰性對照。根據(jù)有無熒光信號及其信號強(qiáng)弱判定體系最低檢測下限。

（3）PRRSV RT-LAMP熒光法快速檢測體系特異度。以豬圓環(huán)病毒Ⅱ型PCV-2）、非洲豬瘟（CSFV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）基因組作為研究對象，并以PRRSV RNA假病毒為陽性對照，研究PRRSV RTLAMP熒光法快速檢測體系特異度。

5.PRRSV RT-LAMP可視化檢測。除了熒光檢測，PRRSV RTLAMP檢測結(jié)果還可通過以下兩種方法用肉眼判讀結(jié)果。渾濁法：以擴(kuò)增產(chǎn)生的副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀為依據(jù)觀察白色沉淀；比色法：反應(yīng)體系中加入染料觀察擴(kuò)增結(jié)果是否產(chǎn)生相應(yīng)顏色來判定是否有目的產(chǎn)物擴(kuò)增。對比熒光法快速檢測體系，渾濁法體系不加入1×SYBRTMGreen I，反應(yīng)時間為35分鐘，其他條件不變；而比色法體系則是1×WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix（M1800，NEB），0.2微米F3/B3，1.6微米FIP/BIP，0.4微米LF/LB，1微升反應(yīng)模板，剩余用無核酸酶水補足25微升。65℃反應(yīng)1小時，每隔1分鐘收集一次熒光。

二、結(jié)果與討論

1.PRRSV RT-LAMP引物對篩選。采用相同濃度的PRRSV質(zhì)粒（105copies/微升）作為體系反應(yīng)模板，研究上述5組引物對的擴(kuò)增效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5組引物對陰性對照均沒有信號，而陽性質(zhì)粒在不同引物對體系中呈現(xiàn)不同的Ct值。Ct值越小，即陽性信號產(chǎn)生所需時間越短，體系反應(yīng)效率越高。其中，引物對1，即本研究所設(shè)計的引物對（1-F3/1-B3，1-FIP/1-BIP，1-LF/1-LB），陽性Ct值最小，反應(yīng)速度最快，擴(kuò)增效率最高。選擇該引物對做后續(xù)分析。

2.化學(xué)添加劑對PRRSV RTLAMP體系反應(yīng)速率影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甜菜堿降低了PRRSV RT-LAMP體系擴(kuò)增效率，與馬翠萍等的研究結(jié)果一致。而0.5 M甘氨酸用量顯著提高了檢測體系的反應(yīng)速率，使反應(yīng)時間縮短了一半（106拷貝數(shù)陽性質(zhì)粒：30分鐘→15分鐘以內(nèi)；103拷貝數(shù)陽性質(zhì)粒：60分鐘→30分鐘以內(nèi)）。而添加甜菜堿減弱了體系的擴(kuò)增效率可能是由于本研究采用的是商業(yè)化的LAMP試劑盒（HaiGene），體系buffer已達(dá)到較優(yōu)水平，甜菜堿具有弱化氫鍵的能力，反而不利于LAMP反應(yīng)的進(jìn)行。

3.PRRSV RT-LAMP快速檢測體系敏感性和特異性分析。利用快速體系（熒光法）檢測一系列濃度梯度（107→102拷貝數(shù)）的PRRSV RNA假病毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體系在35分鐘左右實現(xiàn)500拷貝數(shù)/反應(yīng)的最低檢測下限。同時，與PCV-2、CSFV、PEDV等豬藍(lán)耳病相似癥狀的病毒無交叉反應(yīng)，體系特異度良好。

4.PRRSV RT-LAMP體系可視化檢測。為了進(jìn)一步提高PRRSV RT-LAMP體系在各種場合的靈活應(yīng)用，尤其是資源有限的場所，擺脫對復(fù)雜、昂貴光學(xué)儀器的依賴，我們比較了兩種肉眼判讀結(jié)果的方法。采用渾濁法判讀結(jié)果，快速檢測體系在35分鐘左右實現(xiàn)500拷貝數(shù)/反應(yīng)的最低檢測下限。采用比色法判讀結(jié)果，加入甘氨酸的檢測體系均不變色（仍保持黃色），不加入甘氨酸的檢測體系最低檢測下限為103拷貝數(shù)/反應(yīng)，與PCV-2、CSFV、PEDV等豬藍(lán)耳病相似癥狀的病毒無交叉反應(yīng)，體系特異度良好。

三、結(jié)語