豬鏈球菌分離鑒定及耐藥性與毒力基因分析

文│趙鳳利［遼寧省臺(tái)安縣農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心（動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心）］

豬鏈球菌（Streptococcus suis，S. suis）作為一種重要的人畜共患病原微生物，可引起豬肺炎、敗血癥、腦膜炎及關(guān)節(jié)炎等疾病。我國(guó)分別在1998年和2005年暴發(fā)了人感染豬鏈球菌的疾病，使得全世界對(duì)該疾病格外關(guān)注。豬鏈球菌1型（SS1）、2型（SS2）、7型（SS7）和9型（SS9）是臨床分離率最高的四個(gè)血清型，也是其眾多血清型中毒力較強(qiáng)的。由于豬鏈球菌菌株的血清型繁雜，長(zhǎng)久以來疫苗的保護(hù)效果不理想，豬鏈球菌病也成為困擾我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的最重要的細(xì)菌性傳染病之一。

近年來，豬鏈球菌病在我國(guó)的流行呈明顯上升趨勢(shì)，特別是在豬群發(fā)生豬藍(lán)耳病、豬圓環(huán)病毒病或副豬嗜血桿菌病后極易繼發(fā)或并發(fā)豬鏈球菌感染，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)從遼寧省鞍山市某豬場(chǎng)疑似豬鏈球菌感染的死亡豬體內(nèi)采集不同臟器，從中分離培養(yǎng)細(xì)菌，并進(jìn)行染色、鏡檢、生化試驗(yàn)，采用16s rRNA鑒定法和血清型鑒定法對(duì)分離菌株進(jìn)行病原學(xué)鑒定，進(jìn)一步利用藥敏試驗(yàn)和毒力基因檢測(cè)對(duì)分離株的耐藥性和攜帶毒力基因的情況進(jìn)行分析，以期對(duì)豬鏈球菌病的防治提供數(shù)據(jù)參考。

一、材料和方法

1.樣品來源。所有樣品均采集自遼寧省鞍山市某豬場(chǎng)疑似感染豬鏈球菌的病死豬的淋巴結(jié)、脾、肝和肺。

2.主要試劑與儀器。血瓊脂平板購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，新生牛血清和Todd-Hewitt broth（THB）培養(yǎng)基均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，藥敏紙片購(gòu)于青島水生環(huán)境科技有限公司，革蘭氏染色試劑盒購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自湘儀離心機(jī)儀器設(shè)備有限公司；核酸電泳儀購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

3.引物的設(shè)計(jì)與合成。參照文獻(xiàn)合成豬鏈球菌的16S rRNA序列引物用于分離菌株的PCR鑒定試驗(yàn)，根據(jù)莢膜多糖基因序列cps1I、cps2J、cps7H和cps9H進(jìn)行設(shè)計(jì)鑒別豬鏈球菌1、2、7、9四種主要致病血清型的引物用于血清分型試驗(yàn)，參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)5對(duì)毒力基因溶血素（Sly）、谷氨酸脫氫酶（gdh）、溶菌酶釋放蛋白（m rp）、毒力相關(guān)因子（Orf2）和細(xì)胞外蛋白因子（ef）的擴(kuò)增引物，上述引物均由吉林省長(zhǎng)春市庫(kù)美生物科技有限公司合成。本試驗(yàn)所用引物序列詳見表1。

表1 引物序列信息

4.豬鏈球菌的分離培養(yǎng)及革蘭氏染色。無菌剪取病豬的淋巴結(jié)、脾、肝和肺等病料，將樣品編號(hào)、勻漿后，按1∶50轉(zhuǎn)接至含5毫升THB培養(yǎng)基的試管中，37℃ 230轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)8小時(shí)后，將菌液接種于血瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)16～20小時(shí)。挑取特征性單菌落進(jìn)行革蘭氏染色后鏡檢觀察。

5.豬鏈球菌的PCR鑒定。選取革蘭氏染色陽(yáng)性的、鏈狀的單菌落接種至THB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)16～20小時(shí)后進(jìn)行菌液PCR鑒定。PCR擴(kuò)增體系如下：依次加入5×Buffer 4微升、Prime STARRHS聚合酶0.5微升，2.5毫摩/升 dNTPs2微升、上、下游引物各0.5微升、菌液模板1微升，最后加滅菌的ddH2O至終體積為20微升。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，60℃退火1分鐘，72℃延伸1.5分鐘，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10分鐘。將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，觀察結(jié)果。

6.豬鏈球菌的生化試驗(yàn)。取適量豬鏈球菌分離株的菌液接種于細(xì)菌微量生化反應(yīng)管中，37℃條件下靜置培養(yǎng)48小時(shí)，觀察反應(yīng)管的顏色變化，分析該菌株的生化反應(yīng)特性。

7.豬鏈球菌的血清型鑒定。采用PCR方法，利用表1中的引物序列對(duì)分離得到的豬鏈球菌進(jìn)行血清分型。

8.豬鏈球菌的耐藥性分析。將鑒定得到的豬鏈球菌菌株按照1∶100接種于THB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)16～20小時(shí)，用滅菌的PBS調(diào)整濁度為0.5MCF后均勻涂布于血瓊脂平板上，37℃靜置培養(yǎng)24小時(shí)后，采用紙片擴(kuò)散法對(duì)分離到的豬鏈球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)分析。

9.豬鏈球菌的毒力基因檢測(cè)。選擇豬鏈球菌的5種主要毒力因子作為鑒定基因，以分離到的豬鏈球菌的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：Prime STARRHS聚合酶0.5微升，5×Buffer 4微升，2.5毫摩爾/升 dNTPs 2微升，DNA 1微升，上、下游引物各0.5微升，補(bǔ)齊ddH2O至20微升。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性10分鐘，95℃變性40秒，50～58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10分鐘。將擴(kuò)增得到的PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送庫(kù)美生物技術(shù)有限公司測(cè)定序列，登錄NCBI對(duì)所測(cè)序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

二、結(jié)果與分析

1.豬鏈球菌分離培養(yǎng)及鑒定結(jié)果。從病死豬的臟器中分離出的細(xì)菌在THB培養(yǎng)基和血平板上均能很好的生長(zhǎng)，進(jìn)行革蘭氏染色后發(fā)現(xiàn)菌體呈藍(lán)紫色、短桿狀，且多是3個(gè)以上形成鏈狀，而分離的菌株在血平板上生長(zhǎng)時(shí)出現(xiàn)典型的β溶血環(huán)。挑取單菌落經(jīng)16S rRNA鑒定后，確認(rèn)分離出的細(xì)菌為豬鏈球菌。進(jìn)一步的生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株可分解乳糖、蔗糖等多種糖類，不分解山梨醇和甘露醇，觸酶試驗(yàn)等均為陰性，這與豬鏈球菌的生化特性相符（表2）。血清型PCR鑒定結(jié)果顯示，該分離菌株為血清9型。

表2 豬鏈球菌分離株的生化試驗(yàn)結(jié)果

2.豬鏈球菌的耐藥性結(jié)果。利用藥敏試驗(yàn)分析豬鏈球菌分離株對(duì)13種抗菌藥物的耐藥情況，結(jié)果顯示，該分離株對(duì)先鋒、菌必治等6種抗菌藥物敏感，而對(duì)強(qiáng)力霉素、乙酰螺旋霉素、林可霉素、磺胺異惡唑和新霉素這5種抗菌藥物均表現(xiàn)出耐藥，且呈多重耐藥（表3）。

表3 分離的豬鏈球菌的藥敏結(jié)果

3.豬鏈球菌的毒力基因分析結(jié)果。對(duì)分離得到的豬鏈球菌分離株進(jìn)行5對(duì)毒力基因的擴(kuò)增，結(jié)果顯示，該分離株攜帶的毒力基因有Sly、gdh、mrp和Orf2。

三、討論和結(jié)論

豬鏈球菌是當(dāng)前豬場(chǎng)中一種常見的細(xì)菌性病原，豬鏈球菌的無毒和強(qiáng)毒株均可從豬群中分離。近年來，隨著大規(guī)模集約化養(yǎng)豬模式發(fā)展，給豬鏈球菌的感染和傳播提供了可乘之機(jī)，造成了豬鏈球菌病的發(fā)生和流行。在本試驗(yàn)中，通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、革蘭氏染色鏡檢、16S rRNA鑒定和生化試驗(yàn)分析的方式確定從病豬不同病料中分離到的細(xì)菌是一株豬鏈球菌。PCR作為豬鏈球菌的鑒定方法具有很高的準(zhǔn)確性，而生化反應(yīng)結(jié)果是常規(guī)細(xì)菌鑒定的一個(gè)重要參考，對(duì)PCR方法起到很好的佐證作用。進(jìn)一步經(jīng)血清型鑒定，該株豬鏈球菌為血清9型，而該血清型屬于主要的人畜共患血清型之一。雖然我國(guó)至今尚未有SS9感染人的報(bào)道，但近年來SS9在臨床中的分離率逐年遞增，且有擴(kuò)大流行的趨勢(shì)，應(yīng)引起養(yǎng)豬場(chǎng)的高度關(guān)注。由于豬鏈球菌滅活疫苗的免疫效果不夠理想，臨床中防治豬鏈球菌仍然依靠抗菌藥物，養(yǎng)豬場(chǎng)可根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果首選高敏感藥物。有研究證實(shí)，豬鏈球菌對(duì)常用的抗菌藥物有較高的耐藥性，且存在多重耐藥性和耐藥基因遺傳的情況。本試驗(yàn)的藥敏檢測(cè)結(jié)果顯示，該分離株呈現(xiàn)多重耐藥，表明該豬場(chǎng)的豬只感染的豬鏈球菌耐藥現(xiàn)象較為嚴(yán)重。豬鏈球菌的致病性強(qiáng)弱與其攜帶的毒力基因有密切聯(lián)系，其中細(xì)胞外蛋白因子、溶血素和溶菌酶釋相關(guān)蛋白是其主要的毒力因子。在之前的研究中，關(guān)于SS9的毒力因子研究很少，而大多數(shù)SS9菌株很少檢出上述3種毒力基因。但近年來，在不同國(guó)家的SS9分離株中分別檢測(cè)出了Sly基因和mrp基因，而本研究中從遼寧分離到的這株SS9也攜帶這兩種主要毒力基因，提示這株分離株可能具備較強(qiáng)的毒力和致病性，但還需要進(jìn)一步在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行致病力分析才能得到確認(rèn)。