電針對老年大鼠關節軟骨及軟骨下骨極化相關蛋白表達的影響

黃夏榮 周君 孫光華 彭昕珂 廖源 劉靜 羅敷 鐘培瑞 彭婷 胡莉芝

南華大學衡陽醫學院附屬第一醫院1康復醫學科、康復醫學中心、康復醫學實驗室，3肛腸科（湖南衡陽 421001）；2廣州醫科大學附屬第六醫院，清遠市人民醫院康復科（廣東清遠 511500）

骨關節炎（OA）是一種伴有軟骨下骨病變的關節軟骨退行性疾病［1］。目前OA 的臨床治療以保守治療為主，西醫多采用藥物治療，中醫治療手段豐富，其中電針作為一種重要的中醫治療方法，其治療OA 的療效確切。臨床研究顯示［2］，電針能緩解膝骨關節炎患者疼痛，改善膝關節的功能。基礎研究顯示電針能抑制軟骨細胞降解［3］，緩解軟骨細胞退變［4］。近年來，巨噬細胞極化在OA 中的作用越來越受到關注，M1 型巨噬細胞是促炎性細胞，而M2 型巨噬細胞是抗炎性細胞，兩者維持動態平衡，當受到外界刺激時可互相轉化。有報道顯示［5］M1 和M2 型巨噬細胞動態失衡時可反映OA 的嚴重程度，當M1/M2 型巨噬細胞比例增大時，OA 病理損傷越嚴重。本研究通過電針干預老年大鼠，觀察電針治療對老年大鼠關節軟骨及軟骨下骨極化相關蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物16 只24 月齡SD 雄性大鼠，體質量（709 ± 93）g ，8 只6 月齡SD 雄性大鼠，體質量（501 ± 23）g，由長沙天勤生物技術公司提供，合格證號CXK（湘）2019-0015，飼養于南華大學動物部，自由飲食飲水。實驗方案經南華大學衡陽醫學院附屬第一醫院醫學倫理委員會批準（批準號：202005110032）。實驗過程中，遵循《關于善待實驗動物的指導性意見》等相關規定。

1.2 主要試劑及儀器血清Ⅱ型膠原C 端肽試劑盒（中國北京，康為世紀，批號C0681257875），Micro-CT（美國GE 公司，eX-plore Locus SP 型），臺式冷凍離心機（中國湖南湘儀，型號H1650R），熒光定量RCP 儀（美國Thermo，型號PIKOREAL96），熒光PCR 板（美國Thermo，型號SPL0960），電泳儀（中國北京六一，DYY-2C），水平瓊脂糖電泳槽（中國北京六一，型號DYCP-31DN），mRNA 逆轉錄試劑盒（中國北京康為世紀，批號CW2569），miRNA 逆轉錄試劑盒（中國北京康為世紀，批號CW2141），Trizol（美國Thermo，批號15596026），華佗牌電針儀（蘇州醫療用品有限公司，型號SDZ-V），華佗牌一次性無菌針（0.25 mm × 25 mm，蘇州醫療用品廠有限公司）。

1.3 分組與造模24 月齡SD 雄性大鼠16 只，隨機分為老年組和電針組，每組8 只；8 只6 月齡SD雄性大鼠為青年組。通過自然衰老方式復制骨關節炎動物模型［6］。

1.4 干預方法電針組接受電針干預，大鼠四肢固定于鼠板，參照《實驗動物常用穴位名稱與定位第2 部分：大鼠》［7］取穴：雙側“太溪”、“足三里”、“陽陵泉”、“血海”。進針深度約3～5 mm，電針參數：疏密波，疏波頻率3 Hz，密波15 Hz，電流強度1 mA，30 min/次，1 次/d，每周5 d，連續8 周。其余兩組不干預。

1.5 主要觀察指標2%戊巴比妥鈉（80 mL/kg）腹腔注射進行麻醉。本研究參照課題組前期研究［8］，摘除大鼠眼球，于眼眶取血用于ELISA 法檢測Ⅱ型膠原C 端肽（CTX-Ⅱ）；切取左側脛骨平臺2 cm 左右骨標本，左脛骨多聚甲醛固定用于Micro-CT 檢測；番紅-固綠染色觀察左脛骨平臺軟骨組織形態學結構；右側脛骨平臺用于RT-qPCR、Western blot 檢測。

1.5.1 ELISA 檢測外周血CTX-Ⅱ 大鼠眼眶取血3 mL，2～8 ℃1 000 ×g離心外周血15 min，取上清，按ELISA 試劑盒說明檢測CTX-Ⅱ水平。

1.5.2 Micro-CT 檢測左脛骨微結構左脛骨多聚甲醛浸潤24 h，冰箱保存。置于Micro-CT 下掃描，觀察各組大鼠骨密度（BMD），骨體積分數（BV/TV），骨小梁厚度（Tb.Th），骨小梁數量（Tb.N），骨小梁間距（Tb.Sp）。

1.5.3 番紅-固綠染色Micro-CT 檢測后，左脛骨EDTA 脫鈣，脫水，石蠟包埋，常規切片。將石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min，無水乙醇5 min，95%酒精5 min，85%酒精5 min，蒸餾水沖洗10 min。將切片放入1%番紅染液染色2 h，蒸餾水沖洗，放入50%，70%，80%梯度酒精脫色各1 min。切片放入0.5%固綠染液中染色30～60 s。無水乙醇Ⅰ中脫色30 s，無水乙醇Ⅱ中脫色1 min。切片烤干后于二甲苯透明5 min，中性樹膠封片。

1.5.4 Mankin's 評分用改良Mankin＇s 評分量表［9］，評估左脛骨平臺軟骨組織形態結構，包括軟骨結構，軟骨細胞，染色情況，潮線4 個方面。具體評估標準如下，軟骨結構：軟骨表面正常0 分；表面不規則，有裂隙1 分；表面有裂隙，達移行層2 分；裂隙到輻射層3 分；裂隙達鈣化層4 分；軟骨脫落，無法分清結構5 分。軟骨細胞：正常0 分，彌散增多1 分；出現大量細胞聚集2 分；細胞數量明顯減少3 分。染色情況：正常0 分，輕度減少1 分；中度減少2 分；重度減少3 分；染色消失4 分。潮線：正常0 分，多重潮線1 分，血管入侵潮線2 分。

1.5.5 RT-qPCR 法檢測大鼠右側脛骨平臺各指標mRNA表達水平取組織約0.02 g，加入1 mL Trizol，按Trizol 法提取軟骨及軟骨下骨中總mRNA，以組織總mRNA 為模板，逆轉錄cDNA。檢測右側脛骨平臺基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）、基質金屬蛋白酶-3（MMP-3）、基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、巨噬細胞甘露糖受體（MMR）、精氨酸酶1（Arg1）mRNA 表達水平。運用primer5 軟件設計引物，由北京擎科合成引物，引物序列見表1。

表1 引物信息Tab.1 Primer sequence

1.5.6 Western blot 檢測大鼠右側脛骨平臺各指標蛋白的表達水平取關節軟骨組織約0.025 g，用PBS 清洗，加入300 μL RIPA 裂解液反復研磨，12 000 r/min 離心20 min 提取蛋白。配制10%的分離膠，4.8%濃縮膠制膠，開始電泳，電泳恒定電壓75 V，時間為130 min，300 mA 恒定電流轉膜。按比例稀釋一抗，二抗。一抗MMP1 以1∶1 000，MMP3、MMP13 以1∶5 000，TNF-α 以1∶1 000，IL-1β以1∶1 000，MMR 以1∶1 000，Arg1 以1∶5 000 比例稀釋。二抗HRP goat anti-mouse IgG 以1∶5 000 比例稀釋。封閉抗體孵育，ECL 發光液暗室曝片，顯影沖洗，用quantity oneV4.6.2 專業灰度分析軟件進行分析。檢測右側脛骨平臺MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β、MMR、Arg1 蛋白表達水平。

1.6 統計學方法采用SPSS 26.0 軟件進行數據分析，計量數據符合正態分布以表示，組間采用單因素方差分析，兩兩比較若方差齊性采用LSD 檢驗，方差不齊則采用Dunnetts T3 檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CTX-Ⅱ含量比較青年組、老年組、電針組大鼠CTX-Ⅱ水平依次是（1.62 ± 0.271）、（4.24 ±0.558）、（2.74±0.414）ng/mL。與青年組相比，老年組大鼠外周血中CTX-Ⅱ含量增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與老年組大鼠相比，電針組大鼠外周血中CTX-Ⅱ水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 左膝關節軟骨下骨顯微CT 比較顯微CT 顯示，青年組大鼠骨小梁結構完整，數量較多，排列緊密，骨小梁間距較小；與青年組相比，老年組大鼠骨小梁結構異常，數量明顯減少，排列稀疏，骨小梁間距增大；與老年組相比，電針組大鼠骨小梁數量有增加，排列較緊密，間距減小，見圖1。

圖1 各組大鼠左膝關節軟骨下骨顯微CT 比較Fig.1 Comparison of micro-CT scan of subchondral bone of left knee joint in each group

2.3 左脛骨微結構比較與青年組相比，老年組大鼠骨密度、骨體積分數、骨小梁數量減少，差異有統計學意義（P＜0.05），骨小梁厚度、骨小梁間距增大，差異有統計學意義（P＜0.05）；與老年組相比，電針組骨密度、骨體積分數、骨小梁數量增加，差異有統計學意義（P＜0.05），骨小梁間距減少，差異有統計學意義（P＜0.05），骨小梁厚度有減小的趨勢，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠軟骨下骨微結構比較Tab.2 Comparison of subchondral bone microstructure of rats in each group ±s

注：與青年組比較，*P＜0.05；與老年組比較，#P＜0.05

組別青年組老年組電針組例數8 8 8 BMD（g/cm3）0.31 ± 0.303 0.19 ± 0.0285*0.26 ± 0.051#BV/TV（%）18.48 ± 2.359 8.46 ± 2.306*13.98 ± 4.913#Tb.Th（mm）0.09 ± 0.007 0.10 ± 0.005*0.10 ± 0.011 Tb.N（1/mm）2.10 ± 0.206 0.82 ± 0.236*1.38 ± 0.494#Tb.Sp（mm）0.33 ± 0.036 0.81 ± 0.121*0.63 ± 0.209#

2.4 軟骨組織番紅-固綠染色比較青年組大鼠軟骨表面平整，軟骨細胞數量正常，排列整齊有序，形態結構正常，染色均勻。老年組大鼠軟骨表明結構破壞嚴重，軟骨與軟骨下骨分解不清，鈣化嚴重，出現多重潮線，細胞數量明顯減少，出現裂層，細胞形態結構異常，染色不均。電針組軟骨表明稍平整，未見明顯裂層，軟骨細胞數量較老年組有所增加，染色較均勻。見圖2。

圖2 各組大鼠關節軟骨組織番紅O-固綠染色比較（× 200）Fig.2 Comparison of fuchsin O-fast green staining in articular cartilage of rats in each group（× 200）

2.5 Mankin's 評分比較青年組、老年組、電針組大鼠Mankin＇s 評分依次是（0.75 ± 0.463）、（10.63 ±1.847）、（5.75 ± 1.035）分。與青年組相比，老年組Mankin＇s 評分增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與老年組相比，電針組Mankin＇s 評分降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.6 MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA 和蛋白表達比較與青年組相比，老年組大鼠右側脛骨平臺MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA 和蛋白表達水平增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與老年組相比，電針組MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA 和蛋白表達水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3、4、圖3。

圖3 各組大鼠MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白表達水平比較Fig.3 Comparison of MMP-1，MMP-3，MMP-13 protein expression in different groups of rats

表3 各組大鼠基質金屬蛋白酶mRNA 表達比較Tab.3 Comparison of mRNA expression of matrix metalloproteinases in different groups ±s

表3 各組大鼠基質金屬蛋白酶mRNA 表達比較Tab.3 Comparison of mRNA expression of matrix metalloproteinases in different groups ±s

注：與青年組比較，*P＜0.05；與老年組比較，#P＜0.05

組別青年組老年組電針組例數5 5 5 MMP-1 0.994 ± 0.407 8.523 ± 1.748*4.631 ± 3.387#MMP-3 1.682 ± 0.498 21.534 ± 5.120*13.181 ± 2.343#MMP-13 1.280 ± 0.492 8.502 ± 1.519*5.538 ± 0.967#

表4 各組大鼠基質金屬蛋白酶的蛋白表達水平比較Tab.4 Comparison of protein expression level of matrix metalloproteinases in different groups ±s

表4 各組大鼠基質金屬蛋白酶的蛋白表達水平比較Tab.4 Comparison of protein expression level of matrix metalloproteinases in different groups ±s

注：與青年組比較，*P＜0.05；與老年組比較，#P＜0.05

組別青年組老年組電針組例數5 5 5 MMP-1 0.292 ± 0.010 0.584 ± 0.010*0.450 ± 0.087#MMP-3 0.172 ± 0.089 0.524 ± 0.107*0.296 ± 0.106#MMP-13 0.254 ± 0.040 0.484 ± 0.082*0.370 ± 0.070#

2.7 TNF-α、IL-1β、MMR、Arg1 mRNA 和蛋白表達比較與青年組相比，老年組大鼠右側脛骨平臺TNF-α、IL-1β mRNA 和蛋白表達升高，而MMR、Arg1 mRNA 和蛋白表達降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與老年組相比，電針組TNF-α、IL-1β mRNA 和蛋白表達降低，而MMR、Arg1 mRNA 和蛋白表達升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表5、6、圖4。

表5 TNF-α、IL-1β、MMR、Arg1mRNA 表達比較Tab.5 Comparison of the expression of TNF-α，IL-1β，MMR and Arg1mRNA ±s

表5 TNF-α、IL-1β、MMR、Arg1mRNA 表達比較Tab.5 Comparison of the expression of TNF-α，IL-1β，MMR and Arg1mRNA ±s

注：與青年組相比，*P＜0.05；與老年組相比，#P＜0.05

組別青年組老年組電針組例數5 5 5 TNF-α 0.942± 0.271 3.889± 0.729*2.358± 0.589#IL-1β 1.659± 0.849 15.283± 3.807*9.475± 2.547#MMR 0.927± 0.185 0.259± 0.074*0.719± 0.094#Arg1 1.032± 0.179 0.283± 0.107*0.726± 1.177#

表6 TNF-α、IL-1β、MMR、Arg1 蛋白表達比較Tab.6 Comparison of TNF- α，IL-1 β，MMR and Arg1 protein expression ±s

表6 TNF-α、IL-1β、MMR、Arg1 蛋白表達比較Tab.6 Comparison of TNF- α，IL-1 β，MMR and Arg1 protein expression ±s

注：與青年組比較，*P＜0.05；與老年組比較，#P＜0.05

組別青年組老年組電針組例數5 5 5 TNF-α 0.210± 0.112 0.660± 0.168*0.412± 0.113#IL-1β 0.114± 0.080 0.534± 0.113*0.348± 0.089#MMR 0.416± 0.088 0.126± 0.068*0.246± 0.098#Arg1 0.620± 0.078 0.318± 0.015*0.462± 0.043#

3 討論

中醫認為，骨關節炎屬“骨痹”。本病的發生以腎精虧虛為本，還與外邪侵襲、勞損過度等有關。《靈樞·邪氣藏府病形篇》曰：“……筋急，陽陵泉主之”。研究表明［10］火針刺激陽陵泉，可緩解膝骨關節炎患者疼痛、僵硬及活動障礙。《靈樞》指出“著痹不去，久寒不已，卒取其三里骨為干”。談倩等［11］研究顯示針刺結合艾灸刺激足三里能有效抑制大鼠炎癥因子的表達，緩解軟骨退變。血海是足太陰脾經上的重要穴位，具有化血為氣，運化脾血之功能；太溪為腎經俞穴，可滋陰益腎，壯陽強腰，故本研究采用以上穴位進行刺激。

本研究中，大鼠左脛骨平臺軟骨組織番紅-固綠染色顯示，大鼠左脛骨軟骨組織結構破壞嚴重，鈣化嚴重，出現多重潮線，細胞數量明顯減少，表明骨關節炎模型復制成功。改良Mankin＇s 評分是學術界公認評估骨關節炎軟骨退變程度的通用標準，共14分，得分越高，表明軟骨退變越嚴重。本研究中老年組大鼠改良Mankin＇s 評分10.625±1.847，說明老年組大鼠膝關節軟骨退變嚴重。

CTX-Ⅱ是Ⅱ型膠原降解產物之一，因其不易被降解，具有較高的穩定性和可靠性，因此CTX-Ⅱ常被當作評估OA 軟骨降解的標志物［12］。目前普遍認為，CTX-Ⅱ的表達水平與OA 軟骨降解程度成顯著關系。當軟骨降解時，CTX-Ⅱ表達升高；反之，當降解被抑制時，CTX-Ⅱ表達降低。孫光華等［3］研究表明，電針刺激去卵巢大鼠，能顯著降低尿液中CTX-Ⅱ的含量。史曉偉等［13］研究也表明，電針能降低兔膝骨關節炎關節液中CTX-Ⅱ的表達水平。在本研究中，老年組血液中CTX-Ⅱ較青年組CTX-Ⅱ升高，說明老年組大鼠關節軟骨發生了降解。電針干預后，電針組CTX-Ⅱ降低，說明電針干預能抑制大鼠關節軟骨的降解。這與上述研究結果［3，13］一致。

有研究表明［14］，OA 早期軟骨下骨局部可形成骨質疏松。在一項電針治療骨質疏松大鼠的研究中顯示［15］，電針可使大鼠骨密度升高，骨體積和骨小梁數量增加。鐘培瑞等［8］研究顯示，電針可提高老年骨質疏松大鼠的骨密度。本研究通過對大鼠左脛骨平臺Micro-CT 分析顯示，電針能使老年大鼠骨密度，骨體積分數，骨小梁數量均增加，骨小梁間距降低。說明電針干預能夠改善老年大鼠骨質疏松。

關節軟骨主要由軟骨基質和軟骨細胞組成，其中軟骨基質占絕大部分。在正常情況下，軟骨基質合成與降解維持動態平衡，當OA 發生時，平衡被打破。基質金屬蛋白酶（MMPs）是一種基質降解酶，由炎性細胞、成纖維細胞等分泌而來，在軟骨基質合成與分解過程中起到重要作用。MMPs 有多種亞型，所有亞型具有類似的結構，均由10 個外顯子和9 個內含子組成，且具有分解蛋白質的能力。有研究顯示OA 發生后，MMPs 各亞型在體內的表達都升高［16］。相關研究證實MMP-1、MMP-3、MMP-13 等與OA 的發生過程有著密切關系［17-18］。在本研究中，老年組大鼠MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA 和蛋白表達較青年組均升高，這表明老年組大鼠軟骨及軟骨下骨發生了降解；電針干預后，電針組大鼠MMP1、MMP3、MMP13 mRNA及蛋白的表達均降低，這表明電針干預能夠抑制老年大鼠軟骨及軟骨下骨降解，從而保護關節軟骨及軟骨下骨。類似的結果在其他相關研究中也得到了證實［19-22］。

巨噬細胞是主要的免疫細胞，巨噬細胞極化與OA 有著密切關系［23］。巨噬細胞可分為經典活化型巨噬細胞（M1 型）和替代活化型巨噬細胞（M2型）［24］，其中M1型巨噬細胞通過分泌IL-1β、TNF-α、NO 等細胞因子，發揮促炎癥反應作用［25-26］；M2 型巨噬細胞通過分泌Arg1、MMR、類抵抗素a（Fizzl）、類幾丁質酶（Ym1）等細胞因子，發揮抑制免疫反應、促進組織修復的作用［27-28］。有研究表明，巨噬細胞向M2 型表型極化，可減輕大鼠的疼痛和軟骨退化［29］；還可釋放某些因子，對組織愈合和成骨分化發揮免疫調節作用［30-31］，而M1 型極化會導致組織損傷［32-33］。因此，促進巨噬細胞向M2 型轉化，有助于改善OA 關節內穩態，促進組織修復，抑制軟骨細胞退變。在本研究中，老年組大鼠TNF-α、IL-1β mRNA 和蛋白表達較青年組大鼠均升高，MMR、Arg1 mRNA 和蛋白表達降低，說明老年組大鼠軟骨及軟骨下骨可能向M2 型極化減少；電針干預后，電針組大鼠TNF-α、IL-1β mRNA 和蛋白表達較老年組大鼠均降低，MMR、Arg1 mRNA 和蛋白表達升高，說明電針干預能促進軟骨及軟骨下骨向M2 型極化。

綜上所述，電針可能通過促進老年大鼠OA 關節軟骨及軟骨下骨M2 極化，緩解關節軟骨降解及抑制軟骨下骨骨質疏松，從而達到保護關節的作用。需指出的是，電針的參數國內尚未統一，本實驗所用的參數參考了國內既往相關研究，具有一定的局限性。