鐵死亡在胰腺癌吉西他濱耐藥中的研究進展

李響 田國鋒 肖宛儒 郝靚

1中國醫科大學法醫學院化學教研室（沈陽 110122）；2遼寧省法醫學生物證據重點實驗室（沈陽 110122）；3中國醫科大學司法鑒定中心（沈陽 110122）；4中國醫科大學第一臨床學院2019 級（沈陽 110000）

胰腺癌（pancreatic cancer）是一種惡性程度極高、生存率極低和預后極差的消化道腫瘤［1］，其治療方法主要包括手術、放療、化療和介入治療。胰腺癌的治療強調綜合治療和多學科合作，根據不同患者的身體狀況、腫瘤部位、侵襲范圍、黃疸、肝腎、心肺功能等情況綜合應用現有的診斷和治療手段，最大限度地提高治療效果，減少身體損傷［2］。目前，胰腺癌唯一的根治方法是手術切除。然而，由于早期缺乏特異性臨床癥狀等原因，大多數胰腺癌患者被確診時已進展至晚期而失去手術根治切除條件。因此，全身化療是晚期胰腺癌主要甚至是唯一的治療方案。胰腺癌常見的化療方案包括改良FOLFIRINOX 方案、吉西他濱單藥或5-Fu，紫杉醇聯合治療等［3］。吉西他濱是晚期胰腺癌患者化療的一線藥物，通過影響DNA 的復制過程，抑制胰腺腫瘤細胞生長增殖。然而，隨著化療藥物的治療進展，大多數胰腺癌細胞通過各種機制誘導其對化療藥物的耐藥性增加，這種耐藥性的增加使患者在后續吉西他濱治療中效果顯著下降，這也是晚期胰腺癌生存率進一步降低的重要原因之一，使得晚期胰腺癌的治療受到巨大的阻礙和挑戰［4-5］。近年來，改善耐藥研究暫未取得令人滿意的結果，究其原因在于腫瘤微環境與腫瘤干細胞的多變性、一些針對臨床試驗由于高毒性和血液中過量的藥物劑量而失敗等問題。因此，細化胰腺癌吉西他濱耐藥機制和具體分子通路，尋找抑制腫瘤微環境的更好方法，探索如何改善胰腺癌細胞對吉西他濱耐藥性是近年來臨床研究的活躍領域。2012 年，DIXON 等［6］在實驗中發現并命名了一種鐵依賴型的新型細胞程序性死亡形式——鐵死亡。鐵死亡的調控機制也被廣泛研究并應用于胰腺癌的治療中［7-8］。BADGLEY 等［9］研究證實了誘導胰腺癌細胞鐵死亡是一種可待深入探索的新型治療手段，其可有效抑制胰腺癌細胞的生長增殖，并改善胰腺癌細胞對化療藥物的耐藥。

1 吉西他濱代謝及相關耐藥機制

吉西他濱是晚期胰腺癌患者化療的一線藥物，通過影響DNA 的復制過程，抑制胰腺腫瘤細胞生長增殖。然而，大多數患者在應用吉西他濱化療數周后便表現出對吉西他濱的耐藥性［10］，進而影響治療效果和預后。因此，抑制胰腺癌患者吉西他濱耐藥性進而改善預后是胰腺癌臨床治療領域的重要研究方向。

1.1 吉西他濱在細胞內代謝過程吉西他濱到達腫瘤組織后首先經人核苷轉運體（human NTs，hNTs）轉運進入腫瘤細胞，先后經過脫氧胞苷激酶（deoxycytidine kinase，dCK）和嘧啶核苷單磷酸激酶（monophosphate kinase，NMPK）的作用被磷酸化為dFdCDP。最終在核苷二磷酸激酶（nucleoside diphosphate kinase，NDPK）的作用下磷酸化為具有藥物活性作用的形式——dFdCTP。dFdCTP 是脫氧胞苷三磷酸（dCTP）的競爭性底物，可以被整合入正在復制的DNA 鏈中，影響DNA 的復制過程，且能避免被核酸外切酶校對識別并切除。大部分的吉西他濱在細胞內被胞苷脫氨酶（cytidine deaminase，CDA）誘導脫氨失去活性，產生大量低活性產物——2＇，2＇-二氟脫氧尿苷（dFdU）［11］，見圖1。

圖1 吉西他濱胞內代謝過程Fig.1 Intracellular metabolism of gemcitabine

1.2 吉西他濱耐藥機制從吉西他濱代謝過程中不難發現，人核苷轉運體介導的藥物攝取、脫氧胞苷激酶介導的細胞內代謝以及胞苷脫氨酶所介導的藥物滅活是引起吉西他濱耐藥的重要原因。除此之外，還有許多因素能夠引發胰腺癌細胞表現出對吉西他濱的耐藥性。ATP 結合盒（ABC）轉運介導的藥物外排被認為是胰腺癌吉西他濱耐藥的最關鍵機制之一［12］。腫瘤微環境（TME）與腫瘤耐藥密切相關，可通過招募和分泌多種保護性細胞因子增強腫瘤抗藥性，也可通過構建物理屏障、影響腫瘤細胞生長代謝等介導耐藥［13］。腫瘤干細胞（CSCs）是腫瘤中具有自我更新能力并能產生異質性腫瘤細胞的細胞。CSCs 導致治療耐藥的作用與激活DNA 損傷檢查點修復密切相關［14］。由此可見，胰腺癌細胞通過多種方式引起吉西他濱耐藥的發生，逆轉耐藥是晚期胰腺癌治療的關鍵所在。

2 胰腺癌細胞鐵死亡的調控分子機制

2012 年，DIXON 等［6］在實驗中發現了鐵死亡及其在細胞內的致死過程。研究表明鐵死亡通過鐵依賴性芬頓反應產生的脂質過氧化物（LPO）和致死性活性氧（ROS）在胰腺癌細胞內累積進而導致細胞程序性死亡。相比于“自殺”，鐵死亡更像是一種“破壞”機制。細胞內鐵過載后通過芬頓反應產生具有細胞毒性的脂質過氧化物，當其細胞毒作用超過了細胞內由GPX4 作為主要成分的抗氧化系統保護作用時，細胞發生鐵死亡。胰腺癌細胞內鐵死亡調控機制主要為以下3 條途徑，System XC--GSH-GPX4 通路、鐵離子代謝通路和脂質過氧化通路。見圖2。

圖2 鐵死亡調控機制Fig.2 Regulatory mechanism of ferroptosis

2.1 System XC--GSH-GPX4通路谷氨酸/胱氨酸逆向轉運體體（glutamate/cystine antiporter，System XC-）是一種鑲嵌于細胞膜上的跨膜轉運蛋白。System XC-能夠將細胞外的胱氨酸轉運到細胞內。隨后，胱氨酸的二硫鍵在還原酶的作用下轉化為巰基，進而生成半胱氨酸。半胱氨酸是合成細胞內具有抗氧化功能的主要因子谷胱甘肽（glutathione，GSH）的重要原料。谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）被谷胱甘肽激活后能夠發揮其清除細胞內產生的致死性活性氧（ROS），并將有毒的脂質過氧化物轉化為無毒的脂質醇的重要生理功能［15-16］，進而抑制細胞鐵死亡。由此可見，抑制System XC--GSH-GPX4 通路介導的抗氧化系統是改善吉西他濱耐藥的可能手段。

2.2 鐵離子代謝通路細胞內鐵平衡是通過細胞對鐵的攝取、轉運和代謝維持的。轉鐵蛋白（TF）負載細胞外游離的Fe3+，與表達在細胞膜表面的轉鐵蛋白受體（TFR）結合，將Fe3+轉運到細胞內。Fe3+在STEAP3（一種金屬還原酶）的作用下被還原為Fe2+。當細胞內鐵平衡被打破，堆積過量的Fe2+與H2O2發生芬頓反應產生大量致死性活性氧（ROS）導致細胞鐵死亡［17］。有研究發現，熱休克蛋白B1（HSPB1）可以通過抑制TFR1 的受體功能降低細胞內鐵含量，抑制細胞鐵死亡［18］。因此，調控胰腺癌細胞內的鐵離子代謝過程是誘導胰腺癌細胞鐵死亡的重要途徑。

2.3 脂質過氧化通路YANG 等發現，脂質過氧化物（LPO），尤其是磷脂過氧化物的堆積是引起細胞鐵死亡的標志性過程。在胰腺癌細胞中，多不飽和脂肪酸（PUFAs）更容易作為底物被氧化。PUFAs 經長鏈脂酰輔酶A 連接酶4（ACSL4）催化活化后，在溶血磷脂酰膽堿酰基轉移酶3（LPCAT3）的作用下發生酯化反應產生磷脂化多不飽和脂肪酸PUFAPLs，進而生成脂質過氧化物，引起細胞鐵死亡。細胞內多不飽和脂肪酸催化氧化過程中關鍵酶是ACSL4 和LPCAT3［19］。這也為未來研究誘導細胞內多不飽和脂肪酸氧化進而改善吉西他濱耐藥研究提供了新方向。

3 鐵死亡在胰腺癌吉西他濱耐藥中的研究

近年來有證據表明，鐵死亡與癌癥化療耐藥有關，誘導鐵死亡可以逆轉耐藥，是腫瘤抑制的重要機制［20］。深入研究鐵死亡與吉西他濱耐藥發生發展的內在聯系，鐵死亡調控機制在改善胰腺癌吉西他濱耐藥的臨床應用具有重要意義。

3.1 System XC--GSH-GPX4通路與耐藥溶質載體家族7 成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11/xCT）是System XC-的重要組成部分。通過向細胞內轉運胱氨酸，促進細胞合成谷胱甘肽過氧化物酶4，抑制細胞發生鐵死亡。TANG 等［21］研究發現，SLC7A11 在吉西他濱耐藥的胰腺癌細胞中高表達。柳氮磺吡啶（SSZ）是一種SLC7A11抑制劑，它與吉西他濱聯合使用可顯著抑制胰腺癌細胞的生長，并且提高了胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性［22］。因此，通過抑制SLC7A11 表達，阻斷GSH/GPX4 通路能夠降低吉西他濱的耐藥性。這一發現對胰腺癌靶向藥物研發提供了新的方向。

人精脒/精胺N1 乙酰基轉移酶2（Spermidine/spermineN1-Acetyltransferase2，SSAT2）是胰腺癌細胞內促生長因子低氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）降解過程中的關鍵酶。劉鑫鑫等［23］研究發現，在大鼠胰腺癌吉西他濱耐藥細胞株中SSAT2 蛋白水平顯著降低，同時鐵死亡負性調控標志物GPX4 顯著上調。所以促進SSAT2過表達可以降低胰腺癌細胞內GPX4 水平，從而提高胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性。同時，這一現象可被Ferrostatin-1（一種鐵死亡抑制劑）部分逆轉。表明誘導SSAT2 過表達可以改善吉西他濱的耐藥性。然而，過表達SSAT2 與耐藥抑制的具體分子機制尚不明確，仍需進一步試驗證實。誘導SSAT2 過表達為研究胰腺癌細胞鐵死亡調控與改善耐藥拓展了新方向。

NRF2 是一種致癌轉錄因子，其功能是調節在癌細胞中產生GSH 的細胞抗氧化系統。有研究數據顯示，大部分癌細胞內存在NRF2 過表達，這與抗癌藥物治療效果差和癌癥患者預后生存期低相關。細胞中NRF2 的水平與鐵死亡的敏感性密切相關。NRF2 的表達增加可以抑制細胞對鐵死亡的敏感性，而NRF2 的表達減少可以增強癌細胞對鐵死亡誘導劑的敏感性［24］。DODSON 等［25］發現，NRF2 正調控了鐵死亡的關鍵蛋白，并能促進其下游靶點的轉錄，如SLC7A11、G6PD 和FTH176。這些基因參與脂質過氧化和鐵代謝，能夠在轉錄激活后負調節鐵死亡。NRF2 抑制劑及其下游靶點可能是增強PDAC 細胞對吉西他濱的敏感性的重要靶點。NRF2 抑制劑聯合鐵死亡誘導劑可能是殺死吉西他濱耐藥細胞的可行策略。

熱休克蛋白家族A 成員5（heat shock protein 5，HSPA5）是主要在內質網中表達的分子伴侶蛋白。最近研究顯示，HSPA5 過表達能夠抑制（胰腺導管腺癌）PDAC 細胞鐵死亡，防止GPX4 的降解，并抑制鐵死亡過程中的脂質過氧化。研究發現，當吉西他濱與HSPA5 抑制劑聯合用于治療PDAC 時，其治療效果明顯增加，這是通過誘導PDAC 鐵死亡來實現的。ZHU 等［26］通過實驗發現激活轉錄因子4（ATF4，一種氨基酸感應蛋白）導致HSPA5 表達增加，進而結合谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）來防止GPX4 蛋白降解和隨后的脂質過氧化。這項研究表明HSPA5-GPX4 通路的強化表達可以導致吉西他濱耐藥。相反，在體外和小鼠胰腺癌動物模型中，使用EGCG（兒茶素）或柳氮磺胺吡啶等鐵死亡誘導劑抑制HSPA5-GPX4 通路能夠增強了吉西他濱在PDAC 細胞中的敏感性。所以，抑制HSPA5 表達可以提高胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性。吉西他濱與靶向HSPA5 抑制劑的聯合應用可能是未來胰腺癌化療的新方法。

綜上所述，通過抑制System XC--GSH-GPX4 通路，降低胰腺癌細胞內GSH/GPX4 水平能夠改善胰腺癌細胞吉西他濱耐藥，為晚期胰腺癌患者聯合化療提供了新的研究方向。

3.2 鐵離子代謝通路與耐藥羰基還原酶1（CBR1）是一種NADPH 依賴性酶，通過抑制化療藥物治療過程中的氧化應激來保護癌細胞。白楊素是一種天然生物類黃酮，廣泛存在于蜂膠、蜂蜜和藍色西番蓮（西番蓮）中，已被證明是強效CBR1抑制劑。有研究發現，白楊素直接與CBR1 結合，在分子和細胞水平上抑制其酶活性，通過抑制CBR1，誘導FTH1（重組人鐵蛋白重鏈）的降解并導致細胞內游離鐵的增加，然后通過產生高活性羥基自由基參與Fenton 反應［27］促進胰腺癌細胞鐵死亡。研究發現，經過白楊素處理后的胰腺癌細胞內脂質過氧化增強和亞鐵離子（Fe2+）水平顯著增加。此外，白楊素處理后，PANC-1 細胞的線粒體變小，線粒體膜不清晰，線粒體嵴減少甚至消失［28］，這進一步表明白楊素導致了胰腺癌細胞鐵死亡的發生。這也表明了作為CBR1 抑制劑的白楊素可通過靶向抑制CBR1，通過促進細胞鐵離子代謝，增加細胞內鐵離子水平從而誘導細胞鐵死亡，增加胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性。

3.3 脂質過氧化通路與耐藥ADP核糖基化因子6（ARF6）是RAS 超家族中參與調節囊泡運輸、膜脂質重構和信號通路的重要因子。有研究發現，ARF6 能夠促進胰腺癌細胞的增殖。ARF6 并不直接調節脂質過氧化，但賦予胰腺癌細胞一種對氧化應激敏感的狀態，特別是RSL3 誘導的脂質過氧化。進一步研究發現ARF6 缺失會使ACSL4 蛋白表達上調，但對mRNA 表達無影響。這表明ARF6在翻譯后水平上對ACSL4 有正性調節作用，并通過將細胞脂質組成塑造為易于氧化的狀態來提高erastin、RSL3 等鐵死亡誘導劑改善吉西他濱耐藥性的效果［29-30］。然而，氧化狀態調控機制與改善吉西他濱耐藥性的關系有待進一步研究。這一發現為調節腫瘤微環境、抑制腫瘤干細胞抑制等抗耐藥方法提供新思路。

3.4 其他誘導通路與耐藥有報道說，將Erastin（一種鐵死亡誘導劑）與吉西他濱聯合使用可以增強吉西他濱對胰腺癌細胞的細胞毒性作用［31］。該研究還證實，鐵死亡誘導劑RSL3 也可以增加吉西他濱對胰腺癌的治療效果，而鐵死亡抑制劑Fer-1具有相反的作用。這些實驗證實了誘導胰腺癌細胞鐵死亡可降低胰腺癌細胞對吉西他濱治療的耐藥性。YE 等［32］研究證實了一種稱為FBW7（F 框/WD-40 域蛋白7，F-box and WD-40 domain protein 7）的酶，以影響吉西他濱的敏感性。研究發現FBW7可以促進胰腺癌細胞鐵死亡，推測它可能通過鐵死亡和細胞凋亡機制影響吉西他濱的細胞毒性。YE 等［32］使用鐵死亡抑制劑Fer-1 和凋亡抑制劑zVAD 治療FBW7 過表達的細胞，發現兩種治療均能抵消FBW7 過表達對吉西他濱的影響。因此，證實FBW7 通過鐵死亡和凋亡增強了吉西他濱的細胞毒性作用。這一發現表明促進FBXW7 表達可以通過鐵死亡途徑來降低吉西他濱的耐藥性。其具體機制尚待進一步深化研究，為吉西他濱聯合治療方案的更新提供了新想法。

含三聯基序11（TRIM11）蛋白在腫瘤發生發展中起著至關重要的作用，其可通過發生自聚泛素化，以抑制癌細胞選擇性自噬作用。UBE2N 是一種泛素結合酶（E2），參與蛋白質的泛素化修飾的過程。SHANG 等［33］研究發現TRIM11 能夠促進UBE2N 表達，抑制胰腺癌細胞鐵死亡并降低腫瘤細胞對吉西他濱的敏感性。檸檬酸鐵銨（FAC）能夠誘導PDAC 細胞發生鐵死亡，是一種鐵死亡誘導劑。SHANG 等［33］還發現FAC 誘導PDAC 細胞鐵死亡是通過降低TRIM11 的表達實現的，進而逆轉PDAC 細胞對吉西他濱敏感性的抑制作用。然而，抑制TRIM11 與吉西他濱耐藥發生發展的內在聯系尚不明確，深入研究TRIM11 改善耐藥機制為胰腺癌靶向治療提供了新的思路與方向。總的來說，多項實驗發現誘導胰腺癌細胞鐵死亡能夠改善其對吉西他濱的耐藥性，但其調控機制與吉西他濱耐藥發生的內在聯系尚不明確，具體分子調控機制有待深入研究。為晚期胰腺癌患者的吉西他濱聯合化療方案需進一步更新拓展了新方向。

4 展望

吉西他濱是晚期胰腺癌患者的一線化療藥物。其治療作用的限制性在隨著治療過程的進展逐漸顯現出來，如腫瘤細胞對其耐藥性會隨之增強。基于鐵死亡機制改善胰腺癌細胞對吉西他濱的耐藥性是現在胰腺癌治療研究的一大熱點。越來越多的實驗發現聯合應用吉西他濱與鐵死亡誘導劑相比于單獨應用吉西他濱治療可以明顯提高腫瘤治療效果，但其改善耐藥性的具體分子機制尚不明確。聯合治療所表現出更好的治療是基于誘導胰腺癌細胞鐵死亡和吉西他濱抑制DNA 復制過程的協同作用，或是由于鐵死亡能夠對吉西他濱的耐藥改善還有待進一步研究證明。此外，引起胰腺癌細胞鐵死亡的脂質過氧化物閾值以及脂質過氧化物對吉西他濱代謝的影響尚有待進一步研究與探討。深入研究鐵死亡改善胰腺癌細胞對吉西他濱耐藥性的分子機制和相關信號轉導通路對胰腺癌的治療具有重要意義，為未來腫瘤靶向治療提供新的研究方向和思路，為人類與“癌中之王”的抗爭提供更加強效的武器。