壯骨健膝方對脂多糖誘導兔滑膜成纖維細胞炎癥模型的影響

張英杰，張鵬，肖艷，劉俊，陳雨，邱夢婷，蘇友新*

（1.福建中醫藥大學中醫學院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學康復醫學院，福建 福州 350122）

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種慢性退行性關節疾病，病變部位可累及整個關節組織，病理變化主要包括軟骨退變、滑膜炎癥和軟骨下骨重塑異常等［1］。滑膜炎癥是關節持續退行性變的主要驅動因素，也是導致關節疼痛、腫脹和僵硬等臨床癥狀的主要原因，在KOA的發生發展中扮演重要角色［2］。滑膜成纖維細胞（fi-broblast-like synoviocytes，FLS）是滑膜炎癥的主要效應細胞之一，在其炎癥狀態下可分泌大量促炎細胞因子［3］，同時表現為過度增殖、侵襲等腫瘤樣特性［4］，對關節軟骨等組織造成損傷。核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）信號通路被激活后參與KOA滑膜炎癥的發生、發展［5］。抑制滑膜炎癥延緩膝關節病理改變、改善患者癥狀是目前治療KOA的重要環節。壯骨健膝方是課題組基于KOA“痹痿并見”的中醫特點總結的臨床效驗方，可顯著減輕患者膝關節疼痛、腫脹、行走無力等痹證、痿證的臨床癥狀［6］，前期在動物水平上的研究表明該方可顯著改善KOA滑膜炎模型兔滑膜內襯層細胞增生及炎性細胞浸潤等病理變化，減少關節液中炎癥指標含量，減輕炎癥反應［7］。本研究以兔FLS為研究對象，體外建立炎癥模型，觀察壯骨健膝方對模型的影響，以期在細胞水平上進一步闡明該方對KOA滑膜炎癥的干預效應及部分機制，為其臨床推廣應用提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物及細胞 12只3月齡普通級健康新西蘭大白兔，體質量（2.05±0.27）kg，由上海市松江區松聯實驗動物場提供，許可證號：SCXK（滬）2017-0008。委托福建中醫藥大學實驗動物中心代購并飼養，許可證號：SYXK（閩）2019-0007。兔滑膜成纖維細胞（批號：CP-Rb017）由武漢普諾賽生命科技有限公司提供，本研究方案經福建中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（倫理審批號：FJTCM IACUC 2019060）。

1.2 實驗藥物 壯骨健膝方（骨碎補15 g，川牛膝12 g，生地黃15 g，杜仲9 g，獨活6 g，雞血藤15 g，秦艽9 g，徐長卿9 g，?蟲6 g），由福建中醫藥大學國醫堂門診部提供，經福建中醫藥大學中藥鑒定教研室鑒定，所用藥材均符合《中華人民共和國藥典（2020年版）》質量要求。常規煎煮中藥并采用旋轉蒸發儀濃縮藥液至含生藥量1 g/mL，4 ℃冰箱保存備用。

1.3 實驗試劑 DMEM培養基（美國HyClone公司，批號：PYG0072）；脂多糖（中國Biosharp公司，批號：BS904）；胎牛血清（澳洲ExCell Bio公司，批號：11G362）；兔白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）ELISA試劑盒，均購自江蘇酶免實業有限公司，批號分別MM-030501、MM-024001、MM-030201；Cell Counting Kit-8試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：AR1160-500）；NF-κB p65、核因子κB抑制因子α（IκBα）抗體，均購自北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs-0465R、bs-1287R；β-actin、Histone-H3內參抗體、增殖細胞核抗原（PCNA）抗體、HRP羊抗鼠IgG、HRP羊抗兔IgG，均購自美國Proteintech Group公司，批號：66009-1-Ig、17168-1-AP、10205-2-AP、SA00001-1、SA00001-2；BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（上海碧云天生物科技研究所，批號：AR0146、AR1112）；Simply P總RNA提取試劑盒（北京博邁斯科技發展有限公司，批號：BSC52S1）；核液抽提分離試劑盒（美國APExBIO公司，批號：K1137）。

1.4 實驗儀器 倒置相差顯微鏡（德國LEICA公司）；低速離心機（湖南湘儀儀器有限公司）；Countstar細胞計數儀（上海睿鈺生物科技有限公司）；低溫高速離心機（美國BECKMAN公司）；CO2培養箱（德國Herarus公司）；全自動酶聯免疫檢測儀（美國BIO-TEK公司）；化學發光成像系統（美國Bio-Rad公司）；-80℃超低溫冰箱（德國Eppendorf公司）。

2 實驗方法

2.1 含藥血清與空白血清的制備 12只新西蘭大白兔，采用隨機數字表法分為壯骨健膝方組和空白組，每組6只，結合前期研究并參照人與動物體質量換算等效劑量的方法［8］，壯骨健膝方組按4.58 mL/（kg·d）灌胃，空白組給予等劑量生理鹽水灌胃，持續3 d。于末次灌胃1 h后，20%烏拉坦（5 mL/kg）腹腔注射麻醉成功后行腹主動脈采血。全血靜置4 h后，2 500 r/min離心30 min，分離血清并在56 ℃水浴滅活30 min，用0.22 μm無菌過濾器過濾，-20 ℃冰箱保存備用。

2.2 細胞培養 將兔滑膜成纖維細胞常規培養于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中，每2 d更換1次培養液。取對數生長期的細胞用于后續實驗。

2.3 兔滑膜成纖維細胞炎癥模型的制備 取對數生長期的兔滑膜成纖維細胞，以1×105/mL的密度均勻接種到24孔板中，常規培養待其貼壁后隨機分為空白組與模型組，參考相關文獻［9］并結合前期預試驗，空白組給予完全養液繼續培養，模型組給予含1.0 μg/mL LPS的完全培養液培養，36 h后ELISA法檢測細胞上清液中IL-1β、TNF-α的含量變化，CCK-8法檢測細胞生存率變化。與空白組比較，模型組IL-1β、TNF-α含量顯著增加（P＜0.05），細胞生存率顯著升高（P＜0.05）。符合滑膜成纖維細胞炎癥狀態下分泌大量促炎因子及過度增殖的特性，見表1。

表1 脂多糖刺激滑膜成纖維細胞后IL-1β、TNF-α含量及細胞生存率比較（）

表1 脂多糖刺激滑膜成纖維細胞后IL-1β、TNF-α含量及細胞生存率比較（）

注：與空白組比較，1） P＜0.05。

細胞生存率/%100.00±2.11 115.58±5.061）組別空白組模型組n3 3 IL-1β/（pg/mL）43.19±2.40 302.37±9.911）TNF-α/（pg/mL）56.93±3.29 446.59±9.151）

2.4 篩選壯骨健膝方含藥血清干預炎癥模型的最佳濃度和時間 滑膜成纖維細胞炎癥模型的制備方法同2.3，炎癥模型制備成功后隨機分為0%、5%、10%、20%壯骨健膝方含藥血清組，每個濃度3個復孔，給予對應濃度的含藥血清分別干預12 h、24 h、48 h后，采用CCK-8法檢測細胞生存率。選擇細胞生存率接近50%的藥物濃度和干預時間做為后續實驗的最佳干預條件［10］。根據實驗結果，選擇細胞相對生存率接近50%的濃度為10%，時間為48 h作為后續實驗的干預條件，見表2。

表2 不同濃度壯骨健膝方含藥血清干預模型不同時間后細胞生存率比較（）

表2 不同濃度壯骨健膝方含藥血清干預模型不同時間后細胞生存率比較（）

注：與0%組同時間點比較，1） P＜0.05。

干預48 h 100.00±1.29 72.29±3.361）51.25±2.971）36.19±3.271）組別0%組5%組10%組20%組n3 3 3 3干預12 h 100.00±1.23 96.52±2.02 85.70±3.211）72.21±3.191）干預24 h 100.00±1.17 86.92±1.621）66.65±2.431）57.81±2.011）

2.5 分組及干預 取對數生長期的兔FLS，隨機分為空白組、造模組，造模組按照“2.3”實驗得出的最佳條件復制炎癥模型后隨機分為模型組與壯骨健膝方組，分別給予空白血清、空白血清、10%壯骨健膝方含藥血清干預48 h，干預結束后收集各組細胞及細胞上清液進行相關檢測。以下實驗均進行3次生物學重復。

2.6 各組細胞上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6含量檢測 收集各組細胞培養液，離心20 min（3 000 r/min）后，獲取上清液，按照ELISA試劑盒說明書嚴格操作，通過全自動酶聯免疫檢測儀獲得450 nm處吸光度值，根據標準品吸光度值繪制標準曲線后，根據曲線公式計算各組IL-1β、TNF-α、IL-6含量。

2.7 各組細胞IL-1β、TNF-α、IL-6、PCNA、IκBα、NF-κB p65 mRNA相對表達水平檢測 采用qPCR法檢測。收集各組細胞，采用柱式法提取各組細胞總RNA并進行濃度測量，根據逆轉錄酶HiScript Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）說明書依次進行配制逆轉錄體系、去除樣本中殘留的DNA、逆轉錄反應合成cDNA，對cDNA進行相同比例稀釋后取2 μL加入到ChamQ SYBR qPCR Msater Mix反應體系中進行qPCR檢測，以變性95 ℃ 30 s、退火95 ℃ 10 s、延伸60 ℃ 30 s，40個循環為運行條件，獲得各基因的CT值后，采用2-△△CT法計算各基因相對表達量。基因引物序列由福建尚亞生物工程有限公司合成，詳見表3。

表3 引物序列

2.8 各組細胞中PCNA、IκBα及核內NF-κB p65蛋白表達的檢測 收集各組細胞，提取細胞總蛋白，BCA法蛋白定量。經SDS-PAGE凝膠電泳后用濕轉法將蛋白轉至PVDF膜上，室溫封閉1小時，一抗（PCNA、IκBα、NF-κB p65稀釋比例均為1∶2 000）4 ℃環境下孵育過夜，PBST洗滌3次，每次10 min；二抗（HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG稀釋比例均為1∶5 000）室溫條件下孵育1小時，PBST洗滌3次，每次10 min。采用ECL化學發光法進行顯影成像后，采用Image J軟件對膠片條帶的灰度值進行計算分析。

2.9 統計方法 利用SPSS 25.0統計軟件分析數據。計量資料符合正態分布以（）表示，2組間比較采用配對樣本t檢驗，多組間兩兩比較采用單因素方差分析；計量資料不符合正態分布者，組間比較采用秩和檢驗，以上統計方法均采用雙側檢驗。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 3組細胞上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6含量比較 與空白組比較，模型組IL-1β、TNF-α、IL-6含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，壯骨健膝方組IL-1β、TNF-α、IL-6含量顯著降低（P＜0.05）。見表4。

表4 3組細胞上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6含量比較（）pg/mL

表4 3組細胞上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6含量比較（）pg/mL

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

IL-6 27.50±1.08 192.37±8.221）107.61±6.092）組別空白組模型組壯骨健膝方組n3 3 3 IL-1β 43.15±1.67 309.63±9.261）179.56±6.932）TNF-α 76.01±1.97 464.78±22.761）259.54±10.992）

3.2 3組細胞中IL-1β、TNF-α、IL-6、PCNA mRNA相對表達水平比較 與空白組比較，模型組IL-1β、TNF-α、IL-6、PCNA mRNA相對表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，壯骨健膝方組IL-1β、TNF-α、IL-6、PCNA mRNA相對表達水平顯著降低（P＜0.05）。見表5。

表5 3組細胞IL-1β、TNF-α、IL-6、PCNA mRNA相對表達水平比較（，n＝3）

表5 3組細胞IL-1β、TNF-α、IL-6、PCNA mRNA相對表達水平比較（，n＝3）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

PCNA 1.02±0.26 2.65±0.311）1.75±0.152）組別空白組模型組壯骨健膝方組n3 3 3 IL-1β 1.01±0.12 5.16±0.661）2.03±0.312）TNF-α 1.01±0.13 8.91±1.901）4.12±0.432）IL-6 1.00±0.09 4.53±0.481）1.89±0.412）

3.5 3組細胞IκBα、NF-κB p65 mRNA相對表達水平比較 與空白組比較，模型組NF-κB p65 mRNA表達顯著升高（P＜0.05），IκBα mRNA表達顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，壯骨健膝方組NF-κB p65 mRNA相對表達水平顯著降低（P＜0.05），IκBα mRNA表達顯著升高（P＜0.05）。見表6。

表6 3組細胞IκBα、NF-κB p65 mRNA相對表達水平比較（）

表6 3組細胞IκBα、NF-κB p65 mRNA相對表達水平比較（）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

NF-κB p65 1.01±0.14 2.81±0.341）1.85±0.492）組別空白組模型組壯骨健膝方組IκBα 1.02±0.23 0.28±0.041）0.62±0.142）

3.6 3組細胞中PCNA、IκBα、核內NF-κB p65蛋白表達量比較 與空白組比較，模型組PCNA及核內NF-κB p65蛋白表達顯著升高（P＜0.05），IκBα蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，壯骨健膝方組核內PCNA及NF-κB p65蛋白表達顯著降低（P＜0.05），IκBα蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。見圖1、表7。

圖1 3組細胞中PCNA、IκBα、核內NF-κB p65蛋白條帶圖

表7 3組細胞中PCNA、IκBα、核內NF-κB p65蛋白表達量比較（）

表7 3組細胞中PCNA、IκBα、核內NF-κB p65蛋白表達量比較（）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別空白組模型組壯骨健膝方組NF-κB p65/Histone-H3 0.39±0.01 0.87±0.021）0.70±0.022）PCNA/β-actin 0.49±0.02 1.06±0.041）0.75±0.032）IκBα/β-actin 0.76±0.04 0.37±0.021）0.68±0.022）

4 討 論

中醫認為KOA的核心病因病機為肝腎虧虛、風寒濕邪侵襲，證屬本虛標實，病理及臨床表現上均存在痹痿兩面，其中滑膜炎癥、膝關節疼痛、腫脹等屬痹證范疇，關節軟骨退化、膝周肌肉萎縮無力等屬痿證范疇，具有“痹痿并見”“痹痿同病”特點，并且痹痿可相互影響，導致KOA病情反復，遷延難愈［11］，治療上當“痹痿并重”“除痹起痿”［12］。壯骨健膝方是課題組經多年臨床實踐和基礎研究，總結出契合KOA“痹痿并見”“痹痿同病”特點的效驗方，方中諸藥配合，達到痹痿共治、除痹起痿之功效。課題組前期研究表明［13］，該方能夠降低退變軟骨細胞中p38MAPK磷酸化水平，抑制信號通路的激活，減少下游效應產物MMP-13、IL-1β、TNF-α 等細胞因子的表達，延緩軟骨退化，從“起痿”的角度闡釋了該方對KOA的治療作用。滑膜炎癥存在于KOA病程的所有階段［14］，已經成為KOA發病發展的獨立危險因素［15］，課題組前期通過體內實驗［7］已證實壯骨健膝方可以減輕兔膝骨關節炎滑膜炎癥模型中炎癥因子的分泌，改善滑膜組織炎癥；本研究制備兔FLS炎癥模型，進一步闡明壯骨健膝方“除痹”的功效及其部分機制。

LPS可引發哺乳動物細胞的免疫反應，廣泛用于炎癥模型的建立［16］。FLS在體外可被LPS誘導為炎癥模型并表現為過度增殖的特性［17］，本研究中，兔FLS經LPS刺激后分泌的炎癥因子IL-1β、TNF-α顯著增多，增殖能力顯著增強，符合滑膜成纖維細胞的炎癥特點。造模后模型組細胞各炎癥因子含量及mRNA表達顯著提高；細胞相對生存率、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA） mRNA及蛋白表達顯著增高，細胞過度增殖；而通過壯骨健膝方含藥血清干預可減輕兔FLS炎癥反應并抑制其過度增殖，在細胞水平上進一步證實了該方可減輕滑膜炎癥，發揮“除痹”功效。

關于壯骨健膝方減輕兔FLS炎癥的作用機制，本研究亦進行了初步探討。NF-kB信號通路主要參與炎癥反應、增殖、凋亡等，當細胞受到外界刺激時，IκBα磷酸化并進一步泛素化后被降解，導致NF-κB活化并向細胞核內移位，轉錄IL-1β、TNF-α等下游產物，誘發炎癥反應［18］。本研究結果顯示，模型組IκBα蛋白及mRNA表達顯著降低，核內NF-kB p65蛋白及NF-kB p65 mRNA表達顯著升高，并且伴隨著下游指標IL-1β、TNF-α、IL-6含量及mRNA表達的升高，提示NF-κB信號通路處于激活狀態。而壯骨健膝方組IκBα蛋白及mRNA表達顯著升高，核內NF-kB p65蛋白及NF-kB p65 mRNA表達顯著降低，并且伴隨著下游指標IL-1β、TNF-α、IL-6含量及mRNA表達的降低，同時PCNA蛋白及mRNA表達也顯著降低。以上結果提示，壯骨健膝方對兔FLS炎癥模型“除痹”的作用機制可能與抑制NF-kB信號通路激活有關。這與我們前期在組織水平上研究的結果相同［19］，進一步印證了壯骨健膝方防治KOA滑膜炎癥的作用機制與抑制NF-kB信號通路激活有關。

綜上所述，本研究結果表明，壯骨健膝方含藥血清可有效降低炎癥FLS IL-1β、TNF-α等促炎因子表達并抑制其細胞過度增殖，發揮“除痹”功效，其作用機制可能與抑制NF-kB信號通路激活有關，從細胞水平上進一步闡明了該方對KOA滑膜炎癥的干預效應及部分療效機制。NF-kB信號通路與細胞凋亡亦存在一定的關系，但在本研究中尚未進行相關的探討，這將成為課題組今后研究的內容之一。