基于表型性狀和SSR標記的江西地方山藥種質遺傳多樣性分析

辛佳佳，湯 潔，張 洋，涂玉琴，戴興臨，張南峰，谷德平

（江西省農業科學院 作物研究所，江西 南昌 330200）

山藥(Dioscorea polystachyaTurcz.)又名薯蕷，為薯蕷科薯蕷屬1年或多年生草質藤本作物［1-3］，其地下莖塊含豐富的淀粉、可溶性糖及蛋白質等營養成分，口感獨特而深受很多消費者的喜愛，同時還具有健脾養胃、補氣益腎等功效，是生活中常見的藥、食兩用植物資源［4］。隨著人們生活水平的提高和對食品安全、營養的重視，消費者對山藥產品的需求量逐漸增大，由此對山藥的研究報道也日益增加。

江西是我國山藥的主要產區之一，江西山藥品種的品質優良，在國內外都享有盛譽。在江西省生產上推廣應用的多為地方品種，隨著農業種植結構的調整和育成品種的示范推廣，民間蘊藏的極其豐富的山藥地方品種資源面臨著快速丟失的風險，導致其遺傳背景變得越來越狹窄。山藥長期的無性繁殖和種植戶自留種導致品種混雜、退化嚴重且地方品種多樣以及各品種之間的親緣關系不清［5］。因此，開展山藥種質資源搶救性收集、鑒定、評價和分析，對山藥新品種的選育和山藥產業的發展具有重要意義［6-7］。本研究基于31個表型性狀和11個SSR分子標記，對江西地方山藥種質資源進行了遺傳多樣性分析，以期為江西山藥種質保存、品種鑒定、資源改良及拓寬山藥育種遺傳基礎等提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗選用的山藥種質資源為“第三次全國農作物種質資源普調查與收集行動”項目中收集得到，主要是江西省所屬市(縣)的各地方農家種質資源，共計77份(表1)，其中腳板薯71份，泰和竹篙薯、廣豐鐵棍山藥、樂安土淮山、南城山藥、瑞昌山藥、永豐山藥各1份。

表1 品種名稱及其來源

1.2 試驗方法

1.2.1 表型性狀的測定 山藥種質采用常規栽培管理，田間性狀記載按《山藥種質資源描述規范和數據標準》［8］進行，對蔓盤繞習性、蔓數、莖粗、單株葉數、葉形、葉長、葉寬、葉厚、葉柄長、塊莖類型、塊莖表皮色、塊莖肉色、莖長、莖寬、單株產量等31個表型性狀進行測量和統計，每份材料選取5株山藥進行性狀調查，其中數量性狀取其平均值［9］。

質量性狀賦值情況，蔓盤繞習性：1=逆時針，2=順時針；葉密度：1=低，2=中，3=高；葉型：1=單葉，2=復葉；葉形：1=卵形，2=心形，3=劍形，4=戟形；葉耳間距：1=小，2=大；葉柄茸毛：1=無，2=有；卷須：1=無，2=有；葉翻卷：1=無，2=有；零余子：1=無，2=有；塊莖類型：1=塊狀，2=根狀；塊莖緊密度：1=疏散獨立，2=緊密獨立，3=不獨立；塊莖形狀：6=腳狀，7=不規則，3=長卵；塊莖分枝：1=分枝，0=不分枝；塊莖根毛密度：1=少，2=多，3=中；塊莖根毛分布：1=底部，3=上部，4=全部；塊莖表皮褶皺：0=光滑，1=少皺，2=多皺；塊莖表皮色：1=淺褐色，2=褐色，3=紫色；塊莖肉色：1=乳白色，2=黃白色，3=淺紫色，4=紫色，5=紫白，6=紅白；球莖有無：1=無，2=有。按上述賦值標準將數據記錄在Excel表格中，利用SPSS 19.0軟件計算各性狀的平均值、標準差、變異系數、提取主成分及相關性數據。

1.2.2 基因組DNA的提取與SSR引物的擴增 采用CTAB法提取山藥基因組DNA［10］，用紫外分光核酸測定儀檢測所提取的DNA濃度與純度，將濃度統一稀釋到50 ng/μL，置于-20 ℃冰箱中保存備用。從22對引物中篩選到11對條帶清晰、穩定性好的引物(表2)，SY18參考Nemorin等［11］的文獻記載，YM13、Da3G04、Dab2E07、Da1C12、Dpr3D06參考郭文等［12］的文獻記載，SSR-1、SSR-17、SSR-41、SSR-53、SSR-92參考張文芳［13］的文獻記載。PCR擴增總體積為10 μL，其中 2×Taq Mastermix 5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、模板1 μL、ddH2O 3 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，最佳溫度退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min，于4 ℃下保存。PCR擴增產物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測，染色采用銀染法［14］。選擇條帶清晰的PCR條帶，人工讀帶，記錄在Excel表格中，無條帶記為“0”，有條帶記為“1”，采用NTSYS 2.1軟件分析了77個供試山藥品種間的遺傳相似性系數，利用UPGMA法［15］進行聚類分析，并用SHAN程序繪制樹狀圖。

表2 SSR引物序列

2 結果與分析

2.1 山藥種質資源表型性狀的遺傳多樣性分析

2.1.1 山藥種質資源表型的變異性和多樣性指數分析 由表3、表4可知，供試山藥種質資源的莖粗、葉長、葉寬、葉柄長、塊莖長、單株產量的遺傳多樣性指數均較大，其中塊莖寬的多樣性指數最大，為2.04，塊莖緊密度的多樣性指數最低，為0.20。單株葉數的變異系數最大，為64.76%，其次是蔓數，變異系數為62.81%，莖粗的變異系數最小，為24.67%，這表明供試的77份山藥種質資源擁有豐富的遺傳多樣性，具有很高的挖掘潛力。

表3 77份山藥種質資源數量性狀的多樣性分析

表4 77份山藥種質資源質量性狀的描述及多樣性指數

2.1.2 山藥種質資源主要表型性狀的相關性分析 通過對江西地方山藥種質資源的31個表型性狀間的相關性分析可知：山藥的單株產量與節間長、葉長、葉寬、塊莖長、塊莖寬呈極顯著正相關，與葉厚、葉柄長呈顯著正相關；塊莖寬與節間長、葉長、葉寬、葉柄長呈極顯著正相關，與莖粗、葉厚、塊莖長呈正相關，但相關性不顯著；塊莖長與節間長、莖粗、葉長、葉厚、葉柄長、塊莖寬呈正相關，與葉寬呈負相關，但相關性均不顯著；葉柄長與節間長、葉長、葉寬呈極顯著正相關，與莖粗呈顯著正相關，與葉厚呈負相關，但相關性不顯著；葉厚與節間長、莖粗、葉寬呈負相關，與葉長呈正相關，但相關性均不顯著；葉寬與節間長、葉長呈極顯著正相關，與莖粗呈顯著正相關；葉長與節間長、莖粗呈極顯著正相關；單株葉數與節間長、莖粗呈正相關，但相關性不顯著；節間長與莖粗呈極顯著正相關(表5)。由此可知，山藥葉片大且密、塊莖寬和塊莖長較大的品種對產量影響很大。

表5 山藥數量性狀間的相關系數

2.1.3 山藥種質資源表型性狀的聚類分析 山藥種質資源的31個表型性狀的聚類結果顯示：在歐式距離=15處，77份山藥種質資源被分為三大類群：類群Ⅰ包含63份材料，類群Ⅱ包含7份材料，類群Ⅲ包含7份材料。類群Ⅰ的特征是葉密度較低、葉片及塊莖偏小、單株產量偏低；類群Ⅱ的特征是葉密度高，平均單株葉數高達872；類群Ⅲ的特征是葉密度適中、葉片及塊莖大，單株產量高(表6、圖1)。總體來看，類群Ⅰ可選出適合密植的小塊莖材料；類群Ⅱ可選出高葉密度材料；類群Ⅲ中可選出大塊莖的高產材料。

圖1 基于表型性狀的聚類樹狀圖

表6 各類群主要質量性狀的平均值

2.2 山藥種質資源的SSR遺傳多樣性分析

2.2.1 SSR多態性分析 利用篩選的11對SSR引物對77份山藥種質資源的DNA進行PCR擴增，結果顯示：11對引物共擴增到113條清晰、可識別的條帶，其中多態性條帶93條，多態性占82.3%，每對引物擴增9～12個條帶，擴增產物的片段范圍大多集中在200～600 bp之間。Shannon’s I指數在0.094～0.489之間(表7)。總體上看，11對SSR引物的多態性較好，可用于供試材料的遺傳多樣性分析。

表7 11對SSR引物擴增的結果分析

2.2.2 SSR標記的聚類分析 在NTSYS軟件中計算樣品間的遺傳相似性系數，并對 77份江西山藥種質資源進行 UPGMA 聚類分析，結果顯示(圖2)：77份山藥種質遺傳相似性系數在0.398～1.000之間，其中，27與75的遺傳相似性系數最小，為0.398，說明這2份種質資源的親緣關系最遠，1與13、50與52分別為同一品種，它們的遺傳相似性系數為1，而6、7、35、43、59、61之間；3、37、45、53、55、67之間；4與56之間；8、22、29、30、49、52、57之間；28、58、69、76，34、36、38之間的相似性系數均為1，這可能是江西地方長期相互引種，或者地方種名稱多樣化導致的。

圖2 基于SSR標記的聚類樹狀圖

由圖2可知，在相似性系數=0.5時，77份山藥種質資源可以分為兩大類群：類群Ⅰ包括71份材料，均為腳板薯；類群Ⅱ包括6份材料，分別為泰和竹篙薯、廣豐鐵棍山藥、樂安土淮山、南城山藥、瑞昌山藥、永豐山藥。其中廣豐鐵棍山藥與樂安土淮山的遺傳相似性系數最大，高達0.95，說明兩者的親緣關系很近。

3 小結與討論

現代育種離不開豐富的種質資源，而地方品種經過長時間特定環境及農戶的定向選擇［16］，留下了很多優異品種。江西省擁有較為豐富的山藥種質資源，收集這些品種資源并分析品種間的遺傳特性，有利于充分利用這些品種資源進行遺傳改良以滿足不同育種目標的需求。此外，江西地方長期相互引種且地方種名稱多樣，導致市場上存在同物異名或同名異物的混亂現象［17］。因此，分析山藥遺傳多樣性對山藥引種改良、品種鑒定和生產加工等均具有重要意義［18］。

本研究對江西地方山藥種質資源進行表型聚類分析，結果顯示，77份材料可以分為三大類群，其中，類群Ⅲ的特點是葉大莖粗、葉密度適中、單株產量最高。相關性分析表明，單株產量與節間長、葉長、葉寬、塊莖長、塊莖寬呈極顯著正相關。由此可推測，山藥葉片的大小可能影響山藥塊莖的大小，進而影響其產量。因此，在選育高產山藥品種的過程中，應關注對山藥葉片和塊莖大小的選育。

分子標記揭示的是材料間的內在遺傳特性，其結果不受環境的影響，使得材料間的遺傳關系能夠被較好地反映出來［12］。本研究利用11對SSR引物對77份江西地方山藥種質資源進行遺傳多樣性分析，得到其多態性為82.3%。聚類分析結果顯示：圓柱形長棍山藥單獨聚為一個類群；另一大類群腳板薯的相似性系數均為1［17］?？傮w而言，江西地方山藥種質資源的遺傳多樣性較為豐富，而江西地方腳板薯親緣關系整體較近，遺傳背景較為狹窄。

從前人的研究結果來看，基于表型性狀的統計結果與基于分子標記的聚類分析結果不一致的情況在許多作物中均存在 ，如在辣椒［19］、梅花［20］、紅三葉［21］、藜麥［22］和甘薯［23］等中均被報道過。這可能是分子標記結果反映的是基因組整體的相似情況，而植物的表型性狀受控于個別基因且易受環境的影響，從而導致表型性狀聚類與分子標記聚類結果存在偏差。