小粒野生稻內生細菌的分離鑒定和促生功能分析

楊立凡 田青霖 龔禹瑞 李臻園 李慶懋 李沁妍 黃立鈺 胡鳳益 秦世雯

（云南大學農學院/農業農村部多年生稻生物學與種質創新重點實驗室，昆明650091；#共同第一作者；*通訊作者：shiwenqin@ynu.edu.cn）

小粒野生稻（Oryza minuta）是四倍體（BBCC 基因組）、多年生的野生稻種質資源，適應性強且具有良好的稻瘟病、白葉枯病、紋枯病和稻飛虱抗性[1]。目前，研究人員已從小粒野生稻中挖掘出多個可用于栽培稻遺傳改良的抗性、產量和品質相關優異基因[2]。研究還發現，小粒野生稻比栽培稻具有更為豐富的內生細菌多樣性[3]。說明小粒野生稻的遺傳基礎和微生態對其環境和脅迫適應性起到重要作用。

植物內生菌是一類定殖于植物體內的微生物資源，對植物的生長發育具有重要影響[4]。植物內生細菌通過固氮、溶磷、解鉀、分泌植物生長激素、鐵載體、ACC 脫氨酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid deaminase）、抗生素或激發子等來提高植物營養吸收、促進生長、抑制病原菌和誘導植物系統性抗性[5-9]。此外，研究表明，將干旱、寒冷、高溫、鹽堿和污染等環境下生長的植物進行內生細菌分離，回接到寄主或非寄主植物中，可以顯著提高植物在逆境條件下的生長[10-14]。因此，植物內生細菌在植物保護、綠色可持續農業發展、生態環境修復等領域具有重要的研究意義和應用開發前景。內生細菌作為小粒野生稻微生態系統的重要組成部分，對其挖掘和功能研究尚少。

多年生稻是種植一次可以連續收獲多年（季）的新型稻作品種[15]。相對于一年生水稻，多年生稻從第2 季起，在稻作生產過程中不再需要買種、育秧、犁田、耙田、移栽等生產環節，而只需要田間管理和收獲2 個生產環節，節約了人工投入、降低了勞動強度。多年生稻進行連續生產需采取合適的施肥手段才能保證良好的土壤結構以保障其生長發育。綠色、友好、無殘留的微生物菌肥可滿足多年生稻綠色輕簡化的生產模式，提高多年生稻抗病蟲能力、避免土壤結構惡化和環境污染。因此，本研究分離小粒野生稻的內生細菌，挖掘具有對多年生稻促生能力的細菌資源，為小粒野生稻微生態功能研究和多年生稻微生物菌肥開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小粒野生稻（Oryza minuta）、多年生稻秈稻品種云大107 和粳稻品種PR23 均由農業農村部多年生稻生物學與種質創新重點實驗室提供。

1.2 內生細菌的分離純化

分別剪取小粒野生稻健康的根、莖和葉組織，無菌水沖洗表面污漬。組織表面消毒采用75%酒精浸泡2～5 min，無菌水漂洗1 次，2.5%次氯酸鈉浸泡2～4 min，無菌水漂洗3 次。組織研磨后，將研磨液進行梯度稀釋（10-2～10-5），取100 μL 稀釋液涂布于NA 培養基[16]。吸取第3 次漂洗液涂布至NA 培養基，用來檢測組織表面消毒是否徹底。28 ℃黑暗倒置培養1～3 d，待細菌菌落長出，挑取形態不同的細菌菌落進行純化和保存。

1.3 內生菌促生功能測定

1.3.1 溶磷能力測定

在無機磷培養基[17]和有機磷培養基[18]上放置滅菌濾紙片，每個濾紙片上接種5 μL 菌液（OD600nm=1.0），以接種5 μL 的NB 培養液作為對照，28 ℃倒置培養2～3 d后觀察是否形成透明圈。根據透明圈直徑和菌落圈直徑的比值（mP值）評估菌株的溶磷能力。

1.3.2 固氮作用檢測

采取劃線法，在Ashby 培養基[19]上接種內生細菌，以NB 培養液作為對照，28 ℃倒置培養2～3 d，將能夠穩定生長的菌株視為固氮菌。利用引物ZehrF（5’-TGYGAYCCNAARGCNGA-3’）和ZehrR（5’-NDGCCATCATYTCNCC-3’）對菌株的固氮酶基因nifH 進行PCR 擴增，PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后測序。

1.3.3 產鐵載體能力測定

在鉻天青（CAS）培養基[20]上放置滅菌濾紙片，每個濾紙片上接種5 μL 菌液（OD600nm=1.0），以接種5 μL 的NB 培養液作為對照，28 ℃倒置培養2～3 d 后觀察是否有橙黃色變色圈，根據變色圈直徑和菌落圈直徑的比值（mP值）評估菌株的產鐵載體能力。

1.3.4 產吲哚乙酸能力測定

定性分析采用比色法[21]，將菌株接種至King B 培養基[22]中，28 ℃、120 r/min 振蕩培養2 d。吸取等體積菌懸液和Salkowski’s 試劑[23]于白色點滴板上，陽性對照為50 mg/L 吲哚乙酸（indole-3-acetic acid, IAA），陰性對照為King B 培養基。避光30 min 后觀察其顏色變化，呈現粉紅色說明菌株能產生IAA。

IAA 定量測定：配制濃度為10～60 mg/L 的IAA 標準品溶液，分別與Salkowski’s 試劑等體積混合，25 ℃避光反應30 min，測定OD530nm值，繪制標準曲線。將上述定性測定中具有產IAA 功能的菌株接種于King B培養基中，設置3 個重復，37 ℃、200 r/min 振蕩培養48 h后，10 000 r/min 離心。取上清液與Salkowski’s 顯色劑等體積混合，25 ℃避光反應30 min，測定OD530nm值。King B 培養基與Salkowski’s 試劑等體積混合為空白對照。根據IAA 標準曲線方程y=0.0195x-0.0129，R2=0.9953 計算菌株的IAA 產量。

1.4 菌株的形態學觀察和分子鑒定

將菌株在NA 平板上37 ℃培養24 h 后觀察單菌落形態特征。菌株在NB 培養基中，37 ℃、200 rpm 振蕩培養16～24 h 后進行革蘭氏染色和菌體形態特征觀察。利用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取菌株DNA后，進行16S rRNA 序列（引物序列為：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）和gyrB 基因（引物序列為5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3’和5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3’）的PCR 擴增。PCR 產物測序后在NCBI 數據庫進行Blastn 比對。利用MEGA 11 軟件的最大似然法（Maximum Likelihood），與NCBI 中相似性高的菌株構建16S rRNA 與gyrB 串聯拼接序列的系統發育樹，Bootstrap 值為1000。

1.5 促生效果測定

選取健康一致的多年生稻品種PR23 和云大107種子，用75%酒精洗2 次，每次5 min，15%次氯酸鈉洗3 次，每次8 min 進行消毒。浸種處理：108cfu/mL 的菌株懸液浸泡種子12 h，對照以無菌水進行浸泡，然后催芽至露白，隨后播種于苗盤中，每穴9 粒種子，每個處理3 個重復。拌土處理：將30 mL 108cfu/mL 的菌株懸液與500 g 滅菌土中混合均勻，放置于苗盆中，將催芽至露白的種子播種于苗盤中，每穴9 粒種子，每個處理3 個重復。待多年生稻長至4 葉期時測量其株高、根長、鮮質量、葉綠素和氮素含量。

1.6 數據處理

利用SPSS 17 軟件對數據進行統計分析，以單因素方差分析和Duncan’s 法檢驗數據差異顯著性，利用Graphpad Prism 8.0 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 小粒野生稻內生細菌的分離和純化

通過組織分離法和菌種純化，從小粒野生稻的根、莖和葉部中分別獲得40、20 和25 株內生細菌菌株，共計85 株。根部分離獲得的內生細菌數量多于葉部和根部，這可能是由于土壤根際效應使得根部相較于其他組織內生細菌的種類和數量較多。

2.2 內生細菌的溶磷能力

具有溶磷效果的內生細菌可以將無機磷和有機磷培養基中難溶性磷轉變為可溶性磷，使得菌落周圍出現明顯的透明圈（圖1A 和1D）。本研究獲得21 株具有溶解無機磷能力的細菌菌株，mp值在1.10～1.73 范圍（圖1B），22 株具有溶解有機磷能力的細菌菌株（圖1E），mp值在1.10～2.05 范圍。統計分析顯示，莖部分離到的內生細菌溶解無機磷能力高于其他組織的內生細菌（圖1C）。

圖1 具有溶磷能力的內生細菌數量及其mp 值

2.3 內生細菌的固氮作用

利用Ashby 固氮培養基對內生細菌進行培養，共有19 個內生細菌菌株可穩定生長（圖2A 和2B），說明其具有固氮功能。通過固氮酶基因nifH 的PCR 擴增和測序分析發現，其中15 個菌株具有固氮酶基因nifH（圖2C），說明這15 個菌株可以通過nifH 基因進行固氮作用，而未擴增出nifH 基因的4 個菌株可能通過其他機制進行固氮。

圖2 具有固氮作用的內生細菌數量及其固氮酶基因nifH 的擴增

2.4 內生細菌的產鐵載體能力

利用藍色的鉻天青培養基（CAS）對內生細菌進行培養，29 株的內生細菌周圍呈現明顯的橙黃色變色圈（圖3A 和3B），mp值在1.09～4.57 范圍（圖3C），說明其具有產鐵載體的能力。統計比較顯示根、莖和葉部分離的內生細菌的產鐵載體mp值無顯著差異（圖3C）。

圖3 產鐵載體內生細菌的數量及其mP 值

2.5 內生細菌產吲哚乙酸能力

利用IAA 顯色反應發現，共有13 株內生細菌在30 min 后使反應液呈現粉紅色（圖4 A 和4 B），說明其具有產IAA 功能。通過定量測定，13 株內生細菌的IAA 分泌量在0.12～17.22 mg/L 范圍（圖4 C）。其中分離自根部的OMR2-3 菌株和分離自葉部的OML3-4 菌株IAA 分泌量顯著高于其他菌株，分別為17.22 mg/L 和16.59 mg/L，說明其具有較高的IAA 分泌能力。

圖4 小粒野生稻中產吲哚乙酸菌株的數量及產量

2.6 OMR2-3 和OML3-4 菌株的鑒定

選取高產IAA、鐵載體和固氮的OMR2-3 菌株和高產IAA、溶磷和固氮的OML3-4 菌株進行形態學和分子鑒定。結果發現，OMR2-3 菌株屬于革蘭氏陰性細菌，桿狀，菌體大小為（0.8～1.0）μm×（2.0～3.0）μm（圖5 A）；在NA 培養基上單菌落為淡黃色，圓形，無凸起，表面光滑，邊緣整齊，菌落大小為4～5 mm（圖5 B）；OMR2-3 菌株與陰溝腸桿菌ATCC 13047 菌株的16S rRNA 和gyrB 基因序列相似性最高，分別為98.11%和97.26%，并與陰溝腸桿菌134B5 菌株同處一個進化分支（圖5 C），鑒定為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）。OML3-4 菌株屬于革蘭氏陰性細菌，桿狀，菌體大小為（0.8～1.0）μm×（4.0～5.0）μm（圖6A）；在NA 培養基上單菌落為乳白色，圓形，無凸起，表面光滑，邊緣整齊，菌落大小為2.0～3.0 mm（圖6 B）。OMR3-4 菌株與路德維希腸桿菌WAB1946 菌株的16S rRNA 和gyrB 基因序列相似性最高，分別為99.58%和98.7%，并同處于一個進化分支（圖6 C），鑒定為路德維希腸桿菌（Enterobacter ludwigii）。

圖5 陰溝腸桿菌OMR2-3 菌株鑒定及進化系統發育樹

圖6 路德維希腸桿菌OML3-4 菌株鑒定及進化系統發育樹

2.7 OMR2-3 和OML3-4 菌株對多年生稻的促生效果

進行菌株浸種及拌土處理后，多年生稻栽種至4葉期時發現，OML3-4 和OMR2-3 菌株對多年生稻粳型品種PR23 和秈型品種云大107 均具有促生效果（圖7）。OMR2-3 菌株浸種處理可顯著提高PR23 的株高、根長、鮮物質量、葉綠素和氮素含量；而拌土處理對PR23 無明顯促生效果。OML3-4 菌株浸種處理可顯著提高PR23 的根長和葉綠素含量，拌土處理可顯著提高PR23 株高、根長、鮮物質量、葉綠素和氮素含量（表1）。OMR2-3 菌株浸種處理可顯著提高云大107 的鮮物質量、葉綠素和氮素含量，拌土處理可顯著提高云大107的根長、鮮物質量、葉綠素和氮素含量。OML3-4 菌株浸種和拌土處理均可顯著提高云大107 的根長、鮮物質量、葉綠素和氮素含量（表1）。以上結果說明，陰溝腸桿菌OMR2-3 菌株和路德維希腸桿菌OML3-4 菌株能夠促進多年生稻的細胞伸長、光合作用和生物量積累。

表1 陰溝腸桿菌OMR2-3 菌株和路德維希腸桿菌OML3-4 菌株對多年生稻PR23 和云大107 的促生效果

圖7 陰溝腸桿菌OMR2-3 菌株和路德維希腸桿菌OML3-4菌株對多年生稻的促生效果

3 結論與討論

內生菌是植物微生態的重要組成部分，遍布在植物組織內，與宿主形成緊密的互利共生關系。內生菌通過固氮作用、促進有機和無機營養（磷、鐵和鉀）的吸收、產生植物激素（吲哚乙酸、生長素、赤霉素等）等機制直接促進寄主的生長[24-27]。本研究從小粒野生稻中共篩選到具有溶磷能力內生細菌43 株，固氮內生細菌19 株，產鐵載體內生細菌29 株，產IAA 內生細菌13株，分別占總分離菌株數量的50.6%、22.3%、34.1%和15.3%。已有研究從澳洲野生稻[28]、尼瓦拉野生稻[29]、南方野生稻[22]、藥用野生稻[30]和普通野生稻[31]中篩選到具有以上促生功能的內生細菌。說明野生稻蘊含豐富的內生細菌資源，可作為微生物肥料和微生物菌劑開發的重要菌種篩選來源。

野生稻內生細菌能有效定殖于不同栽培稻和多年生稻品種，通過菌株特異性調控機理促進寄主生長。普通野生稻（O. rufipogon）內生無丙二酸檸檬酸桿菌（Citrobacter amalonaticus）具有固氮功能，顯著提高秈型水稻華航1 號株高和鮮物質量[32]。藥用野生稻（O. officinalis）內生細菌克雷伯菌（Klebsiella variicola）具有固氮、產IAA 和鐵載體能力，顯著提高水稻中嘉早17 號的分蘗數、株高和葉綠素含量[33]。本研究從小粒野生稻中篩選到具有固氮作用、產鐵載體和IAA 的陰溝腸桿菌OMR2-3 菌株，以及具有溶磷、固氮和產IAA 的路德維希腸桿菌OML3-4 菌株，其對多年生稻PR23 和云大107 的株高、根長、鮮物質量、葉綠素和氮素含量具有不同程度的促進作用。目前研究還發現，陰溝腸桿菌和路德維希腸桿菌分別對煙草[34]和小麥[35]也具有促生作用。因此深入研究野生稻內生細菌介導的促生效應，將有助于定向改善水稻對環境的適應性及其生產力，為水稻生物育種及增產提供新途徑。

植物種子內生菌群是建立植物內生菌群的基礎，種子內生菌群能夠隨著種子萌發轉移至幼苗，促進寄主生長發育[36]。本研究采用菌株浸種和拌土方法來構建多年生稻種子內生菌群，結果發現，OMR2-3 菌株拌土處理對多年生稻PR23 無顯著促生作用，可能是由于土壤微生物的稀釋效應[37]對OMR2-3 菌株的運動和定殖起到了負面影響。因此，針對不同菌株需采取適宜的接種方法，建立多年生稻生態菌肥的播種和田間管理措施，精準培育“多年生稻-微生物共生體”。本研究僅進行了2 株菌株的多年生稻促生效果評價，后續還需挖掘更多的多年生稻促生菌株，深入分析促生菌株的大田長期效應及對農業生態的影響，構建多年生稻“促生微生物組”，助力多年生稻綠色輕簡化生產。