基于線粒體COI序列的江淮下游湖泊鰱群體遺傳多樣性和遺傳結構分析

李大命，楊子萍，劉燕山，谷先坤，殷稼雯，蔡永久，唐晟凱，張彤晴

(1.江蘇省淡水水產研究所江蘇省內陸水域漁業資源重點實驗室，南京 210017；2.南京師范大學海洋科學與工程學院，南京 210023；3.中國科學院南京地理與湖泊研究所湖泊與環境國家重點實驗室，南京 210008)

鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)俗稱白鰱、鰱子，隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鰱亞科(Hypothalmichthyinae)鰱屬(Hypophthalmichthys)，廣泛分布于我國各大水系和湖泊[1]。鰱屬于濾食性魚類，主要攝食浮游植物，因而能夠有效抑制藍藻水華發生，改善水體環境質量，在水生態系統中具有重要的生態作用[2-3]。鰱也是我國重要淡水養殖對象之一，經濟效益可觀。多年來，受過度捕撈、環境污染、江湖阻隔等不利因素的影響，包括鰱在內的湖泊漁業資源衰退嚴重，個體低齡化、小型化趨勢日趨嚴重[4-5]。鰱屬于江湖洄游型魚類，無法在湖泊中自然繁殖。為增加湖泊漁業資源量，改善魚類群落結構，多年來開展了大規模的鰱增殖放流活動，這對于恢復湖泊鰱資源量起到重要作用，同時也會對鰱種質資源遺傳多樣性和遺傳結構造成較大影響[6-7]。因此，開展鰱資源遺傳多樣性的研究，一方面可以了解湖泊鰱遺傳資源現狀，另一方面有利于科學開展鰱增殖放流及種質資源保護。

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，同時也是物種進化的本質與保證。研究魚類的遺傳多樣性可以為漁業管理措施及物種保護策略的制定提供重要的數據支撐[8]。動物線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)是細胞核外具自主復制、轉錄和翻譯能力的遺傳因子，具有結構簡單、母系遺傳、不易發生基因重組且進化速度快等諸多特點，因此成為研究動物系統發育和群體遺傳學的理想分子標記[9]。其中，細胞色素氧化酶I亞基(cytochrome oxidase subunit I，COI)的結構和功能較為清楚，進化速率較快，且有通用引物便于擴增和測序，因此該基因被廣泛應用于水生動物尤其是魚類的遺傳多樣性和遺傳結構研究，研究結果為魚類資源管理和保護提供科學依據[10-12]。

目前有關鰱野生種質資源遺傳多樣性研究主要集中在長江干流[13-15]，而對于湖泊鰱群體的遺傳資源狀況尚缺乏認識。長江、淮河下游是我國湖泊集中分布區，也是魚類增殖放流的熱點水域，鰱是最常見增殖放流種類之一[16]。本研究選擇線粒體COI序列作為分子標記，探究長江下游流域湖泊(太湖、滆湖、長蕩湖和淀山湖)及淮河下游流域湖泊(高郵湖、洪澤湖、駱馬湖和金沙湖)鰱群體遺傳多樣性和遺傳結構，一方面可以了解鰱種質資源遺傳多樣性現狀，另一方面可為鰱增殖放流、資源保護提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

2020-2021年，在太湖(TH)、滆湖(GH)、長蕩湖(CDH)、淀山湖(DSH)、高郵湖(GYH)、洪澤湖(HZH)、駱馬湖(LMH)和金沙湖(JSH)共計8個湖泊采集鰱243尾，各湖泊鰱群體采樣水域及樣品數量如圖1和表1。取樣本尾鰭鰭條組織保存于無水乙醇中，置于4 ℃備用。

表1 鰱群體遺傳多樣性參數Tab.1 Genetic diversity parameters of eight H.molitrix populations

圖1 采樣水域及地理位置Fig.1 Sampling water area and its geographical location

1.2 DNA提取、PCR擴增和測序

采用TaKaRa公司試劑盒提取鰱基因組DNA，將DNA溶于超純水中。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，利用紫外分光光度計測定DNA濃度和質量。DNA溶液保存于-20 ℃備用。

PCR引物為FishF1(5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′)和FishR1(5′-TAG-ACTTCTG GGTGGCCAAAGAATCA-3′)[17]，COI基因片段長度約為655bp。PCR體系及條件參照文獻[12]進行。采用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測，將檢測合格的PCR產物送上海生工生物工程有限公司進行純化和雙向測序。

1.3 數據處理和分析

使用BioEdit 7.0軟件讀取測序序列，并進行人工校對和序列拼接。利用ClustalX 1.83軟件對序列進行多重比對，獲得長度一致性序列。使用MEGA 7.0 計算序列堿基組成、轉換/顛換比及群體間的Kimura雙參遺傳距離，并基于鄰接法構建單倍型分子發育樹。使用Network 10.2軟件構建單倍型網絡關系圖。利用DnaSP 6.0軟件統計序列變異位點、單倍型數目，計算單倍型多樣性指數、核苷酸多樣性指數及核苷酸差異數等遺傳多樣性參數。 采用Arlequin 3.5軟件進行分子方差分析(AMOVA)，計算群體間的分化指數(FST)。利用Tajima′s D及Fu′s Fs中性檢驗及核酸錯配分析評估群體歷史動態。

2 結果與分析

2.1 COI序列變異和遺傳多樣性

本研究獲得了243尾鰱的COI基因序列，長度為630 bp。COI序列中堿基A、T、C、G的含量分別為26.8%、29.6%、26.6%和17.0%，其中A+T的含量為56.44%，C+G的含量為43.56%，表現出明顯的堿基組成偏倚性。

COI序列檢測出23個多態性位點，其中簡約信息位點數22個，單變異位點1個，堿基轉換/顛換比為15.8(表1)。8個群體單倍型多樣性指數(Hd)為0.508～ 0.803，核苷酸多樣性指數(Pi)為0.002 41～ 0.006 94，平均核苷酸差異數為1.519～4.366，其中太湖群體的遺傳多樣性最高，長蕩湖群體的遺傳多樣性最低。整體來看，鰱群體的Hd和Pi分別為0.692和0.005 12，平均核苷酸差異數為3.224。

243尾鰱個體共定義14個單倍型(Hap1～Hap14)，包括13個共享單倍型和1個獨享單倍型。其中單倍型Hap1～Hap4是8個群體共享單倍型，占比分別為12.35%、8.64%、52.67%和4.53%。單倍型Hap3的數量最多，可能為祖先主體單倍型。5個單倍型(Hap7、Hap9～Hap11和Hap 14)為2個群體共享，2個單倍型(Hap5和Hap 6)被3個群體共享，1個單倍型(Hap12)被5個群體共享，1個單倍型(Hap13)被6個群體共享。1個單倍型(Hap8)為駱馬湖群體獨享(表2)。

表2 鰱COI基因單倍型分布Tab.2 COI gene haplotypes distribution in eight H.molitrix populations

2.2 群體遺傳結構

分子方差分析結果顯示(表3)，群體間遺傳變異占比為0.88%，群體內遺傳變異占比為99.12%，群體遺傳分化指數為0.008 83，說明遺傳變異主要來自于群體內個體間，群體間沒有顯著遺傳分化。根據湖泊所屬水系，將8個群體分為長江水系組群(太湖、滆湖、長蕩湖和淀山湖)和淮河水系組群(高郵湖、洪澤湖、駱馬湖和金沙湖)，進行分子方差分析，結果顯示組間遺傳變異占比為-0.12%，組內群體間遺傳變異占比為0.95%，群體內遺傳變異占比為99.17%，表明不同水系組間無顯著遺傳分化。

表3 鰱群體內和群體間的分子方差分析結果Tab.3 The results of analysis of molecular variance of H.molitrix populations

兩兩群體間遺傳分化指數表明(表4)，大部分群體間遺傳分化指數小于0.05，只有長蕩湖群體與太湖群體、駱馬湖群體和金沙湖群體之間有顯著的中度遺傳分化。兩兩群體間遺傳距離顯示(表4)，8個群體間的遺傳距離在0.002 98～0.006 70，其中太湖與駱馬湖群體之間的遺傳距離最大，長蕩湖與高郵湖群體之間的遺傳距離最小。長江流域的4個群體遺傳距離在0.003 38～0.005 76，其中滆湖與太湖群體間的遺傳距離最大，滆湖與長蕩湖群體間的遺傳距離最小；淮河流域的4個群體遺傳距離為0.004 13～0.006 6，其中駱馬湖與金沙湖群體間的遺傳距離最大，高郵湖與洪澤湖群體間的遺傳距離最小。

表4 鰱群體間的遺傳間距離(對角線下)和遺傳分化系數(對角線上)Tab.4 Genetic distance (below diagonal)and the Fst values (above diagonal)among H.molitrix populations

2.3 單倍型系統發育樹及網絡結構圖

以鳙(Aristichysnobilis)作為外類群，基于鄰接法構建鰱單倍型系統發育樹。結果顯示，14種單倍型形成2個譜系，其中譜系1由單倍型Hap1～Hap11組成，譜系2由單倍型Hap12～Hap14組成(圖2)。可以看出，湖泊群體的單倍型沒有聚為單系，而是分散在不同的譜系中，表明鰱群體尚未出現譜系分化，群體間存在廣泛的基因交流。單倍型最小網絡結構圖顯示，單倍型Hap1、Hap2、Hap3和Hap4是所有群體的共享單倍型，其中單倍型Hap3位于網絡結構圖中心，且數量最多，推測可能為祖先單倍型(圖3)。單倍型網絡結構圖與系統發育樹結果基本一致，單倍型Hap1～Hap11形成一個進化分支，單倍型Hap12～Hap14形成一個進化分支，分支內單倍型之間的突變步長數較小，而分支間單倍型突變步長數較大。

圖2 鰱14個單倍型的NJ分子系統樹Fig.2 The NJ phylogentic tree of 14 COI gene haplotypes of H.molitrix

圖3 鰱單倍型網絡結構圖Fig.3 Haplotype network structure of H.molitrix

2.4 群體歷史動態

采用Tajima′s D和Fu′s Fs中性檢驗及核苷酸錯配分布圖評估群體歷史動態。中性檢驗結果顯示(表5)，鰱群體的Tajima′s D值為-1.832 04～0.191 66，除長蕩湖群體外，其他群體的統計檢驗均不顯著；鰱群的Fu′s Fs值為-0.585 86～2.774 35，且統計檢驗均不顯著。將8個鰱群體作為一個整體進行分析，Tajima′s D值和Fu′s Fs值統計檢驗均不顯著，表明鰱群體沒有發生過顯著的擴張過程，符合中性進化。另外，核苷酸錯配分布圖呈現出多峰型(圖4)，也證實上述結論。

表5 鰱群體Tajima′s D和Fu′s Fs中性檢驗Tab.5 The Tajima′s D and Fu′s Fs neutrality tests of H.molitrix populations

圖4 鰱群體的歧點分布曲線Fig.4 Mismatch distribution curve of H.molitrix populations

3 討論

3.1 鰱群體遺傳多樣性

遺傳多樣性是指生物種內的遺傳變異度，其不僅是生物適應環境與進化的基礎，也是評價種群資源狀況的重要依據[18]。遺傳多樣性的高低決定了種群生存、繁衍和擴增潛力的大小，也反映物種或種群對外界環境因素變化適應能力的強弱。通常用單倍型多樣性指數(Hd)和核苷酸多樣性指數(Pi)評價群體遺傳多樣性，其值越大，表明群體的遺傳多樣性就越豐富[19]。本研究結果顯示，8個湖泊鰱群體的Hd為0.508～0.803，Pi為0.002 41～0.006 94，整個群體的Hd和Pi分別為0.692和0.005 12。已有研究結果顯示，長江上游8個群體的Hd和Pi為0.849和0.014 38[20]；長江中上游4個群體的Hd為0.693和0.902，Pi為0.007 48和0.015 57[13]；長江中上游6個群體的Hd和Pi為0.785和0.005 42[14]。丹江口水庫群體的Hd為0.617和0.676，Pi為0.002 38和0.003 36[21]。可以看出，湖庫鰱群體的遺傳多樣性明顯低于長江群體。這是因為湖庫中的鰱群體不能自然繁殖，其種群主要來源于人工增殖放流群體，由于增殖放流群體的親本數量較小，易受近親雜交和遺傳漂變的影響，導致放流群體的遺傳多樣性普遍低于野生群體[22，23]。因此，恢復江湖有效連通，實現江湖鰱群體自由擴散，有利于補充湖泊鰱群體資源及提高其遺傳多樣性。

根據Hd和Pi大小，可以將魚類遺傳多樣性分為4種類型：高Hd高Pi、高Hd低Pi、低Hd高Pi和低Hd低Pi[24]。通過魚類的遺傳多樣性模式，可以初步推斷群體的歷史動態：當群體具有高Hd高Pi模式，表示群體穩定，具有較悠久的進化歷史；當群體具有高Hd低Pi模式，表示群體是經歷瓶頸效應后迅速擴張而來[24]。本研究結果顯示，太湖等3個群體遺傳多樣性為高Hd高Pi類型，表示群體穩定，且具有較悠久的進化歷史；其他5個群體遺傳多樣性為高Hd低Pi類型，表示群體是經歷瓶頸效應后迅速擴張而來。通常采用Tajima′s D和Fu′s Fs中性檢驗和核苷酸歧點分布圖推測群體歷史動態：中性檢驗Tajima′s D和Fu′s Fs數值均為負值，且統計上顯著表明群體可能經歷了種群擴張[25，26]。歧點錯配分布圖呈單峰型，表明群體經歷了種群擴張；歧點錯配分布圖呈雙峰分布，表明群體沒有經歷過種群擴張，較為穩定[27，28]。研究結果顯示，8個鰱群體的歧點分布圖顯示為多峰分布，6個群體的Tajima′s D和3個群體的Fu′s Fs中性檢驗結果為負值，其他群體的Tajima′s D和Fu′s Fs中性檢驗結果為正值，且統計上不顯著，均表明鰱群體符合中性進化，進化過程中未經歷過顯著的群體擴張事件，與已有研究結果相一致[6，7]。

3.2 鰱群體遺傳結構

遺傳分化指數(Fst)是衡量群體間遺傳分化程度的可靠參數，群體間親緣關系越近，則遺傳分化指數越小。WRIGHT S[29]指出，Fst在0～0.05之間，表示分化弱；Fst在0.05～0.15之間，表示中等分化；Fst在0.15～0.25之間，表示分化大；Fst大于0.25，表示分化極大。本研究結果顯示，兩兩群體間Fst在-0.023 6～0.080 48之間，表明群體間遺傳分化弱。通過AMOVA分析發現，遺傳變異主要來源于群體內，群體間遺傳分化較小。從各群體單倍型組成來看，群體間擁有多個共享單倍型，且共享單倍型的個體數量多，占據明顯優勢，表明群體間存在廣泛的基因交流，單倍型NJ系統發育樹和單倍型網絡結構圖也支持此觀點。這種結果的出現可能有以下幾個方面的原因：(1)群體地理位置較近，鰱的運動能力和適應能力較強，活動范圍廣；(2)群體間通過京杭大運河或其他河道相連通，有利于群體間基因交流[30]；(3)多年來持續開展增殖放流活動，導致鰱群體現出同質化，遺傳結構單一[31]，這一現象在其他魚類如康浪白魚和巖原鯉遺中均有發現[31，32]。本研究中只有長蕩湖群體與太湖等群體間出現中度遺傳差異，可能由于放流苗種自身的遺傳差異所導致。因此應開展增殖放流苗種遺傳背景評價，防止增殖放流改變野生群體的遺傳結構。

3.3 湖泊鰱資源管理措施和建議

魚類遺傳多樣性和遺傳結構的研究可以為制定漁業資源管理措施和保護策略提供科學依據。本研究借助于線粒體COI分子標記，探究了江淮下游湖泊鰱群體的遺傳多樣性和遺傳結構。結果顯示，太湖、駱馬湖及金沙湖群體的遺傳多樣性較豐富，滆湖、長蕩湖、淀山湖、高郵湖及洪澤湖群體的遺傳多樣性較低。整體來看，湖泊群體的遺傳多樣性明顯低于長江干流群體。8個群體間遺傳分化極小，可以視為一個進化單元，將將8個鰱群體作為一個整體進行管理。增殖放流是影響湖泊鰱群體遺傳多樣性和遺傳結構的重要因素之一。

根據研究結果，可以采取以下措施恢復鰱資源量及提高遺傳多樣性：(1)加強漁政執法管理，嚴厲打擊非法捕撈，禁止使用禁用漁具，落實涉漁工程生態補償措施；(2)科學規范開展增殖放流，提高放流苗種成活率，增加放流苗種來源，對放流苗種進行遺傳多樣性評價，選擇遺傳多樣性豐富的苗種作為放流群體，開展增殖放流監測和效果評估，及時調整和優化增殖放流活動；(3)控制湖泊環境污染，開展生態環境治理，減輕環境脅迫，為魚類生長提供良好棲息環境；(4)打通江湖通道，實現江湖鰱群體自由擴散，有效補充湖泊鰱資源，提高鰱遺傳多樣性水平。