干旱脅迫對鮮食葡萄葉片解剖結構的影響

王爽， 侯毅興， 馮琳驕， 盧倩倩， 周龍

（新疆農業大學園藝學院，烏魯木齊 830052）

葡萄（VitisviniferaL.）是葡萄科（Vitaeace）葡萄屬（VitisL.）的一種木質藤本果樹，屬于漿果類水果，葡萄果肉營養豐富，果實中含有多種營養物質，是日常生活中較受喜愛的水果之一[1]。新疆是我國葡萄栽培較大的地區，該地區光照充足、熱能豐富、空氣干燥、降雨量稀少和晝夜溫差大等特殊的氣候條件[2]，非常適宜葡萄的栽培和生長。作為我國葡萄較大栽培生態區，該地區戈壁和沙漠的面積巨大，占總面積的80.55%，水資源短缺、干旱和極端干旱天氣頻發成為制約農業發展的最重要因素，因此生產上選擇耐干旱、耐高溫和耐強光照的葡萄品種進行栽培，對新疆地區葡萄產業的發展至關重要。在干旱脅迫下，植物葉片是應對環境變化較敏感的器官之一，而葉片解剖結構與植物的抗旱性具有明顯的相關性[3]。白重炎等[4]對干旱脅迫下核桃的抗旱性進行研究發現，葉片上表皮厚度和柵欄組織占葉片厚度的比例越大其抗旱能力越強。王樹森等[5]在研究5種灌木的抗旱性時得出，葉片的表皮細胞、厚度、柵欄組織和海綿組織與植物的抗旱性密切相關。王延秀等[6]在研究3種蘋果砧木的葉片解剖結構與抗旱性關系時發現，蘋果葉片的柵欄組織細胞越長，排列越緊密，其抗旱能力越強。孫志超等[7]通過研究山核桃葉片解剖結構與抗旱性關系發現，抗旱能力較強的品種葉片特征為具有較大的柵海比和細胞結構緊實度以及較小的細胞結構疏松度。潘學軍等[8]在對葡萄葉片進行顯微結構觀察時發現，葉片柵欄組織/海綿組織越大，葡萄的抗旱能力越強。目前，對葡萄抗旱性評價的研究多從形態結構[9]、活性氧代謝[10]、光合生理[11]、內源激素[12]和果實品質[13]等方面進行探討，關于葉片組織解剖結構與抗旱性之間的關系研究較少。對干旱環境下葉片解剖結構變化的研究已經成為判斷植物抗旱能力的一種簡單可靠的方法。因此以新疆近年來主栽鮮食葡萄品種和新引進鮮食葡萄品種為研究對象進行不同程度的干旱脅迫，研究不同品種生長勢和葉片結構特征的差異，利用主成分分析法對各鮮食葡萄品種抗旱性的強弱進行綜合評價，為干旱地區鮮食葡萄品種的篩選和引種提供一定理論依據和科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為新疆維吾爾自治區昌吉自治州北方園藝場提供。1年生扦插自根苗，基部粗度約8.5～9.5 mm，有4～6個芽眼，供試10個品種的來源、親本及選育單位見表1。

表1 供試品種的基本信息Table 1 Basic information of the tested varieties

1.2 試驗方法

試驗在新疆農業大學園藝學院實驗地進行。將葡萄幼苗種植于上口直徑25 cm、下口直徑20 cm、高25 cm的塑料花盆中，盆土為烏魯木齊市四?；ɑ苊缒巨r民合作社提供的營養土，每盆精準稱量5 kg。干旱脅迫設置4個土壤水分梯度，分別為：正常水分供應(CK)，土壤相對含水量為80%；輕度干旱脅迫(H1)，土壤相對含水量為60%；中度干旱脅迫(H2)，土壤相對含水量為40%；重度干旱脅迫(H3)，土壤相對含水量為20%。每個處理6盆重復，10個品種共240盆。從定植后每天于北京時間9∶00采用稱重補水法進行補水，控制土壤水分直至嚴重干旱脅迫狀態下1/3的葉片出現50%黃化干枯甚至脫落，脅迫共持續15 d。搭建簡易遮雨棚防止雨水洗淋。

1.3 指標測定及方法

1.3.1 生長勢的測定 于脅迫第15天，采用直接測定法對每個處理1年生新梢從基部數第10片葉進行莖節長度（stem length, SL）、莖節粗度(stem diameter, SD)、葉片長度(leaf length, LL)、葉片寬度(leaf width, LW)、新梢長度(new shoot length, NSL)測定。旱害指數依據趙秀明等[14]的方法進行觀測，并計算旱害指數，劃分等級標準如下。

0級：葡萄的生長發育與對照無明顯差異；1級：葡萄葉片有1/3發生萎蔫；2級：葡萄葉片有2/3發生萎蔫；3級：葡萄葉片全部萎蔫或葉片邊緣開始黃化干枯；4級：葡萄葉片黃化較重且有30%葉片干枯；5級：葡萄葉片50%黃化干枯，并發生脫落。

式中，D1為旱害級值，L1為相應旱害級株數，L0為總株數，D0為旱害最高級值。

1.3.2 葉片相對含水量的測定 葉片相對含水量（relative water content of leaf, RWCL）的測定方法采用飽和稱重法。于脅迫第0、4、8、12和15天，采集葡萄植株1年生新梢從基部數第4片葉，擦去葉片上的塵土后用感量萬分之一的電子天平稱初始鮮重（fresh weight,Wf），將葉片放入標記好的信封中帶回實驗室，將整個葉片放入蒸餾水浸泡8 h后取出，擦干葉片表面多余的水分后稱飽和重（saturated weight,Ws），將葉片放入標記好的培養皿中，經烘箱105 ℃殺青30 min，80 ℃下烘干至恒重，稱量干重（dry weight,Wd），計算其葉片相對含水量。每個處理重復3次，每個重復1片葉。

1.3.3 葉片組織結構的觀測 葉片組織結構采用石蠟切片法進行觀測[15]。分別于脅迫第0和15天，選取各鮮食葡萄品種1年生新梢從基部數第5片成熟功能葉的中部0.6 cm×0.6 cm作為樣本，避開主葉脈，置于FAA固定液（75%酒精∶甲醛∶冰乙酸=90∶5∶5）中保存。于番紅固綠染色后封片，每個樣品重復3次，在Nikon顯微鏡下觀察拍照，對各品種的上表皮厚度（thickness of upper epidermis, TUE）、下表皮厚度（thickness of lower epidermis, TLE）、柵欄組織厚度（thickness of palisade tissue, TP）、海綿組織厚度（thickness of spongy tissue, TS）和葉片厚度（leaf thickness, TL）進行測量，測量20次求平均值。并按以下公式計算柵海比（palisade tissue and spongy tissue ratio, P/S）、細胞結構緊密度（cell tightness ratio, CTR）、細胞結構疏松度（spongy ratio, SR）和各指標的抗旱系數（drought coefficient, DC）[16]。

1.4 數據處理

用Microsoft Excel 2010整理數據和繪圖，用Image J軟件進行葉片組織結構的觀測，用SPSS 19.0軟件對各脅迫處理的指標進行單因素方差分析、主成分分析。主成分分析式中：X1表示上表皮厚度；X2表示柵欄組織厚度；X3表示柵海比；X4表示海綿組織厚度；X5表示下表皮厚度；X6表示葉片厚度；X7表示細胞緊實度；X8表示細胞疏松度；X9表示莖節長度；X10表示莖節粗度；X11表示葉片長度；X12表示葉片寬度；X13表示新梢長度；X14表示相對含水量，F1代表主成分1得分，F2代表主成分2得分，F3代表主成分3得分。

2 結果與分析

2.1 不同鮮食葡萄品種旱害指數與抗旱性的關系

旱害指數可以直觀地反映植株抗旱能力大小，同時也是衡量品種間抗旱能力差異的宏觀指標之一[17]。不同程度干旱脅迫下10個鮮食葡萄品種的旱害指數如表2所示，隨著干旱脅迫程度的增加，各品種均遭受不同程度的旱害。在CK下各品種均生長正常；在輕度干旱脅迫時，‘紫甜無核’‘絲路紅玫瑰’‘甜蜜藍寶石’和‘浪漫紅顏’的少部分葉片表現出了暫時萎蔫，旱害指數分別為8.00%、5.67%、3.67%和2.67%，其余鮮食葡萄品種生長發育與對照無差別；中度干旱脅迫下，僅‘黑脆無核’正常生長，其余品種葉片均表現出萎蔫和黃化，其中‘紫甜無核’的黃化和干枯率最高，旱害指數為29.33%，‘絲路紅玫瑰’次之，為28.00%；重度干旱脅迫下，10個品種的葉片均表現出不同程度的萎蔫、黃化甚至干枯脫落，其中‘紫甜無核’的新梢頂部葉片干枯脫落，基部的葉片出現50%的黃化干枯，旱害指數達到70.67%，而‘黑脆無核’只部分葉片表現出暫時萎蔫，旱害指數僅為6.67%。10個鮮食葡萄品種的旱害指數由小到大依次為‘黑脆無核’＞‘陽光玫瑰’＞‘深紅玫瑰’＞‘火焰無核’＞‘戶太8號’＞‘夏黑’＞‘浪漫紅顏’＞‘甜蜜藍寶石’＞‘絲路紅玫瑰’＞‘紫甜無核’。

表2 不同干旱脅迫程度下10個鮮食葡萄品種的旱害指數Table 2 Drought damage indices of 10 grape varieties under different levels of drought stress(%)

2.2 不同鮮食葡萄品種葉片相對含水量與抗旱性的關系

葉片相對含水量是評價植物受干旱脅迫程度的重要指標之一[18]。干旱脅迫下10個鮮食葡萄品種葉片相對含水量的變化如表3所示，在整個干旱脅迫處理期間，10個鮮食葡萄品種葉片相對含水量隨著干旱脅迫時間的延長均呈現出下降的趨勢。在干旱脅迫第0天，所有品種的葉片相對含水量均在83.28%～89.51%，品種間無顯著差異。干旱脅迫第4天，只有‘黑脆無核’的葉片相對含水量保持在81%以上，其他均下降至80%以下。在干旱脅迫第15天時，品種間的差異達到最大值，其中只有‘黑脆無核’和‘陽光玫瑰’的葉片相對含水量依舊維持在較高水平，分別為62.60%和60.17%；葉片相對含水量稍低的品種為‘深紅玫瑰’‘火焰無核’‘戶太8號’和‘夏黑’，葉片相對含水量為47.53%～51.09%；而‘浪漫紅顏’‘絲路紅玫瑰’‘甜蜜藍寶石’和‘紫甜無核’的葉片相對含水量均低于43%。與干旱脅迫第0天相比，‘黑脆無核’和‘陽光玫瑰’的降幅較小，分別為24.83%和29.47%；‘紫甜無核’和‘絲路紅玫瑰’的降幅較大，分別為56.94%和52.85%。

表3 干旱脅迫下10個鮮食葡萄品種葉片相對含水量的變化Table 3 Changes in the relative water content of leaves of 10 grape varieties under drought stress （%）

2.3 不同鮮食葡萄品種葉片解剖結構與抗旱性的關系

2.3.1 不同葡萄品種葉片解剖結構 處在干旱環境下的植物，可以通過改變葉片的顯微結構來適應干旱環境，因此可以將葉片的解剖結構作為評價植物抗旱性的重要途徑[19]。葡萄葉片的解剖結構包括上表皮細胞、下表皮細胞、柵欄組織和海綿組織等。由圖1可知，正常水分供應下10個鮮食葡萄品種的共同特征為柵欄組織由1層排列整齊且緊密的長柱形細胞組成，細胞間隙較小，海綿組織細胞排列緊湊；在重度干旱脅迫處理15 d后，部分鮮食葡萄品種的柵欄組織細胞短縮且排列松散，形狀變得不規律，海綿組織細胞排列不規則且細胞間隙較大。在遭受干旱脅迫后，只有‘黑脆無核’和‘陽光玫瑰’的葉片上表皮細胞、下表皮細胞、柵欄組織比海綿組織和細胞緊實度增大；而干旱脅迫下的‘紫甜無核’和‘絲路紅玫瑰’葉片的上表皮細胞、下表皮細胞、柵欄組織比海綿組織和細胞緊實度卻減少。

圖1 干旱脅迫下10個鮮食葡萄品種葉片解剖結構的變化Fig.1 Changes of leaf anatomical structure of 10 grape varieties under drought stress

2.3.2 不同葡萄品種抗旱系數分析 抗旱系數可以反映植物對干旱的敏感程度，使用抗旱系數鑒定法對果樹的抗旱性進行鑒定，具有效果直觀和便捷的優點，尤其是該方法與鑒定對象的實際抗旱性相差最小[20]。由表4可以看出，‘黑脆無核’‘陽光玫瑰’和‘深紅玫瑰’的葉片上下表皮厚度的抗旱系數均在1.05以上，其中‘黑脆無核’的抗旱系數最大，上下表皮厚度抗旱系數分別達到了1.40和1.28，‘火焰無核’的下表皮厚度抗旱系數最小，僅為0.81；‘黑脆無核’‘陽光玫瑰’和‘深紅玫瑰’的葉片柵欄組織與海綿組織之比的抗旱系數均達到1.00以上，‘浪漫紅顏’的柵海比的抗旱系數最小，僅有0.76；葉片厚度的抗旱系數‘黑脆無核’最大，達到1.36，‘甜蜜藍寶石’的抗旱系數最小，為0.85；‘黑脆無核’‘陽光玫瑰’和‘戶太8號’的細胞緊實度的抗旱系數均達到1.09以上。根據各品種抗旱系數均值的大小，將13個抗旱相關指標對干旱脅迫的敏感程度進行排序，依次為柵海比＞細胞緊實度＞柵欄組織厚度＞下表皮厚度＞葉片厚度＞莖節粗度=新梢長度＞上表皮厚度=莖節長度＞細胞疏松度＞海綿組織厚度＞葉片寬度＞葉片長度。其中，在干旱脅迫下敏感的指標為柵海比和細胞緊實度，其他葉片解剖結構指標和表型指標的敏感程度次之。根據抗旱系數可知，干旱脅迫下柵海比相較于對照升高的品種為‘黑脆無核’‘陽光玫瑰’和‘深紅玫瑰’，干旱脅迫下細胞緊實度相較于對照升高的品種有‘黑脆無核’‘陽光玫瑰’和‘戶太8號’，而干旱脅迫下其余鮮食葡萄品種相較于對照均降低。

表4 10個鮮食葡萄抗旱相關性狀的抗旱系數Table 4 Drought resistance coefficients of 10 drought resistance-related traits of grapes

2.4 不同干旱脅迫下10個鮮食葡萄品種的綜合評價

不同程度干旱脅迫下10個鮮食葡萄品種表現出了不同的抗旱能力，分析表5中各品種抗旱相關指標的主成分累計貢獻率可知，在14個指標特征值中前3個因子的特征值＞1，累計貢獻率達90.44%，表明這3個主成分可以代表原有14個主成分90.44%的信息，因此可以提取前3個主成分進行10個鮮食葡萄品種抗旱能力的分析。

表5 各成分載荷矩陣Table 5 Load matrix of each component

用14個主成分載荷值（表5）分別除以3個主成分特征值的平方根記為特征向量值，再將特征向量與標準化相乘得到各主成分的表達式(式7～9)。

分別用各主成分得分的平均值乘以其相對應特征值的開方，計算出各項指標的隸屬函數值，以3個主成分所對應的特征值占所提取主成分總的特征值之和的比作為權重，得出各品種的綜合評價值（D值），D值越大說明該品種的抗旱能力越強。

根據表6的排名可知，10個鮮食葡萄品種抗旱能力的強弱順序依次為‘黑脆無核’＞‘陽光玫瑰’＞‘深紅玫瑰’＞‘火焰無核’＞‘戶太8號’＞‘夏黑’＞‘浪漫紅顏’＞‘紫甜無核’’＞‘絲路紅玫瑰’＞‘甜蜜藍寶石’，在10個鮮食葡萄品種中，‘甜蜜藍寶石’的綜合得分最低，只有0.14，表明抗旱能力最差；‘黑脆無核’的綜合得分最高，達到了0.95，表明其抗旱能力最強。

表6 10個鮮食葡萄品種抗旱性隸屬函數值及綜合評價值Table 6 Drought resistance membership function values and comprehensive evaluation values of 10 grape varieties

3 討論

3.1 旱害指數與抗旱性的關系

干旱脅迫會導致植物的生長發育受到抑制，使植物在外部形態上表現出旱害癥狀，因此可以通過判斷其旱害程度來直觀地分辨植物的抗旱能力[21]。本研究發現，隨著干旱脅迫程度的加深，各鮮食葡萄品種的旱害癥狀逐漸加重，其旱害指數差別明顯。重度干旱脅迫下‘紫甜無核’和‘絲路紅玫瑰’的旱害指數最大，表明其抗旱能力較弱，這與王勇等[22]在運用自然干旱法進行6個鮮食葡萄品種抗旱性對比試驗中得出的結果基本一致。

3.2 葉片相對含水量與抗旱性的關系

葉片相對含水量是植物體內持水與保水共同作用的結果，可以反映出干旱脅迫下植株對水分的利用狀況，與水分代謝聯系緊密。通常情況下在干旱脅迫期間，葉片相對含水量下降越小的品種其抗旱能力越強[23]。本研究發現，‘黑脆無核’在重度干旱脅迫下仍可以維持較高的葉片相對含水量，表明其在干旱條件下，葉片水分虧缺最小，可以正常的進行水分代謝，抗旱能力最強，與李敏敏等[24]在對葡萄砧木的抗旱性研究中得出的結果一致。分析認為，植物葉片不能直接吸收固態的無機和有機物質，只能吸收溶解在水中進行運輸的養分，水作為細胞的溶劑，在水分虧缺時會導致植物生長受到抑制，當葉片相對含水量較高時，其運輸營養物質的能力越強，這可能是葉片相對含水量較高的品種抗旱能力較強的原因之一。

3.3 葉片解剖結構與抗旱性的關系

植物水分散失的主要途徑為葉片蒸騰，當面臨水分虧缺時，葉片作為應對環境變化較敏感的器官，其解剖結構可以反映植物在干旱環境下的適應能力[25]。一般認為植物的葉片厚度和上下表皮細胞越厚，儲水能力越強，水分蒸騰的速率越慢，其抗旱能力就越強。翟曉巧等[26]通過對比干旱脅迫下8種落葉喬木葉片解剖結構發現，葉片厚度與品種間的抗旱能力成正比。本研究發現，干旱脅迫后抗旱能力最強的‘黑脆無核’葉片厚度最大。潘昕等[27]對青藏高原25個灌木品種葉片旱生結構的比較發現，葉片厚度和柵海比最大的‘俄羅斯大果沙棘’的抗旱性最強。本研究表明，干旱脅迫下抗旱能力最弱的‘紫甜無核’上下表皮厚度均減小，推測可能是因為水分的虧缺阻礙了葉片水分代謝，使細胞的生長和分裂受阻，從而限制了葉片的生長，這與薛智德等[28]在5種灌木抗旱性研究中種得出的結論一致。通常認為發達的柵欄組織可以保護葉肉細胞免受強光的灼傷，同時還可以更加有效地利用衍射光維持細胞正常的光合代謝。此外，由于柵欄組織分布在葉片結構的兩側，還可以防止干旱萎蔫狀態下的機械損傷，而較為松散的海綿組織，可以避免水分蒸發和耗散，提高植物對水分的利用效率，表現出較強的抗旱能力[29]。因此，海綿組織與柵欄組織分化程度可以直接反映植物生長環境的水分狀態，被作為評價葡萄抗旱能力的重要指標之一。陳紹莉等[30]在研究葡萄砧木葉片組織結構與抗旱性關系時也得出，抗旱能力最強的‘河岸九號’柵海比最大。本研究發現，10個鮮食葡萄品種的葉片解剖結構參數指標中，柵海比對干旱脅迫的敏感程度最高，抗旱能力較強的‘黑脆無核’和‘陽光玫瑰’柵海比的抗旱系數均達到1.1以上，且柵欄組織均排列緊密，說明高度發達的柵欄組織是葡萄對干旱環境的適應性調節。