大腸桿菌O157∶H7生物被膜狀態下基因表達分析

馬藍， 彭晴， 徐小輕， 楊碩， 張宇微， 田丹丹， 施琳波， 石波， 喬宇

（中國農業科學院飼料研究所，北京100081）

細菌生物被膜是細菌受到環境壓力如營養缺乏、低pH或抗菌物質存在時，黏附在非生物或生物基質表面，分泌大量由多糖、蛋白質、脂類、核酸等組成的胞外多聚物將菌體包裹在其中而形成的膜狀物[1]。據統計，80%以上的細菌感染都與生物被膜的形成有關[2]。生物被膜對細菌有保護作用，使細菌免受抗生素以及宿主防御系統的攻擊。持留菌是對抗生素耐受的細胞亞群[3]，生物被膜中存在少部分持留菌也會引起抗生素的失效[4]。分泌生物被膜的致病菌對抗生素的耐受性可以提高10～1 000倍，且對宿主免疫防御的抗性也增強數倍[5]，致使許多細菌感染難以得到控制，嚴重威脅食品安全和人類健康。

細菌生物被膜的形成過程是細菌從浮游狀態向多細胞聚集的微生物群落狀態轉變的過程。在營養充足的液體培養基中，細菌以單細胞浮游狀態生存；當營養耗盡時，細菌生長進入靜止期，鞭毛驅動的運動和趨化力幫助細菌細胞選擇最有利的生態位，黏附在基質表面形成生物被膜[6]。細菌最初通過細胞表面結構（如菌毛、鞭毛、卷曲纖維和表面蛋白）黏附到生物或非生物基質表面，移動性減弱進而以表面附著的形式發生細胞分裂，與胞外大分子形成微菌落并最終形成成熟的生物被膜[7]。黏附是生物被膜形成的關鍵步驟，細菌能同時表達多種黏附素，黏附素聚集在細絲狀的菌毛細胞器上。不同黏附素賦予細菌表面不同的特性，以識別不同的生物（組織、細胞等）或非生物基質（玻璃、塑料等）表面。表面附著的細菌微菌落擴展成高度組織的群體結構受多因素影響，涉及細胞間的群體感應、細菌運動性（朝營養豐富的區域移動）以及物質能量代謝（適應多細胞共生方式、產生次級代謝產物）等多種生理代謝活動的改變[8]。

不同細菌形成生物被膜的機制各不相同，通常取決于環境條件和特定的菌株屬性[4]。了解細菌在生物被膜狀態下特異表達的基因對于揭示細菌在不同環境中生物被膜形成的分子機制至關重要。腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhagicEscherichia coli, EHEC）是人畜共患的病原菌，引發出血性結腸炎、溶血性尿毒癥和血栓性血小板減少性紫癜等多種疾病[9]。大腸桿菌作為模式生物，雖然已經有很多研究報道了其生物被膜形成的分子機制，大腸桿菌O157∶H7為食源性致病菌，還未對該菌在生物被膜狀態下基因特異表達的研究。本研究以大腸桿菌O157∶H7為試驗菌株，研究其在生物被膜狀態和浮游狀態2種條件下基因表達的差異，通過轉錄組測序（RNA-seq)以及GO（gene ontology）和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析，確定生物被膜形成的關鍵基因和代謝通路，為進一步研究生物被膜形成的分子調控和病原菌生物被膜的防治提供數據基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

大腸桿菌（Escherchia coli）O157∶H7（CICC 10907）購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.2 菌體培養

將保存在-80 ℃的大腸桿菌O157∶H7于胰酪大豆胨（tryticase soy broth, TSB，海博生物技術有限公司）固體平板上劃線，37 ℃培養24 h，挑取單菌落接種于3 mL TSB培養基中培養12 h；再用新鮮的TSB培養基將菌液濃度調至106CFU·mL-1，按1 mL·孔-1加入聚苯乙烯材質的24孔細胞培養板（無錫耐思生命科技股份有限公司，型號702001）中，浮游狀態（planktonic， PLA）的菌體于37 ℃、100 r·min-1條件下振蕩培養12 h；生物被膜狀態（biofilm, BIO）的菌體于37 ℃靜置培養24 h。

1.3 大腸桿菌生物被膜的熒光顯微鏡觀察

吖啶橙熒光染料（北京索萊寶科技有限公司）可嵌入雙鏈DNA的雙鏈堿基對，能結合到細菌生物被膜的eDNA上，用于細菌生物被膜的定性定量分析[10]。將培養的菌液加入24孔細胞培養板中，將滅菌的矩形蓋玻片（1 cm×1 cm）斜插入24孔板中，大腸桿菌分別在浮游狀態和生物被膜形成狀態下培養，培養完成后，取出蓋玻片，用PBS緩沖液小心清洗，蓋玻片上的生物被膜用0.01%吖啶橙溶液染色5 min[11]，熒光顯微鏡（LSM 700，德國蔡司公司）觀察2種生長模式下生物被膜的形成。

1.4 RNA-Seq測序分析

1.4.1 樣品準備 按1.2的方法培養菌體，菌液經8 000 r·min-1離心10 min后，用無菌PBS緩沖液清洗菌體3遍，立即用液氮速凍，放置-80 ℃冰箱，用于RNA-Seq分析，每組設置3個生物學重復，分別命名為PLA_1、PLA_2、PLA_3和BIO_1、BIO_2、BIO_3。

1.4.2 建庫測序 采用天根生化科技有限公司的細菌試劑盒DP 430提取大腸桿菌總RNA，去除Total RNA中的核糖體RNA，獲得mRNA。將得到的mRNA隨機打斷成短片段，采用紐英倫生物技術有限公司的RNA超快速定向文庫制備試劑盒——Illumina，按照鏈特異性建庫的方式建庫。文庫構建完成后，稀釋文庫至1.5 ng·μL-1，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求pooling后進行Illumina測序。

1.4.3 差異表達基因比較分析 用DESeq 2軟件分析在不同條件下轉錄組的差異表達，找出不同樣本間存在的差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），計算log2(FoldChange)及其校正后的統計檢驗（Padj值）。本研究以|log2(FoldChange)|≥1、Padj≤0.05作為篩選差異表達基因的閾值。

1.4.4 差異表達基因聚類分析 通過聚類分析發現基因或樣本間未知的生物學聯系和差異。使用R軟件包中的Pheatmap軟件對差異基因進行聚類分析，確定不同生長模式下大腸桿菌轉錄本的表達模式。

1.4.5 差異表達基因的GO和KEGG富集分析用Cluster Profiler軟件對差異基因集進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。應用超幾何分布計算差異表達基因顯著富集的GO功能條目和KEGG通路，均以Padj≤0.05作為顯著性富集的閾值。

2 結果與分析

2.1 大腸桿菌O157∶H7在浮游狀態和生物被膜狀態下的生物被膜形成情況

生物被膜中營養物質的擴散速度較慢，形成了細胞代謝不活躍的細菌群落，與細菌生長靜止期的細胞代謝類似[4]。參考Schembri等[8]的研究結果，將浮游狀態的大腸桿菌O157∶H7在37 ℃振蕩培養12 h，菌體OD600nm為1.3時收集細胞，此時細菌處于生長的靜止期；而生物被膜狀態的大腸桿菌O157∶H7在37 ℃靜置培養，通氣量較浮游狀態小，生長速率降低，24 h后形成穩定的生物被膜，此時處于生物被膜形成初期。

2種狀態下的大腸桿菌O157∶H7經吖啶橙染色后，用熒光顯微鏡觀察（40×），結果如圖1所示。浮游狀態的大腸桿菌O157∶H7呈單個細菌形態，未觀察到胞外生物被膜結構（圖1A）；靜置培養后的大腸桿菌O157∶H7胞外呈現大量不規則結構，形成明顯的生物被膜（圖1B）。由此可見，在本試驗的培養條件下，大腸桿菌在浮游狀態下不產生生物被膜，而在靜置培養狀態下產生大量的生物被膜。

圖1 不同狀態下的大腸桿菌O157∶H7生物被膜Fig.1 E.coli O157∶H7 biofilm during different growth states

2.2 轉錄組數據分析

2.2.1 數據質控 由表1可知，樣品的GC含量為52.73%～52.94%；將有效數據和參考基因組比對，比對率均達到93.57%以上，且Q20和Q30均大于94%。綜上所述，轉錄組測序質控良好，有效數據質量合格，適合于后續分析。

表1 RNA-Seq數據統計Table 1 RNA-Seq data statistics

2.2.2 基因差異表達分析 與浮游狀態相比，大腸桿菌O157∶H7在生物被膜形成狀態下檢測到1 652個顯著的差異表達基因（DEGs），3 642個無差異表達的基因。上調表達基因821個，占全基因比例15.51%；下調表達基因831個，占15.70%（圖2）。

圖2 大腸桿菌O157∶H7在浮游狀態和生物被膜形成狀態下差異表達基因火山圖Fig.2 Volcano map of DEGs in E.coli O157∶H7 during planktonic growth state and biofilm growth state

2.2.3 差異基因的聚類分析 基于顯著差異表達基因進行聚類分析，結果（圖3）顯示，生物被膜形成狀態的大腸桿菌聚為一類，浮游狀態的大腸桿菌聚為另一類，即不同狀態的大腸桿菌差異較大，呈現出2種不同的生長模式；而同一狀態下的3個生物學重復間相似性較高。

圖3 大腸桿菌O157∶H7在浮游狀態和生物被膜形成狀態下差異表達基因聚類分析Fig.3 Cluster analysis of DEGs in E.coli O157∶H7 during planktonic growth state and biofilm growth state

2.2.4 GO功能注釋及富集分析 為明確大腸桿菌O157∶H7在浮游狀態和生物被膜形成狀態下差異基因的生物學功能，對顯著差異表達基因進行GO功能注釋和富集分析，1 652個顯著差異基因中有448個被注釋到GO功能，其中260個與生物過程（biological process，BP）有關；29個與細胞組成（cellular component，CC）有關；159個與分子功能（molecular function，MF）有關。表2列出了前30個富集的GO功能注釋，包括29條BP途徑和1條CC途徑。大腸桿菌O157∶H7在生物被膜形成狀態下富集的GO功能條目涉及細菌運動、物質轉運、物質代謝等生物過程，除谷氨酸代謝、硫代謝和多生物過程外，其他GO功能條目中的上調基因數量均高于下調基因數量。移動并黏附至基質表面是大腸桿菌生物被膜形成的初始關鍵步驟[12]，生物被膜狀態下，上調的GO途徑中與細菌運動相關的有7個，其運動方式以鞭毛驅動為主；生物被膜狀態下的細菌與浮游生長的靜止期生理狀態相似，會產生次級代謝產物[4]，但生物被膜狀態的細菌還需合成生物被膜的組分，包括胞外多糖、蛋白質、脂類、核酸等物質，因此與單糖及碳水化合物合成和代謝、氨基酸及蛋白質合成和代謝、核酸合成和代謝等途徑有關的基因表達上調；合成物質轉運至胞外需要膜轉運子，因此與膜離子轉運過程相關的基因表達上調；細胞的氧化還原途徑參與細胞的呼吸作用，其相關基因在生物被膜狀態下表達發生變化。本試驗還發現，在生物被膜狀態下的大腸桿菌O157∶H7硫化合物代謝過程上調，很多研究也發現了這一現象，但具體機制尚不清楚[13]。

2.2.5 KEGG富集分析 利用KEGG數據庫對顯著差異基因進行代謝通路分析，結果（圖4）顯示，上調的DEGs共注釋到73條通路中，有8條具有顯著性差異，包括與細菌運動相關的代謝通路是細菌趨化性（bacterial chemotaxis）和鞭毛裝配（flagellar assembly），與細菌氧化還原反應相關的代謝路徑是氧化磷酸化（oxidative phosphorylation），與生物大分子合成相關的代謝路徑是碳代謝（carbon metabolism）、嘧啶代謝（pyrimidine metabolism）、葉酸及一碳代謝（onecarbon pool by folate）和半胱氨酸及甲硫氨酸代謝（cysteine and methionine metabolism），與生物被膜合成調控相關的是雙組分系統（two-component system）；表達下調的DEGs共注釋到60條通路，有4條具有顯著性差異。生物被膜狀態下，ABC轉運系統（ABC transporters）基因下調，離子型跨膜轉運系統基因上調，即細菌的膜轉運過程由耗能的ABC轉運轉變為離子型跨膜轉運；賴氨酸降解（lysine degradation）、精氨酸和脯氨酸代謝（arginine and proline metabolism）和不同環境中的微生物代謝（microbial metabolism in diverse environments）相關基因下調，以適應生物被膜狀態下的營養及合成生物大分子的需要。

圖4 大腸桿菌O157：H7在浮游狀態和生物被膜形成狀態下差異表達基因KEGG富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis of DEGs in E.coli O157：H7 during planktonic growth state and biofilm growth state

2.2.6 差異表達基因分類及注釋 將大腸桿菌在生物被膜形成狀態和浮游狀態下表達水平發生改變的基因參照KEGG網站進行分類和功能說明，結果如表3所示。

表3 大腸桿菌O157：H7浮游狀態和生物被膜形成狀態表達水平發生改變的基因Table 3DEGs in E.coli O157：H7during planktonic growth state and biofilmgrowthstate

趨化性是細菌調控并對外界環境做出反應的感受系統之一，細菌利用復雜有序的趨化系統趨向有利條件，增加對環境的適應性。生物被膜形成過程伴隨著細菌趨化性的增加。KEGG途徑富集的細菌趨化性基因共15個，基因表達水平均為上調，包括趨化受體基因mglB、tar、tap、aer以及趨化信號轉導基因cheA、cheR、cheW、cheY、cheB（表3）。趨化反應通過處于細胞兩極的受體復合體和隨機分布于細胞四周或埋于細胞膜中的鞭毛-馬達復合體調節甲基趨化受體蛋白（methylaccepting chemotaxis proteins， MCPs）感知刺激物（或環境）信號，信號通過組氨酸激酶CheA和CheY傳遞給鞭毛馬達。CheA可發生自身磷酸化，并將高能磷酸基團傳遞給CheA的同源應答調控分子CheY，磷酸化的CheY與鞭毛馬達蛋白結合，調節鞭毛的旋轉方向。磷酸化的CheA同時調節甲基酯酶CheB的磷酸化，磷酸化的CheB和甲基轉移酶CheR分別調節MCPs的去甲基化和甲基化，使細菌適應環境，做出運動改變[14-15]。

具有運動性的細菌可以通過趨化過程感知環境，移向更利于其生長的基質表面，細菌的運動主要由鞭毛驅動。2種狀態下，與鞭毛組裝有關的差異基因共26個，在生物被膜形成階段表達水平上調的基因共23個，包括基底蛋白基因（fliA、fliG、fliS）、棒狀蛋白基因（flgB、flgC、flgD、flgE、flgF、flgG、flgK、flgL）、絲狀帽蓋基因（fliD、fliT）、開關基因（motA、motB）和調節基因（motA、flgM、flgN、rpoD、flhC）。生物被膜狀態下菌體鞭毛運動性增強，是其趨化作用的結果，磷酸化的CheY能與鞭毛馬達相互作用，增加鞭毛旋轉方向逆轉的頻率，導致菌體的翻滾，從而游動方向發生改變[14]。

雙組分系統是由組氨酸和天門冬氨酸磷酸化組成的信號系統，是原核細胞中重要的表達調控系統，是細菌感受和應答外界信號的基礎，也是調控生物膜主要因素。雙組分調控系統中差異表達基因共80個，其中上調表達基因56個，下調表達基因24個。上調基因主要為感應碳源、氮源、磷源及金屬離子含量變化的調控基因phoP/phoQ、narP/narQ、glnA/glnL、rcsF、basR、maeA和感應環境因素，如滲透壓、蛋白折疊錯誤的調控基因envZ/ompF、rstB、cpxA等。在生物被膜形成過程中，營養物質缺乏以及環境壓力脅迫致使細菌多個感應環境因素的雙組分調控蛋白表達上調，這些基因的上調是細菌響應環境壓力，從浮游狀態轉變為生物被膜狀態的信號分子。

細胞膜將細胞和亞細胞成分與外界環境隔離開，細胞生存需要特異的分子物質選擇性地穿過膜成分。物質穿越細胞膜的運動通過轉運體的特化膜蛋白實現。ABC轉運體是轉運體蛋白中最主要的種類之一，能夠通過ATP的結合與水解實現多種底物穿越細胞膜[16]。大腸桿菌O157∶H7在2種生長狀態下，ABC轉運系統中差異表達基因共62個，其中在生物被膜狀態下上調表達基因16個，下調表達基因46個。下調基因編碼的轉運子包括運輸小分子和有機物（ugpE、gpB、ysT、potF、araH）、金屬離子和維生素B12（fepD、fhuB）和磷酸和氨基酸（pstS、phnC、artP、gltK）等（表3）。一方面可能是在生物被膜狀態下，有機物、金屬離子和維生素等物質運輸減少；另一方面可能是細胞為了節省能量，下調耗能的ABC轉運系統，以適應生物被膜狀態下細胞的能量需要。

生物被膜的形成伴隨物質代謝途徑的改變，處于生物被膜狀態下的大腸桿菌O157∶H7在碳代謝、氮代謝、氨基酸代謝、核酸代謝、脂肪酸代謝以及能量產生途徑都發生了變化（表3）。在形成生物被膜過程中，菌體由于趨化運動移向基質表面，并以聚集方式生長，分泌胞外多聚物直至成熟生物被膜的形成，每個步驟都涉及物質代謝和能量代謝，細胞內的代謝流也朝著適應多細胞共生方式、產生次級代謝產物如胞外多糖、蛋白質、脂質和核酸等方向轉變。

3 討論

生物被膜使細菌能夠有效抵御不良環境及抗菌藥物的滲透，并加強細菌內部間的信息交流、代謝交換和基因傳遞等[17]，使細菌耐藥性增強[18]，但是目前對于生物被膜的形成機理和分子調控機制研究仍不夠深入。解析致病菌生物被膜形成的關鍵基因及調控通路，為防治致病菌生物被膜形成提供了新的思路。

生物被膜內表層菌易于獲得營養，代謝活躍；而內層菌缺乏氧氣、營養物質，代謝處于休眠狀態，因此生物被膜內細菌具有異質性[19]。Schembri等[8]研究表明，浮游細菌在對數生長期、穩定期以及在生物被膜形成初期和后期，基因表達都存在差異，一些基因的表達與特定的生長階段相關。因此，本研究比較了大腸桿菌O157∶H7處于穩定期的浮游態和處于生物被膜形成初期2個特定階段的基因表達差異，但整個浮游狀態和生物被膜形成狀態需進一步研究。

本研究在2種不同狀態下的大腸桿菌中共檢測到1 652個存在顯著差異的表達基因，占全部基因的31.21%，而Schembri等[8]報道大腸桿菌K-12在生物被膜階段差異表達的基因僅占13.55%，這可能是兩者的試驗方法和統計方式不同造成。在生物被膜形成初期，很多基因瞬時表達在細菌從浮游狀態向生物被膜形成狀態發揮作用；而在生物被膜成熟階段，這些基因的表達水平不再上升，甚至在生物被膜形成后期表達的基因數量少于前期[7]。Whiteley等[20]研究表明，形成生物被膜6 d后的銅綠假單胞菌與浮游細菌態間的差異表達基因約1%。

細菌從浮游狀態到固體表面黏附轉變通常與細胞表面結構如鞭毛、菌毛、卷曲纖維、胞外多糖和表面蛋白相關[21]。不同株系的大腸桿菌參與生物被膜形成的表面結構不同，調控生物被膜形成的信號分子及信號傳導途徑可能也存在差別。大腸桿菌K-12表面結構Ag43的編碼基因flu在生物被膜階段表達上調[8]。而本試驗未發現flu基因表達水平在大腸桿菌O157∶H7生物被膜中發生變化。Hancock等[22]發現，引起尿路感染的大腸桿菌83972和大腸桿菌VR50在生物被膜形成過程中未檢測到flu基因表達變化，但VR50的Ⅰ型菌毛編碼基因fimBDFGH下調2.2～9.3倍。細菌趨化性是指有運動能力的細菌對胞外物質含量改變作出的反應，使細菌趨向有益刺激、逃避有害刺激的定向運動[23]，主要由鞭毛驅動[24]。趨化性在生物膜的形成過程中發揮重要作用[25-26]。細菌通過趨化作用感知環境中的營養物質，通過鞭毛、菌毛黏附在基質表面，使細菌沿著基質表面生長和定植，最終形成生物被膜。本研究發現，生物被膜狀態下細菌趨化性基因和鞭毛組裝相關基因的表達水平均上調。

細菌生物被膜形成是個復雜的過程，涉及多種營養物質及環境因子的調控。雙組分系統（two-component system, TCS）是細菌感應外界復雜環境，并將其轉換為信號分子傳遞給細胞的信號傳導系統[27]，是細菌中信號轉導的最普遍形式。典型的TCS由位于跨膜區作為傳感器的組氨酸蛋白激酶（histidine kinase, HK）和相應的位于細胞質的反應調節蛋白（response regulator, RR）組成，其可以感應外界環境變化，如養分、滲透壓等，通過雙組分蛋白的磷酸化和去磷酸化調節細胞信號傳導途徑，從而調控細菌的生理代謝、壓力應激等過程[28-29]。研究表明，雙組分系統參與生物被膜形成的調控，envZ/ompR識別滲透壓變化信號，rscC/rcsD/rcsB激活莢膜異多糖酸的生物合成，cheA/cheY/cheB控制鞭毛運動旋轉的方向，qseC/qseB將群體感應與運動、生物被膜發育和毒性聯系起來[30]。Schembri等[8]發現大腸桿菌K-12生物被膜狀態下群體感應密度信號luxS和全局調控因子rpoS上調。本研究發現，大腸桿菌O157∶H7在生物被膜形成狀態下，envZ/ompF和cheA/cheY/cheB基因顯著上調，感應營養物質和環境因子變化的多個雙組分調控基因表達上調，但與群體感應相關調控因子luxS及全局性調控因子rpoS未發現顯著的上調。

細菌的趨化、轉運和代謝之間有內在聯系[31]。細菌生物被膜的形成伴隨著一系列的物質和能量代謝改變。分析大腸桿菌K-12生物被膜和浮游態靜止期的基因表達差異，發現氨基酸生物合成、輔因子生物合成、糖代謝、能量代謝、核酸生物合成和代謝、轉錄修飾和轉運蛋白等代謝途徑在生物被膜階段發生變化[8]。本研究發現，生物被膜和浮游態間發生改變的代謝途徑主要有碳代謝、氮代謝、核酸代謝、氨基酸代謝、脂肪酸代謝和能量產生等，與前人結果存在差異，這可能是由于所用的材料、培養基及形成生物被膜時黏附的基質不同。黏附基質、生長條件等的差異導致大腸桿菌可能具有不同的生物被膜形成機制。

本研究發現，大腸桿菌O157∶H7在生物被膜形成狀態下，其趨化性、雙組分系統及物質運輸等代謝通路的基因表達發生了顯著變化，推測大腸桿菌O157∶H7生物被膜的形成可能與這些途徑密切相關。因此，干擾大腸桿菌O157∶H7運動、失活細菌雙組分調控蛋白或抑制相關的物質能量代謝，有望成為抑制大腸桿菌O157∶H7生物被膜形成的重要途徑。