半滑舌鰨體表潰瘍癥細菌性病原的分離鑒定及組織病理學研究

吳雅婷， 汪笑宇， 湯青平， 武尊， 高浩峰， 何學欣，楊張磊， 賈旭穎， 邵蓬*

（1.天津農學院水產學院，天津市水產生態及養殖重點實驗室，天津 300384；2.天津市水產研究所，天津 300221）

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevisGunther）, 國內俗稱“牛舌頭”“鰨目”, 主要分布在我國的黃海和渤海海域, 體型大、生長快、經濟價值高，已成為我國北方沿海地區重要的海水養殖經濟魚類[1]。隨著養殖規模不斷擴大，各種疾病也隨之發生，其中皮膚潰瘍病給天津地區半滑舌鰨的養殖產業發展造成了嚴重的經濟損失[2]。半滑舌鰨的體表潰瘍癥大多與弧菌病有關，包括哈維氏弧菌(Vibrio harveyi) 、鰻弧菌(V.anguillarum)、需鈉弧菌(V.natriegens)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、燦爛弧菌(V.splendidus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、輪蟲弧菌(V.rotiferianus)、創傷弧菌(V.vulnificus)、殺鮭弧菌(V.salmonicida)、海利斯頓氏菌(V.pelagius)、美人魚弧菌(V.damsela)、奧氏弧菌(V.ordalii)、費氏弧菌(V.fischeri)以及最小弧菌(V.mimicus)等[3-4]。其中，哈維氏弧菌導致的水產動物死亡已經引起廣泛關注。陳政強等[2]從體表潰瘍的半滑舌鰨體內分離出輪蟲弧菌和哈維氏弧菌；許悅等[5]從體表潰瘍的石斑魚體內分離出9株菌，經鑒定全部為哈維氏弧菌。

哈維氏弧菌（ATCC 14126T）最早從死片腳類動物中分離出來，并于1935年命名為Achromobacter harveyi[6]，分類到發光桿菌屬，之后又被分到貝內克氏菌屬。貝內克氏菌屬被廢除后最終被分到弧菌屬[7]。哈維氏弧菌是最常見的1種海洋弧菌，可能與海洋動物的腸道菌群有關[8]，可以感染很多海洋魚類或無脊椎動物[9]。該病具有死亡率高、流行性強且分布廣的特點[10]，對海水魚類的危害極大。病魚的癥狀主要表現為腹水，腸道外翻，腎臟及脾臟充血，體表鱗片脫落、潰瘍，嚴重時潰瘍處不斷擴大形成潰爛，病魚停止攝食，最終死亡[1]。

本研究對某養殖場患病半滑舌鰨進行了臨床診斷、病原菌分離、人工感染、藥敏分析以及病理組織切片分析，以期為科學防治由該菌導致的半滑舌鰨疾病提供參考依據。

1 材料及方法

1.1 患病魚的臨床檢查

患病魚體取自天津某半滑舌鰨養殖場，體表觀察后取患病魚的鰓絲及體表黏液制成水浸片于顯微鏡(DM750，Leica)下觀察有無寄生蟲和真菌感染，將病魚解剖進一步觀察魚體腸道、肝臟及脾臟等內部器官的癥狀。

1.2 病原菌的分離與培養

在無菌條件下分別從病魚的肝臟、腎臟、脾臟等處取樣并接種于2216E和TCBS培養基(青島海博生物技術有限公司)，28 ℃培養24 h。根據菌落形態分為不同種菌株，挑取單菌落進行純化培養。純化后的菌株轉入液體培養基中加20%甘油，放于冰箱-80 ℃保存。

1.3 人工感染試驗及LD50測定

健康半滑舌鰨取自天津市濱海新區某半滑舌鰨養殖公司，體長為18～24 cm，體質量35～45 g。根據養殖場養殖條件（水溫26 ℃，鹽度20）于循環水中暫養1周，早晚各投喂1次并進行池底吸污，1周后開始攻毒試驗。試驗共設置5個處理組，4個試驗組和1個對照組，每組10尾魚。試驗前將-80 ℃甘油保存的菌株放室溫下復蘇，經2216E平板活化、純化，選擇生長良好的單菌落接種到BHI液體培養基(青島海博生物技術有限公司)，28 ℃震蕩培養24 h，待菌體生長是指數生長期時，12 000 r·min-1離心5 min收集菌體，采用麥氏比濁法[11]將菌懸液稀釋為4個水平，依次為1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107CFU·mL-1。，每尾魚采用腹腔注射法進行感染，注射量均為0.2 mL，對照組注射等量生理鹽水，觀察7 d內魚的死亡情況并記錄，用Bliss法測定試驗魚7 d的半數致死劑量[12]。

1.4 革蘭氏染色及生理生化鑒定

在2216E培養基上取單個菌落置于載玻片上進行革蘭氏染色，光學顯微鏡下觀察細菌形態并拍攝記錄。依據說明書，使用API 20NE試劑盒（法國梅里埃生物中國有限公司）對生理生化鑒定, 依據《伯杰氏細菌學鑒定手冊》[13]選取標準菌進行比對。

1.5 16S rRNA擴增

用滅菌接種環挑取單菌落懸浮于100 μL無菌去離子水中,100 ℃水浴10 min, 12 000 r· min-1離心10 min, 取2 μL上清液進行PCR擴增。PCR反應體系：TaqDNA聚合酶25 μL、10 μmol·L-1的上下游引物各1.5 μL（表1）、滅菌雙蒸水20 μL、DNA模板2 μL。PCR反應程序∶95 ℃預變性3 min；98 ℃變性10 s，55 ℃復性15 s，72 ℃延伸10 s，30個循環；72 ℃溫育5 min。用1%瓊脂凝膠電泳對擴增產物進行檢測，將特異性條帶切膠回收后送至三博遠志公司測序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

16S rRNA及gyrB、ftsZ、gapA序列通過NCBI的Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)進行檢索，用 MEGA 7.0 軟件建樹后進行序列同源性分析。

1.6 病理組織切片

取病魚的皮膚、腸道、腎臟及脾臟等病變明顯的組織用4%多聚甲醛固定的組織器官進行修剪、脫水、透明、石蠟包埋、修蠟、切片等操作，切好的蠟片進行貼片并干燥后，進行HE染色，使用二甲苯封片[14]。對病理切片進行鏡檢分析。

1.7 藥敏試驗

采用瓊脂紙片擴散法（K-B）對病原菌進行藥敏試驗[12]。用瓊脂培養基對病菌進行復蘇后制成菌懸液，用無菌棉簽蘸取菌液涂布于BHI固體培養基，然后貼上藥敏紙片(購自溫州市康泰生物科技有限公司)，每個平板貼6片。24 ℃培養24 h，測量抑菌圈的直徑，根據說明書對藥敏試驗結果敏感性進行判定。

2 結果與分析

2.1 患病魚臨床癥狀表現

患病魚出現游動緩慢、離群、停止攝食、魚體消瘦、體色暗沉等現象；病魚身體四周出現輕微充血現象，病魚腹部輕微腫脹潰瘍，并伴隨鱗片脫落（圖1A、B），部分病魚腸道脫出肛門并伴隨大量腸道腹水（圖1C）；解剖后可見腸道空乏無食物并伴有大量腹水、腎臟、脾臟出現腫大充血現象（圖1D、E）；部分病魚出現肝臟暗紅出血癥狀（圖1F）。

圖1 患病半滑舌鰨臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of ill half smooth tongue sole

2.2 病原菌分離及人工感染結果分析

從病魚的脾臟和腎臟分離出2株優勢菌株，分別命名為8-0634、8-0635。細菌的培養結果顯示，這2株菌均在2216E培養基上生長，為白色不透明菌落；菌株8-0635在TCBS培養基上生長為黃色、不透明且邊緣完整的圓形菌落（圖2）；菌株8-0634在TCBS培養基上不生長。

圖2 菌株8-0635在TCBS上生長Fig.2 Growth of strain 8-0635 on TCBS media

對2株優勢菌分別進行人工感染試驗，發現只有菌株8-0635感染魚后能引起魚類死亡，感染8-0635的半滑舌鰨1周內的死亡情況如表2所示，其半數致死劑量LD50為3.7×105CFU·mL-1。這與之前的患病魚癥狀相似，因此對這株優勢菌進行鑒定。

表2 半滑舌鰨人工回歸感染結果Table 2 Results of artificial regression infection of Cynoglossus semilaevis

2.3 革蘭氏染色及生理生化鑒定結果

菌株8-0635在2216E上生長表現為白色不透明的圓形菌落，邊緣光滑。經革蘭氏染色后在鏡下觀察為短桿狀細菌，兩端鈍圓，菌體大小為1～4 μm（圖3）。

圖3 菌株8-0635革蘭氏染色Fig.3 Gram staining of strain 8-0635

對菌株8-0635分別進行了8.5‰和20.0‰NaCl下的生理生化試驗，結果（表3）顯示與哈維氏弧菌最為接近，依據《伯杰氏細菌學鑒定手冊》[13]選取了3株哈維氏弧菌的標準菌株與優勢菌株8-0635進行比對，結果顯示菌株8-0635雖然與標準菌株的生理生化結果近似，但仍有差異。

表3 菌株8-0635的主要生理生化指標檢測結果Table 3 Test results of main physiological and biochemical indexes of strain 8-0635

2.4 分子鑒定結果分析

對菌株8-0635進行了分子鑒定，測序結果與其他9株菌構建系統發育樹，發現菌株8-0635與8種菌株的序列同源性均較低（圖4），無法區分該菌株。在此基礎之上，將16S rRNA和3個保守基因（gyrB、ftsZ、gapA）的片段與原菌株基因序列構建系統發育樹進行比對，發現菌株8-0635與V.harveyi的同源性較高（圖5），故判斷菌株8-0635為哈維氏弧菌。

圖4 菌株8-0635的16S rRNA系統發育樹Fig.4 16S rRNA phylogenetic tree of strain 8-0635

圖5 菌株8-0635的多位點系統發育樹Fig.5 Multi-site phylogenetic tree of strain 8-0635

2.5 病理組織切片分析

依次取發病的半滑舌鰨的腎臟、脾臟、性腺及腸道切片觀察。腎臟組織的結構模糊,其細胞排列不整齊,與哈維氏弧菌感染癥狀一致[15]。腎小管上皮受損嚴重，表現為上皮脫落，細胞裂解死亡（圖6A）；脾臟出血嚴重，血管破裂，血細胞滲出（圖6B）；病魚的前中后腸均有嚴重病變，表現為腸黏膜受損脫落，充血嚴重，伴有血管破損，血液滲出（圖6C）。肌肉受損，表現為肌纖維斷裂（圖6D）。各組織中均有明顯炎細胞浸潤現象。

圖6 病理組織切片觀察Fig.6 Observation of pathological sections

2.6 藥敏試驗結果分析

通過對42種抗菌藥物藥敏試驗結果（表4）顯示，菌株8-0635對頭孢哌酮、氟苯尼考、氯霉素、氨芐西林等16種藥物高度敏感；對紅霉素、克拉霉素、替卡西林、恩諾沙星、卡那霉素等9種藥物中度敏感；對土霉素、四環素、萘啶酸、萬古霉素、鏈霉素等17種藥物不敏感。

表4 菌株8-0635的藥敏試驗結果Table 4 Drug sensitivity test results of strain 8-0635

3 討論

本研究生理生化鑒定結果與Schleifer[7]方法略有不同，很難確定病原菌種類。結合16S rRNA及系統發育樹對菌株8-0635進行了分析，發現菌株8-0635與NCBI上所選取的標準菌株同源性較低。由此可見，隨著弧菌的進化和發展，單純的16S rRNA與生理生化鑒定方法已經無法滿足弧菌的準確鑒定，本研究引入了管家基因[16]進行多位點測序（multilocus sequence analysis）。Wan等[17]通過16S rRNA和3種管家基因gyrB、ftsZ、gapA準確地鑒定出了哈維氏弧菌，因此通過保守的蛋白質編碼基因（16S rRNA、gyrB、ftsZ、gapA）能可靠地檢測和鑒定這些物種。經多位點測序的方法重新建立的系統發育樹顯示，菌株8-0635與哈維氏弧菌的同源性較高，故可鑒定菌株8-0635為哈維氏弧菌。

皮膚潰瘍病也被稱為皮膚潰爛病，是水產養殖動物的常見病，給水產養殖業造成了嚴重的經濟損失[18]。崔婧等[4]研究表明，哈維氏弧菌易感染紅鰭笛鯛、珍珠龍膽等，不僅可引起感染對象鱗片脫落、皮膚壞死、肌肉潰爛等嚴重病灶，而且還會引起病魚的肝臟、脾臟、頭腎等多種內臟器官充血、產生白斑等病變；張鳳萍等[19]研究表明，鮸魚感染哈維氏弧菌會表現出厭食、游動遲緩、尾柄和胸鰭基部呈出血性潰瘍。Liu等[20]研究表明，感染哈維氏弧菌的軍曹魚會出現腸胃炎等癥狀。與上述研究一致，本文患病魚體表現為體表皮膚潰爛出血、腹水、眼球突出，食欲不振等癥狀，最終停止攝食導致死亡，經鑒定從半滑舌鰨腎臟中分離出的哈維氏弧菌是主要的致病菌，人工感染試驗得出半數致死量LD50為3.7×105CFU·mL-1，與徐曉麗等[1]從半滑舌鰨所分離菌的半數致死量（LD50）為7.15×105CFU·mL-1相比較高，可能是不同菌株的毒力不同導致。對感染哈維氏弧菌的半滑舌鰨的肌肉、脾臟、腎臟和腸道的組織切片進行觀察，可見各組織間均有大量的炎細胞浸潤，肌肉表現為肌纖維斷裂，脾臟有血細胞滲出現象，腎臟病變嚴重表現為腎小管空腔消失，腎小管上皮受損，細胞裂解死亡；腸道表現為腸黏膜受損脫落，血管破裂，血細胞流入間質。

感染哈維氏弧菌的魚類疾病多爆發于每年的5—10月，易發生在養殖密度較高、水溫較高的魚類之間，多種不同生長時期的魚類都可發病[4]。研究表明，弧菌病多是通過肌肉受損感染[21]，但由于哈維氏弧菌的致病機制尚不清楚，還沒有有效的方法來控制其傳播[22]。目前哈維弧菌的防治方法主要有抗生素、中草藥、生物防治和免疫防治等[10]。此外，也可以利用微生物制劑、群感效應等手段對其進行防治[23]。隨著我國水產養殖業的不斷發展，弧菌病在水體中擴散加上我國水產養殖業給藥合理性的欠缺，抗生素的濫用導致了不同地區來源的哈維氏弧菌具有豐富的耐藥譜[24]。本研究中半滑舌鰨感染哈維氏弧菌的藥敏試驗顯示，其對頭孢噻吩、頭孢唑酮、阿莫西林、慶大霉素、氟苯尼考等藥物敏感，為該地區哈維氏弧菌的防治提供了參考。