小分子化合物I942在UVB照射誘導人黑素細胞樹突形成及黑色素合成的促進作用

石家綺 張麗萍 宋軍 孫鴻 宋丹丹

[摘要]目的：探究小分子化合物I942在UVB照射誘導人黑素細胞樹突形成及黑色素合成的促進作用。方法：使用濃度為0、3.125、6.25、12.5、25、50μmol/L的小分子化合物I942處理正常永生化人表皮黑素細胞系PIG1，采用CCK-8法檢測各組24、48、72 h時的細胞活力。將PIG1細胞分為對照組、UVB組、UVB+2.5μmol/L I942組、UVB+5μmol/L I942組、UVB+10μmol/L I942組，按照分組名稱進行相應處理。多巴染色觀察各組細胞形態，免疫熒光染色觀察黑素小體及骨架蛋白F-actin分布情況，氫氧化鈉裂解法測定黑色素含量，多巴氧化反應法測定酪氨酸酶活性。qRT-PCR、WB檢測樹突形態相關、黑色素合成相關mRNA與蛋白表達水平。結果：濃度為0、3.125、6.25、12.5、25、50μmol/L的小分子化合物I942對PIG1細胞活力無明顯影響（P＞0.05）。與對照組相比，UVB組、UVB+2.5 μmol/L I942組、UVB+5 μmol/L I942組、UVB+10μmol/L I942組細胞樹突數量、gp100、F-actin、黑色素含量、酪氨酸酶活性、MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Rac1 mRNA與蛋白水平均升高（P＜0.05），RhoA mRNA與蛋白水平降低（P＜0.05）。結論：小分子化合物I942結合UVB照射誘導能夠增加黑素細胞的樹突數量，提高細胞黑色素含量，提升酪氨酸酶活性，促進黑色素合成。

[關鍵詞]小分子化合物I942；黑素細胞；樹突；黑色素合成；白癜風

[中圖分類號]R758.41? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2023）06-0098-06

The Small Molecule Compound I942 Promotes the Formation of Dendrites and Melanin Synthesis in Human Melanocytes Induced by UVB Irradiation

SHI Jiaqi，ZHANG Liping，SONG Jun，SUN Hong，SONG Dandan

（Department of Dermatology，Affiliated Hospital of Jiangnan University，Wuxi 214062，Jiangsu，China）

Abstract： Objective? Explore the effect of small molecule compound I942 on the promotion of human melanocyte dendritic formation and melanin synthesis induced by UVB irradiation. Methods? Treatment of immortalized human epidermal melanocyte cell line PIG1 cells with the small molecule compound I942 at a concentration of 0， 3.125， 6.25， 12.5， 25， 50 μmol/L. CCK-8 method to detect cell viability of each group at 24， 48， 72 h. PIG1 cells are divided into control group， UVB group， UVB+2.5 μmol/L I942 group， UVB+5 μmol/L I942 group， UVB+10 μmol/L I942 group. According to the group name for corresponding processing. Dopa staining to observe the morphology of each group of cells. Immunofluorescence staining to observe the distribution of melanosomes and skeleton protein F-actin. Determination of melanin content by sodium hydroxide pyrolysis method. Determination of tyrosinase activity by DOPA oxidation reaction method. qRT-PCR， WB detection of dendritic morphology-related， melanin synthesis-related mRNA and protein expression levels. Results? The small molecule compound I942 at the concentration of 0， 3.125， 6.25， 12.5， 25， 50 μmol/L has no significant effect on the viability of PIG1 cells （P＞0.05）. Compared with the control group， the number of cell dendrites， gp100， F-actin， melanin content， tyrosinase activity， MITF， TYR， TRP-1， TRP-2， Rac1 mRNA and protein levels increased in UVB group， UVB+2.5 μmol/L I942 group， UVB+5 μmol/L I942 group， UVB+10 μmol/L I942 group （P＜0.05）， and RhoA mRNA and protein levels decreased （P＜0.05）. Conclusion? The small molecule compound I942 combined with UVB irradiation can increase the number of dendrites of melanocytes， increase the melanin content of cells， increase tyrosinase activity， and promote melanin synthesis.

Key words： small molecule compound I942; melanocyte; dendrites; melanogenesis; vitiligo

白癜風是一種較為常見的原發、局限或泛發性的慢性色素脫失性皮膚病，患部皮損呈乳白色，表面光滑無皮疹，白斑有清晰境界[1]。白癜風全球發病率為0.06%～2.28%，好發于暴露及經常磨損部位，全身皮膚皆可發生，發病人群廣，青壯年較多[2]。白癜風的具體發病機制目前尚未明晰，可能與遺傳、自身免疫、精神與神經化學、黑素細胞自毀等因素相關[3-4]。黑素細胞的主要功能為合成黑色素并傳遞給周圍的角質形成細胞，黑色素可停留在角質形成細胞的細胞核上，保護染色體免受紫外線輻射損傷[5]，因此在白癜風的治療中，促進皮膚黑色素合成是非常重要的。光照療法是治療白癜風的主要方法之一，中波紫外線（Ultraviolet radiation b，UVB）可誘導毛囊神經嵴干細胞分化為黑素細胞，促進黑素細胞增殖遷移，增加黑色素合成[6]。黑色素合成受多條信號通路如環磷酸腺苷/蛋白激酶A（Cyclic adenosine monophosphate/Protein kinase A，cAMP/PKA）、活性氧/絲裂原活化蛋白激酶（Reactive oxygen species/Mitogen-activated protein kinase，ROS/MAPK）等調節，其中cAMP激活的交換蛋白（Exchange protein activated by cAMP，EPAC）與cAMP、MAPK通路聯系緊密[7]。陳雅楠等[8]的研究表示EPAC可能與黑素細胞合成黑色素的過程相關。小分子化合物I942是EPAC激動劑，可提高EPAC分子活性，進而影響cAMP/EPAC通路[9]。本次研究將小分子化合物I942與UVB照射兩者結合，觀察其對正常永生化人表皮黑素細胞系PIG1（簡稱PIG1細胞）樹突形成及黑色素合成的影響，結果報道如下。

1? 材料和方法

1.1 細胞、試劑及儀器：PIG1細胞（貨號AC340321），購自上海澤葉生物科技有限公司；人黑素細胞生長添加劑（貨號S0025）、胎牛血清（貨號16140063）、254培養基（貨號M254500）、胰酶（貨號15400054）、DAPI溶液（貨號62248）、TRIzol試劑（貨號15596018）、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（貨號4368813）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，貨號D2345）、SuperSignal West Pico PLUS化學發光底物（貨號34580），購自美國Thermo Fisher公司；小分子化合物I942（貨號T24154），購自上海陶術生物科技有限公司；CCK-8試劑盒（貨號C0038）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號P0012），購自上海碧云天生物技術有限公司；FITC標記鬼筆環肽（貨號RM02836），購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒（貨號RR820A），購自大連寶生生物科技有限公司；氫氧化鈉（Sodium hydroxide，NaOH，貨號S5881）、Triton X-100（貨號X100）、多巴試劑（貨號D9503）、RIPA試劑（貨號R0278），購自美國Sigma公司；兔gp100抗體（貨號ab137078）、小鼠F-actin抗體（貨號ab205）、小鼠小眼畸形相關轉錄因子（microphthalmia-associatedtranscriptionfactor，MITF）抗體（貨號ab3201）、兔酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）抗體（貨號ab170905）、兔酪氨酸酶相關蛋白1（tyrosinase related protein 1，TYRP1）抗體（貨號ab235447）、兔酪氨酸酶相關蛋白2（tyrosinase related protein 2，TYRP2）抗體（貨號ab74073）、兔Rac1抗體（貨號ab155938）、兔RhoA抗體（貨號ab187027）及相應二抗購自美國Abcam公司。其他試劑均為市售分析純。DHP-9272電熱恒溫培養箱，購自上海和呈儀器制造有限公司；紫外線光療儀，購自上海希格瑪高技術有限公司；光學顯微鏡、熒光倒置顯微鏡，購自德國Leica公司；酶標分析儀，購自北京普朗新技術有限公司；ABI 7500實時熒光定量PCR儀，購自南京貝登電子商務有限公司；Mini-PROTEAN Tetra電泳槽，購自美國伯樂公司；eBlot? L1快速濕轉儀，購自南京金斯瑞生物科技有限公司；接觸式無損定量成像儀，購自上海易孛特光電技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養：使用人黑素細胞生長添加劑與5%胎牛血清的254培養基培養PIG1細胞，置于培養條件為37℃、5% CO2、飽和濕度的電熱恒溫培養箱進行培養。

1.2.2 CCK-8細胞增殖實驗：觀察PIG1細胞生長至對數期后用胰酶消化，調整細胞密度約為1×104/ml并接種于96孔板上培養過夜，每孔200μl。分別加入小分子化合物I942濃度為0、3.125、6.25、12.5、25、50μmol/L的254培養基繼續培養，于培養至20、44、68 h時向每孔內加入15μl CCK-8溶液。培養至24、48、72 h后用酶標儀在450 nm波長下測定各孔吸光度。

1.2.3 細胞分組與處理：PIG1細胞分為對照組、UVB組、UVB+2.5μmol/L I942組、UVB+5μmol/L I942組、UVB+10μmol/L I942組。對照組不進行處理，其余分組接受UVB燈照射，照射劑量=UVB輻照度（mJ）×時間（s），選定100 mJ/cm2作為本次實驗的照射劑量。照射前吸凈原細胞培養液并用1×PBS清洗1次，再加入1×PBS覆蓋細胞表面。照射完成后吸出1×PBS，按照分組加入對應濃度含小分子化合物I942的254培養基，置入培養箱繼續培養48 h。1×PBS洗滌細胞3遍，每組加入2 ml 1%多巴溶液，37℃恒溫孵育4 h，于光鏡下觀察各組細胞染色情況并拍照，使用Image J軟件分析圖像。

1.2.4 免疫熒光染色觀察各組細胞黑素小體及骨架蛋白F-actin分布情況：各組細胞生長至對數期后常規胰酶消化，調整細胞密度約為2×104/ml。6孔板中置入無菌蓋玻片，每片均勻滴加500μl細胞懸液，觀察到細胞貼壁后每孔加入2 ml 254培養基，繼續培養24 h。吸去6孔板中的培養基，用1×PBS清洗2遍，加入4%預冷丙酮，置于冰上固定10 min，1×PBS清洗2遍。加入1% BSA，室溫孵育30 min后，加入1% BSA稀釋的相應抗體，稀釋比例1：100，置于4℃過夜。1×PBS清洗2遍，加入1% BSA稀釋的熒光二抗，稀釋比例1︰100，置于37℃避光環境中反應2 h。1×PBS清洗2遍，用1×PBS配制濃度為5μg/ml的FITC標記鬼筆環肽工作液，滴加置蓋玻片表面，室溫避光孵育30 min。5μl/ml DAPI染核10 min，1×PBS清洗2遍后于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，使用Image J軟件分析圖像。

1.2.5 各組細胞黑素含量測定：各組細胞生長至對數期后常規胰酶消化，收集細胞沉淀，加入含10% DMSO的1 mol/L NaOH溶液500μl，充分重懸后置入37℃水浴1 h，用酶標儀在450 nm波長下測定各孔吸光度。黑色素相對含量（%）=（各UVB+I942處理組OD值-空白對照OD值）/（對照組OD值-空白對照OD值）×100%。

1.2.6各組細胞酪氨酸酶活性測定：各組細胞生長至對數期后常規胰酶消化，收集細胞沉淀，加入1% Triton X-100溶液450μl，充分重懸后于-80℃環境內放置30 min，取出后于室溫下裂解細胞。加入50μl 0.1%多巴溶液，37℃水浴2 h，用酶標儀在450 nm波長下測定各孔吸光度。酪氨酸酶相對活性（%）=（各UVB+I942處理組OD值-空白對照OD值）/（對照組OD值-空白對照OD值）×100%。

1.2.7 qRT-PCR檢測各組細胞樹突形態相關與黑色素合成相關蛋白mRNA表達水平：使用TRIzol試劑提取各組細胞總RNA，用反轉錄試劑盒轉錄成cDNA。由1μg cDNA模板、上下游引物各0.5μg和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒配制20μl PCR反應體系。反應條件：95℃預變性10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，循環40次。引物序列見表1。使用ABI 7 500實時熒光定量PCR儀完成RT-PCR操作，應用2-△△CT法計算各mRNA水平。

1.2.8 WB檢測各組細胞樹突形態相關與黑色素合成相關蛋白表達水平：各組細胞生長至對數期后常規胰酶消化，收集細胞沉淀，加入適量預冷RIPA充分裂解，4℃、10 000 rpm離心10 min，取上清液，BCA定量后制樣。凝膠電泳分離樣品蛋白，轉膜，截取目的條帶浸于5%脫脂奶粉制成的封閉液中，置于搖床上室溫封閉1 h。用封閉液稀釋一抗制成孵育液，稀釋比例為1︰500。目的條帶浸于孵育液中，充分搖勻后置于4℃環境下過夜。第2天取出膜，平衡至室溫后洗膜，加入稀釋比例為1︰5 000的對應二抗孵育液，室溫孵育2 h，洗膜后加入ECL化學發光液，避光反應5 min，用定量成像儀收集結果。

1.3 統計學分析：使用SPSS 22.0軟件對收集到的數據進行分析處理，計量資料用平均數±標準差（x?±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2? 結果

2.1 不同濃度小分子化合物I942對PIG1細胞活力的影響：各組PIG1細胞活力隨培養時間增加而提升，相同時間點不同濃度組間細胞活力差異無統計學意義（P＞0.05），且未出現明顯抑制情況，說明PIG1細胞可于小分子化合物I942 0～50μmol/L濃度范圍內正常增殖。見圖1。

2.2 各組細胞形態變化：對照組PIG1細胞形態正常，經多巴溶液染色后呈黑色。與對照組相比，UVB組、UVB+2.5μmol/L I942組、UVB+5μmol/L I942組、UVB+10 mol/L I942組細胞樹突數量增加，顏色加深。見圖2。

2.3 免疫熒光染色結果：經免疫熒光染色，PIG1細胞核呈藍色，骨架蛋白F-actin呈綠色，黑素瘤相關抗原gp100呈紅色。與對照組相比，UVB組、UVB+2.5μmol/L I942組、UVB+5μmol/L I942組、UVB+10μmol/L I942組F-actin與gp100表達量均上升。見圖3。

2.4 各組細胞黑色素含量測定結果：與對照組相比，UVB組、UVB+2.5μmol/L I942組、UVB+5μmol/L I942組、UVB+10μmol/L I942組黑色素含量上升，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

2.5 各組細胞酪氨酸酶活性測定結果：與對照組相比，UVB組、UVB+2.5μmol/L I942組、UVB+5μmol/L I942組、UVB+10μmol/L I942組酪氨酸酶活性上升，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖5。

2.6 各組細胞qRT-PCR檢測結果：與對照組相比，UVB組、UVB+2.5μmol/L I942組、UVB+5μmol/L I942組、UVB+10μmol/L I942組MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Rac1 mRNA水平升高，RhoA mRNA水平降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖6。

2.7 各組細胞WB檢測結果：與對照組相比，UVB組、UVB+2.5μmol/L I942組、UVB+5μmol/L I942組、UVB+10μmol/L I942組MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Rac1表達量升高，RhoA表達量降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖7。

3? 討論

黑色素合成于黑素細胞的黑素小體內，通過酪氨酸酶催化酪氨酸氧化合成[10]。MITF參與調控黑素細胞的生長、分化，是色素生成的主要調節蛋白，可直接作用于基因的轉錄調節，激活TYR、TRP-1、TRP-2[11]。黑色素由TYR催化形成，TRP-1、TRP-2參與黑色素合成，具有維持酪氨酸酶在黑素體膜上的穩定、阻止未成熟的黑素細胞死亡等重要作用[12]。在本次研究中，UVB組細胞黑素含量、酪氨酸酶活性、MITF、TYR、TRP-1、TRP-2 mRNA及蛋白水平均高于對照組。UVB照射能夠促進角質形成細胞釋放內皮素-1與堿性成纖維細胞生長因子，令黑素細胞增殖，還可使還原型黑色素氧化為黑色素，抑制皮膚樹突狀細胞和T淋巴細胞的免疫功能，保護黑素細胞[13-14]。黑素細胞分布于表皮基底層，通過樹突結構運輸其合成的黑素至鄰近的角質形成細胞[15]。樹突的數量、分叉情況、長短等變化均會對黑色素的運輸造成影響，而樹突結構的形成可受多種因素調節。多巴染色結果顯示，UVB組樹突數量較對照組更多，細胞顏色更深，gp100、P-actin、Rac1 mRNA與蛋白表達量更高，RhoA mRNA與蛋白表達量降低。Rac1和RhoA在黑素細胞骨架和樹突形成方面起重要作用。活化Rac1可以促進樹突的形成和延伸，而RhoA可通過其下游分子ROCK促進絲狀肌動蛋白聚合，形成應力纖維，增強細胞張力及黏附能力，誘導樹突退縮形成黏著斑[16-17]。UVB照射在刺激黑素細胞合成黑色素的同時還可促進骨架蛋白F-actin形成的應力纖維解聚，增加樹突的數量與長度，并且促進黑素小體向樹突末端轉運，提高運輸效率[18]。

小分子化合物I942是對EPAC1具有激動劑特性的非環核苷酸小分子。在本次研究中，濃度范圍0～50μmol/L的小分子化合物I942均未表現出對PIG1細胞活力的影響；經濃度為2.5、5、10μmol/L的小分子化合物I942處理的三組細胞黑色素含量、酪氨酸酶活性、gp100、P-actin、MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Rac1 mRNA及蛋白水平均較UVB組更高，RhoA mRNA與蛋白較UVB組更低，說明小分子化合物I942具有促進黑素細胞樹突形成、促進黑色素合成的能力。根據MITF、TYR、TRP-1、TRP-2 mRNA的水平變化推測小分子化合物I942通過調節MITF進而影響其下游的TYR、TRP-1、TRP-2，達到促進黑素細胞合成黑色素的效果。對比各項試驗數值發現，10μmol/L I942對PIG1細胞的黑色素含量、酪氨酸酶活性等各項指標影響效果低于2.5μmol/L I942和5μmol/L I942的影響效果，其原因可能是高于5μmol/L的小分子化合物I942對其相關信號通路產生了抑制作用，但其具體抑制濃度與作用機制還有待進一步實驗探究。

綜上所述，小分子化合物I942結合UVB照射誘導能夠增加黑素細胞的樹突數量，提高細胞黑色素含量，提升酪氨酸酶活性，促進黑色素合成，為白癜風等色素脫失性疾病的治療提供了新的理論依據。目前國內有關小分子化合物I942的研究較少，希望本次初步研究能夠引起更多學者的關注，由此角度進行更多更為深入的研究。

[參考文獻]

[1]鄒雪蓮，胡雯，康曉靜.角質形成細胞與白癜風發病機制的相關研究進展[J].中國美容醫學，2021，31（12）：178-181.

[2]Burlando M，Muracchioli A，Cozzani E，et al.Psoriasis，vitiligo，and biologic therapy：Case Report and narrative review[J].Case Rep Dermatol，2021，13（2）：372-378.

[3]Spritz R A，Santorico S A.The genetic basis of vitiligo[J].J Invest Dermatol，2021，141（2）：265-273.

[4]林士偉，魏茗蕾，孔靜.暈痣患者中白癜風發生狀況及其危險因素分析[J].中國美容醫學，2020，29（12）：40-43.

[5]Moreiras H，Seabra M C，Barral D C.Melanin transfer in the epidermis：The pursuit of skin pigmentation control mechanisms[J].Int J Mol Sci，2021，22（9）：4466-4476.

[6]Dong D，Chen S，Feng C，et al.NB-UVB induces melanocytic differentiation of human hair follicle neural crest stem cells[J].Ann Dermatol，2020，32（4）：289-297.

[7]Hu S，Huang J，Pei S，et al.Ganoderma lucidum polysaccharide inhibits UVB-induced melanogenesis by antagonizing cAMP/PKA and ROS/MAPK signaling pathways[J].J Cell Physiol，2019，234（5）：7330-7340.

[8]陳雅楠，吳建華.小分子化合物I942對黑素細胞黑素合成的促進作用[J].第二軍醫大學學報，2020，41（2）：161-166.

[9]Wiejak J，van Basten B，Luchowska-Stańska U，et al.The novel exchange protein activated by cyclic AMP1 （EPAC1） agonist，I942，regulates inflammatory gene expression in human umbilical vascular endothelial cells （HUVECs）[J].Biochim Biophys Acta Mol Cell Res，2019，1866（2）：264-276.

[10]D'Alba L，Shawkey M D.Melanosomes：Biogenesis，properties，and evolution of an ancient organelle[J].Physiol Rev，2019，99（1）：1-19.

[11]Qian W，Liu W，Zhu D，et al.Natural skin-whitening compounds for the treatment of melanogenesis （Review）[J].Exp Ther Med，2020，20（1）：173-185.

[12]Lee J W，Han S J，Kang H Y，et al.On-off switching of cell cycle and melanogenesis regulation of melanocytes by non-thermal atmospheric pressure plasma-activated medium[J].Sci Rep，2019，9（1）：13400-13409.

[13]Ouyang Y，Chen J，Jiang L，et al.UVB-induced ciRS-7 activates melanogenesis by paracrine effects[J].DNA Cell Biol，2021，40（3）：523-531.

[14]Tse B C Y，Byrne S N.Lipids in ultraviolet radiation-induced immune modulation[J].Photochem Photobiol Sci，2020，19（7）：870-878.

[15]Lambert M W，Maddukuri S，Karanfilian K M，et al.The physiology of melanin deposition in health and disease[J].Clin Dermatol，2019，37（5）：402-417.

[16]Choi S G，Kim J H，Hong S H，et al.Exogenous pyruvate alleviates UV-induced hyperpigmentation via restraining dendrite outgrowth and Rac1 GTPase activity[J].J Dermatol Sci，2021，101（2）：101-106.

[17]Qi Y，Liang X，Dai F，et al.RhoA/ROCK pathway activation is regulated by AT1 receptor and participates in smooth muscle migration and dedifferentiation via promoting actin cytoskeleton polymerization[J].Int J Mol Sci，2020，21（15）：5398-5412.

[18]Seo S H，Kim S E，Lee S E.ER stress induced by ER calcium depletion and UVB irradiation regulates tight junction barrier integrity in human keratinocytes[J].J Dermatol Sci，2020，98（1）：41-49.

[收稿日期]2022-01-24

本文引用格式：石家綺，張麗萍，宋軍，等.小分子化合物I942在UVB照射誘導人黑色素細胞樹突形成及黑色素合成的促進作用[J].中國美容醫學，2023，32（6）：98-103.