肝癌細胞DNA損傷時三結(jié)構(gòu)域蛋白28磷酸化對肝癌細胞生存能力的影響

戴慶福 王玉霞 曹慧敏

（福建醫(yī)科大學附屬龍巖第一醫(yī)院檢驗科，福建 龍巖 364000）

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，病死率極高。有研究表明，全球每年至少有610 000死亡病例，而其中約半數(shù)病例發(fā)生在中國[1]。因此，研究肝癌發(fā)生、發(fā)展和藥物作用過程中的分子機制以進一步認識此類腫瘤，發(fā)展針對肝癌的早期診斷技術(shù)以有效提高患者生存率具有十分重要的現(xiàn)實意義[2]。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多種生物活性分子共同作用的結(jié)果。這些重要的活性分子既包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子，又包括各種金屬離子、自由基、激素等各種小分子。在肝癌發(fā)生、發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移過程中，細胞內(nèi)這些物質(zhì)或者相互轉(zhuǎn)化，或者相互影響、協(xié)同作用，共同參與細胞內(nèi)各種化學反應和信號通路[3]。另外，當存在某些外界刺激或藥物作用時，多種分子參與的信號通路會被抑制甚至阻斷，或者產(chǎn)生新的信號通路，進而導致腫瘤細胞功能損傷乃至凋亡[4]。在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后中，三結(jié)構(gòu)域蛋白28（Trim28）磷酸化發(fā)揮著極為重要的作用[5]。有研究表明[6]，細胞異染色質(zhì)DNA損傷修復和Trim28磷酸化相關，這一特性會將一些腫瘤對化療的敏感性降低。本研究探討了Trim28磷酸化在肝癌細胞DNA損傷時對肝癌細胞生存能力的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 購買美國Biolegend公司生產(chǎn)的鼠β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體、鼠Trim 28單克隆抗體以及鼠Trim 28 phosphorylase S473單克隆抗體，美國Arigobio公司生產(chǎn)的辣根過氧化物酶（HRP）羊抗鼠多克隆IgG，上海Absin公司生產(chǎn)的SB203580，廣州安邦生物公司生產(chǎn)的其他主要試劑及材料，美國Spectrolinker公司生產(chǎn)的紫外交聯(lián)儀×11000，美國Biotek公司生產(chǎn)的酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 依據(jù)處理措施分為對照組、sb203580組、UV組、sb203580+UV組4組。購買武漢普諾賽公司生產(chǎn)的人肝癌Hepg2細胞，細胞使用德國賽默飛公司生產(chǎn)的0.5%雙抗+10%胎牛血清+RPMI1640培養(yǎng)基配置成的培養(yǎng)液，置于二氧化碳溫箱中進行培養(yǎng)（條件：37 ℃、5%），細胞密度達90%時消化道離心傳代，消化過程中將0.25%胰酶充分利用起來。

1.2.2 Western blot試驗

1.2.2.1 分組 將4組細胞隨機設置出來，在6 cm2培養(yǎng)皿中使各組細胞生長融合達90%以上，將3組細胞隨機選取出來，在100 μJ/cm2紫外線下放置照射，照射后2 h、12 h、24 h分別將細胞蛋白提取出來。另將對照組設置出來，僅將細胞蛋白提取出來，并不做任何處理。

1.2.2.2 處理 在6 cm2培養(yǎng)皿中sb203580+UV組Hepg2細胞生長融合達90%以上時，將含10 μmol/L sb203580培養(yǎng)液加入試驗組細胞中，在37 ℃的溫度下孵育1 h，然后和UV組細胞在100 μJ/cm2紫外線下同時放置照射，將10 μmol/L sb203580培養(yǎng)液加入sb203580+UV組細胞，將正常培養(yǎng)液加入UV組細胞，在37 ℃的溫度下繼續(xù)孵育2 h后將蛋白提取出來。另將對照組細胞設置出來，不做任何處理，相同孵育時間后將蛋白提取出來。

1.2.2.3 蛋白提取 對細胞滴注RIPA裂解液進行裂解，用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度；同時采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）儀進行分離、轉(zhuǎn)膜，并于室溫下用5%的牛血清白蛋白（BSA）封閉1 h，之后在4 ℃溫度下孵育1∶500鼠β-actin單克隆抗體、1∶500鼠Trim 28 phosphorylase S473單克隆抗體、1∶1 000鼠Trim 28單克隆抗體過夜。常規(guī)洗膜后加入RP標記的羊抗鼠免疫球蛋白二抗（1∶5 000稀釋），室溫下孵育2 h。用增強型化學發(fā)光試劑（ECL）試劑盒對蛋白顯色。

1.2.2.4 圖像分析 采用Image J軟件進行蛋白表達量的半定量檢測分析，用灰度值表示，并計算目的蛋白的相對表達水平，即目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值，重復3次。

1.2.3 MTT試驗

1.2.3.1 細胞培養(yǎng) 種板6 cm2培養(yǎng)皿中細胞生長融合達90%時常規(guī)消化，離心3 min，半徑、速率分別為16 cm、1 000 r/min，計數(shù)細胞。依據(jù)計數(shù)結(jié)果，在96孔板上接種懸液，每孔200 μL，細胞數(shù)為4 000個左右。

1.2.3.2 細胞處理 細胞貼壁后1 d處理細胞，組別的劃分與Western blot試驗相同，依據(jù)處理措施分為對照組、sb203580組、UV組、sb203580+UV組4組，每組6孔，分別不做處理、將含10 μmol/L sb203580培養(yǎng)液加入、10 μJ/cm2紫外線照射處理、將含10 μmol/L sb203580培養(yǎng)液加入并10 μJ/cm2紫外線照射處理。

1.2.3.3 細胞生存率 處理后1 d、2 d、3 d分別將MTT加入到各組細胞中，孵育4 h后將二甲基亞砜（DMSO）加入，每孔100 μL。采用酶標儀對各孔570 nm波長處吸光度（A）值進行測定。比較對照組和sb203580組同時間點的A值，細胞生存率=UA組和sb203580+UV組與對照組A值比值。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料（符合正態(tài)分布）用（）來描述，組間行t檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 紫外線照射Hepg2細胞后不同時間點p-Trim28表達比較 UV組紫外線照射Hepg2細胞后2 h、12 h、24 h的p-Trim28表達逐漸降低（P＜0.05），照射后2 h、12 h的p-Trim28表達量均高于對照組（P＜0.05），但照射后24 h的p-Trim28表達量和對照組之間的差異不顯著（P＞0.05）。見表1。

表1 紫外線照射Hepg2細胞后不同時間點p-Trim28表達比較（）

表1 紫外線照射Hepg2細胞后不同時間點p-Trim28表達比較（）

2.2 不同處理條件下Trim28表達比較 對照組、UV組和sb203580+UV組Trim28表達量之間的差異均不顯著（P＞0.05）。見表2。

表2 不同處理條件下Trim28表達比較（）

表2 不同處理條件下Trim28表達比較（）

2.3 不同處理條件下p-Trim28（ser473）表達比較 UV組p-Trim28（ser473）表達量高于sb203580+UV組、對照組（P＜0.05），但sb203580+UV組、對照組p-Trim28（ser473）表達量之間的差異不顯著（P＞0.05）。見表3。

表3 不同處理條件下p-Trim28（ser473）表達比較（）

表3 不同處理條件下p-Trim28（ser473）表達比較（）

2.4 Trim28（ser473）磷酸化在Hepg2細胞DNA損傷時對細胞生存能力的影響分析 sb203580組、對照組處理后1 d、2 d、3 d的A值均逐漸升高（P＜0.05）；處理后1 d、2 d、3 d，sb203580組、對照組A值之間的差異均不顯著（P＞0.05）。sb203580+UV組、UV組照射后1 d、2 d、3 d的細胞存活率均逐漸降低（P＜0.05）；照射后1 d、2 d、3 d，sb203580+UV組細胞存活率均低于UV組（P＜0.05）。見表4、表5。

表4 sb203580對細胞生存能力的影響分析（）

表4 sb203580對細胞生存能力的影響分析（）

表5 sb203580抑制Trim28（ser473）磷酸化在Hepg2細胞DNA損傷時對細胞存活率的影響分析（）

表5 sb203580抑制Trim28（ser473）磷酸化在Hepg2細胞DNA損傷時對細胞存活率的影響分析（）

3 討 論

目前，細胞內(nèi)活性分子的檢測很多是基于細胞勻漿，這種檢測不能得到分子在細胞內(nèi)的空間信息，而且在進行多組測定時無法針對同一個樣品或者同一個細胞，因此同一生物過程中多種分子之間精準的關聯(lián)會被群體細胞的平均信息所掩蓋?；罴毎麩晒獬上窦夹g(shù)為觀察及認識細胞內(nèi)多種活性分子參與的生物過程提供了重要工具。它可以實時原位的觀察細胞內(nèi)某一分子的含量、分布及其隨時間的變化。如果對細胞內(nèi)多種生物分子實現(xiàn)同時熒光標記和成像，不僅能對細胞異質(zhì)性有所認識，更重要的是可以在同一細胞內(nèi)對多種分子的相互作用進行研究，進而獲取群體細胞研究所掩蓋的真實精準的多分子間關聯(lián)信息[7]。針對細胞內(nèi)多種生物分子熒光標記，研究人員已設計開發(fā)了多種多樣的熒光探針，如基于靶標識別產(chǎn)生熒光信號變化的有機小分子探針已被廣泛用于細胞內(nèi)活性氧簇、金屬離子、巰基化合物、NO和H2S等氣體分子的熒光成像；基于基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的多色熒光蛋白被用于細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的標記和成像研究，該技術(shù)也因其對化學、生物學和醫(yī)學研究的卓越貢獻而獲得了2008年的諾貝爾化學獎；此外，基于納米材料和多種組裝技術(shù)的納米熒光探針因為其優(yōu)異的發(fā)光性能和靈活多樣的組裝形式也被廣泛應用于細胞內(nèi)分子的標記和熒光檢測。這些探針通過與靶標分子的特異性作用，不斷點亮細胞內(nèi)的各種分子，使研究者看見了大量分子在細胞內(nèi)的含量和時空變化，并且不斷認識了它們的生物功能[8]。然而，不管是對肝癌細胞內(nèi)信號通路研究還是對其進行早期診斷，所涉及的多種生物分子濃度差異很大，當研究者用這些探針直接標記含量較低的分子時，發(fā)現(xiàn)所得到的熒光信號往往很弱或者難以與背景區(qū)分。當某種條件下這些分子濃度產(chǎn)生下調(diào)時，就更加難以獲取它們的熒光信號[9]。因此，發(fā)展基于信號放大的肝癌細胞內(nèi)多種活性分子同時高靈敏熒光成像方法具有十分重要的意義。

以DNA與目標分子的特異性相互作用構(gòu)建生物分子的檢測方法已得到國內(nèi)外研究人員的廣泛關注和研究。此類方法可通過DNA堿基互補反應、序列切割及構(gòu)型變換等實現(xiàn)多種類型生物分子的特異性識別[10]。如通過堿基互補原則設計可得到針對DNA、mRNA及miRNA的靶向探針，通過體外篩選技術(shù)（SELEX技術(shù)）可分別得到與不同蛋白質(zhì)、肽、激素等分子特異性結(jié)合的核酸適配體Aptamer或?qū)饘匐x子特異性識別的DNAzyme；利用細胞內(nèi)某些離子可引發(fā)特定DNA產(chǎn)生構(gòu)型變化。以此為基礎，通過對DNA探針的進一步改造，使其除了能對目標分子實現(xiàn)靶向識別外，還能夠參與后續(xù)各種DNA擴增反應如滾環(huán)擴增（RCA），雜交鏈式反應（HCR）等。這些反應可以使目標分子信號產(chǎn)生線性或者指數(shù)放大，提高檢測的靈敏度。由此可以看出，DNA探針和以此為基礎的各種DNA擴增反應用于細胞內(nèi)多種類型生物分子的特異性識別、信號放大具有很大的優(yōu)勢和潛力[11]。但是目前此類信號擴增的檢測方法大多是基于細胞勻漿的檢測，而在活細胞水平上進行生物分子成像的研究則報道較少。這主要是因為鏈狀結(jié)構(gòu)的DNA難以直接被細胞攝取，而且一些DNA的擴增反應涉及很多酶類分子，這些大分子也很難以直接進入細胞，造成細胞對探針的有效攝取困難；另外，即使探針能夠借助某些方法進入細胞，探針的細胞穿膜過程及定位，探針在細胞內(nèi)穩(wěn)定性和傳感過程是否對細胞功能造成損傷等問題仍需詳細探究；當對細胞內(nèi)多組分進行成像時，多個熒光信號光譜分辨問題及其輸出時間、強度差異性問題也是目前面臨的重大挑戰(zhàn)[12]。因此，針對以上問題和挑戰(zhàn)，構(gòu)建新型的基于DNA擴增反應的細胞內(nèi)生物分子信號放大和多組分同時熒光成像新方法，在活細胞水平上監(jiān)控肝癌細胞內(nèi)多種生物分子尤其是低濃度生物分子的濃度、時空變化和相互關聯(lián)信息，對進一步研究此類疾病發(fā)生、發(fā)展的信號通路，藥物治療相關的分子機制以及進行精準的早期診療具有重要的應用價值。

有文獻顯示，Trim28的過度表達與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關[13]。目前，臨床還沒有完全弄清楚其機制[14]。Trim28是一種促癌因子，其異染色質(zhì)蛋白（HP1）結(jié)合域正常情況下可結(jié)合異染色質(zhì)，并形成異染色體固縮狀態(tài)，有利于保持基因組及轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性，在細胞DNA雙鏈損傷時，ser473（在HP1結(jié)合域分布）磷酸化會在激酶及ATM/Chkl/Chk2、p38/絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/MK2等因子作用下松解異染色質(zhì)，暴露受損的DNA雙鏈，ATM對TopBP1、BRCA1等DNA修復蛋白進行招募，修復DNA損傷，如在黑素瘤中MAGE C2和Trim28蛋白復合物形成，引發(fā)Trim28磷酸化，進而對凋亡的腫瘤細胞進行修復，從而為腫瘤發(fā)展提供有利條件[15]。本研究結(jié)果表明，UV組紫外線照射Hepg2細胞后2 h、12 h、24 h的p-Trim28表達逐漸降低，照射后2 h、12 h的p-Trim28表達量均高于對照組。UV組p-Trim28（ser473）表達量高于sb203580+UV組、對照組。sb203580組、對照組處理后1 d、2 d、3 d的A值均逐漸升高。sb203580+UV組、UV組照射后1 d、2 d、3 d的細胞存活率均逐漸降低；照射后1 d、2 d、3 d，sb203580+UV組細胞存活率均低于UV組，說明在肝癌細胞DNA損傷修復過程中，Trim28磷酸化可能參與其中，從而降低肝癌細胞對DNA損傷的敏感性。證實Trim28（set473）磷酸化在肝癌細胞Hep92細胞DNA損傷的情況下可能在DNA損傷修復中介入，對其進行抑制能夠?qū)⒓毎纳媛蔬M一步降低。

綜上所述，對Trim28磷酸化進行抑制，在肝癌細胞DNA損傷時可降低肝癌細胞的生存能力，值得重視。